PPT analisa pangan VITAMIN A D E K DAN B

1. ANALISA PANGAN
VITAMIN

2. Ilmu Teknologi Pangan 3-D
VITAMIN
Silvi Febri B.
152
Fachry
Perdana P.
158
Iin
Malisa
161
Ma’aisya
Istiqomah
132
Retia Risky A.
138
Rahmawati
Tokan
145

3. Vitamin adalah senyawa organic kompleks yang essensial untuk
pertumbuhan dan fungsi biologis yang lain bagi makhluk hidup. Berbagai
fungsi biokimia dan yang umumnya tidak disintetis oleh tubuh sehingga
harus dipasok dari makanan. Vitamin juga berperan dalam berbagai
macam fungsi tubuh lainnya, termasuk regenerasi
kulit,penglihatan,sistem susunan syaraf dan sistem kekebalan tubuh.
VITAMIN
VITAMIN LARUT
DALAM LEMAK
VITAMIN LARUT
DALAM AIR

4. Vitamin Larut di dalam Lemak
Vitamin-vitamin yang larut dalam lemak
ini memerlukan absorbsi lemak yang
normal agar vitamin tersebut dapat
diabsorbi secara efisien. Yang
merupakan vitamin larut di dalam
lemak adalah A,D,E, dan K.

5. Vitamin
Larut Lemak Larut Air
Vitamin A Vitamin D Vitamin E Vitamin K Vitamin C Vitamin B
Spektofotometri
Kolorimetri
Kromatografi
(KCKT)
Pemasan dengan
H₂O₂
KCKT
Antimoni
Triklorida
Pereaksi Gliserol
Diklorohidrin
Metode
Selimteri
Kolorimetri
Kromatografi
(KCKT)
Kromatografi
(KCKT) Iodimetri
DCIP
Kolorimetri
Spektofotometri
Spektofluometri
Thiamin (B1)
Riboflavin (B2)
Piridoksin (B6)
Biotin (B7)
Asam Folat
(B9)
Kobolamin
(B12)
Spektrofotometri

6. Vitamin A
• Vitamin A merupakan istilah generik untuk
semua senyawa dari sumber hewani selain
karotenoid yang memperlihatkan aktivitas
biologik vitamin A
• Senyawa-senyawa aktif vitamin A
direpresentasikan dengan retinoid (ditandai
dengan vitamin A) dan zat awal
karetenoidnya (Karetenoid Provitamin A)
• Sumber yang mengandung vitamin A : susu,
ikan, wortel, pisang, dan lain-lain

7. • Absorbansi maximum vitamin A adalah
pada 325-328 nm
• Vitamin A : larut dalam solven organik
dan dlm lemak, tidak larut dalam air
• Hasil reaksi vitamin A dengan
antimoni-khlorida (SbCl3) memiliki
absorbansi maximum pada 620 nm
• Preparat vitamin A berupa kristal
kuning pucat dengan titik lebur 63-
64oC

8. Struktur Vitamin A
Struktur vitamin A alkohol (retinol) & -karoten
(cincin 6-C merupakan komponen kritis untuk aktivitas vitamin A)

9. Spektofoto
metri
Kolorimetri
Kromatografi
Analisis Vitamin A
pengujian vitamin A dalam
bahan pangan terdiri dari 3
tahap yaitu: tahap sponifikasi,
tahap ekstraksi, tahap
pemekatan atau penguapan
pelarut organik dan tahap
pengukuran menggunakan
instrumen,
Metode penetapan kadar
vitamin A ada 3 yaitu

10. SPEKTOFOTMETRI
Spektrum absorbsi ultraviolet vitamin A dan vitamin A
asetat mempunyai absorbansi maksimal pada panjang
gelombang antara 325 sampai 328 nm dalam berbagai
pelarut.
Akseroftol (Vit A)
Dalam bentuk
ester
Dalam bentuk lain

11. Jika larutan vitamin A menyerap lurus pada daerah
panjang gelombang antara 325-328 nm, maka koreksi
geometri dapat digunakan. Koreksi ini digunakan
untuk mengoreksi senyawa pengganggu yang
mempunyai absorbansi tetap, akan tetapi kesalahan
yang besar akan terjadi apabila formula koreksi ini
digunakan terhadap pengganggu yang tidak lurus

12. KOLORIMETRI
Metode Carr-Price
Metode ini berdasarkan atas reaksi akseroftol dengan antimon
triklorida anhidrat dalam kloroform yang menghasilkan warna
biru. Reaksi ini terjadi anatara antimony triklorid dengan rantai
tak jenuh dari akseroftol. Pembacaan biasanya dilakukan dalam
waktu 10 sampai 15 detik setelah sampel ditambah pereaksi

13. • Metode ini didasarkan pada pembentukan kompleks warna biru
antara antimoni triklorid atau asam trifluoroasetat dengan retinol
dalam kloroform, yang dapat diukur absorbansinya di panjang
gelombang 620 nm
• Minyak hati ikan cod memberikan waran biru-ungu dengan agensia
dehidrator semisal asam sulfat
• AOAC metode 974.29 memperbolehkan dingunakannya asam
trifluoroasetat sebagai ganti antimoni triklorida. Asam trifluoroasetat
mudah digunakan,kurang korosif, serta mampu memberikan warna
yang lebih stabil di badingkan antimoni triklorida

14. prosedur analisa
Untuk sampel dengan kadar vitamin A rendah  dilakukan
saponifikasi sbb.:
- 10 + 0,1 g sampel ditambah 75ml alkohol 95% dan 25
ml KOH 50% dan dididihkan dengan memakai pendingin
balik
- Campuran dipindah ke labu pemisah dan dilakukan ekstraksi
dengan ditambah dietil eter
- Ekstrak eter dicuci dengan H2O, kemudian ditambah Na-sulfat
anhidrat (untuk membebaskan air)
- Eter diuapkan dengan penangas air, kemudian gas N2  diperoleh
ekstrak kering
- Ekstrak kering dilarutkan dalam khloroform

15. • Untuk sampel yang kaya vitamin A : dilarut-kan sampel
dalam khloroform (konsentrasi akhir = 20% w/v)
• 4ml reagen Carr-Price ditambah 1ml khloroform (sebagai blanko)
• 0,5ml larutan sampel dalam khloroform ditambah 2ml
reagen Carr-Price, dicampur merata
• Absorbansi campuran ditera pada 620 nm
• Dibuat kurva standar (kisaran konsentrasi vitamin A = 0
– 15 IU/ml)

16. Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
• Untuk pengujian rutin aktivitas vitamin A dan untuk karakterisasi
retinoid dan karotenoid dalam sampel, maka kromatografi cair
merupakan pilihan utama untuk analisis
• Keuntungan nyata kromatografi cair dibandingkan dengan teknik
yang lain adalah kemampuannya untuk memisahkan isomer cis- dan
trans dari all-trans retional dan all-trans-karotenoid, mampu
memisahkan karotenoid provitamin A dari campuran karotenoid
kompleks
• Metode-metode selain kromatografi cair seperti metode spektroskopi
atau kolometri akan menghasilkan aktivitas vitamin A yang berlebih.

17. Prinsip:
Vitamin A akan terekstrak ke dalam larutan organik. Semua transretinol dan 13 cisretinol
diukur dengan HPLC dengan kolom silika. HPLC adalah metode yang akurat digunakan dalam
pengukuran vitamin A
Metode Kromatografi (HPLC)
 Preparasi Sampel
• Dimasukkan sebanyak 40 mL sampel kedalam tabung digesti 100 mL ,
• Ditambahkan 10 mL etanolik pirogallol, dan
• Disabunkan dengan etanolik KOH pada suhu ruang 18 jam
 Ekstraksi
• Pipet 3mL sampel yang telah terdigesti ke dalam tabung sentrifus 15 mL dan
ditambahkan 2 mL air
• Ekstrak dengan 7 mL heksan-dietileter(85:15)
• Ulangi ekstraksi sebanyak 2 kali
• Masukkan sampel terekstrak ke dalam tabung volumetrk 25 mL dengan heksan.
• Tambahkan sebanyak 1 mL heksadekan +hexan dan diencerkan ke dalam tabung dan
sentrifus dan uapkan dengan nitrogen. Larutkan residu dalam 0,5 mL heptan

18. Parameter kromatografi
• Kolom: 15 cm x 4.5 mm dipadati dengan 3 mm silika
(Apex µm silika)
• Fasa mobil: isokratik, heptane dan isopropanol (1-
5%)
• Deteksi: UV 340 nm
• Flow rate:1-2 ml/menit

19. Vitamin D
• Disebut juga dengan vitamin anti
rakhitis
• Vit. D adalah senyawa yang stabil
sehingga tidak rusak oleh pemasakan
makanan, penyimpanan atau
penanganan pasca panen
• Sumber yang mengandung vitamin D :
minyak ikan, keju, telur, dan lain-lain

20. • Vitamin D dapat larut dalam minyak &
lemak, alkohol, dan propilen-glikol
• Vitamin D dapat dipengaruhi oleh
cahaya serta bersifat thermolabil
• Vitamin D memiliki spektrum serapan
kharakteristik maximum pada 265
nm
• Metoda utama analisis kadar vitamin
D adalah secara bioassay

21. Struktur Vitamin D

22. Analisis Vitamin D
1. Uji Vitamin D dengan Pemanasan
menggunakan Hidrogen Peroksida
Prinsip: Umumnya vitamin D stabil
terhadap pemanasan, asam dan oksigen.
Vitamin D secara lambat didestruksi
bila lingkungannya alkalis, terutama bila
terdapat udara dan cahaya. Pemanasan
dengan hidrogen peroksida tidak
merusak vitamin D tetapi vitamin A
akan rusak.

23. Prosedur Uji Identifikasi Vitamin D

24. Analisa vitamin D dengan
antimoni triklorida
• Vit D2 + D3 dengan antimoni-
trikhlorida dlm khloroform akan
berwarna orange-kuning yang
segera mencapai intensitas serapan
maximum pada 500 nm
• Tachysterol memiliki sifat serupa,
namun sterol lain serta vit. A tidak
memiliki sifat seperti itu .

25. Prosedur Analisa
• Dimasukkan 2 ml larutan yang diuji
dalam tabung spektrometer dan
ditambah 4 ml larutan jenuh Antimoni-
trikhlorida dalam khloroform bebas air
• Ditunggu 10-15 menit dan serapannya
dibaca pada 500 nm
• Kadar vitamin D dapat dihitung dengan
persamaan kurva standar .

26. Analisa vitamin D dengan
pereaksi gliserol dikhlorohidrin
• Vitamin D2 + D3 bereaksi dengan
gliserol dikhlorohidrin, dengan adanya
asetil-khlorida atau halida-asam
lainnya
• Vitamin D2 dengan cepat membentuk
warna kuning, yang kemudian berubah
hijau dlm 1 menit dan mencapai
maximum dalam 15 menit, serta akan
stabil selama beberapa jam dengan
serapan maximum pada 625 nm

27. • Dengan ergosterol segera muncul warna pink
pucat yang berubah menjadi orange/ jingga
dalam 15-20 menit dan kemudian menjadi hijau-
fluoresen
• Dengan 7-dehidrokholesterol tidak nampak warna
pd beberapa menit pertama kmd muncul warna
pink pucat yang akan makin intensif dalam 24 jam
• Dengan kholesterol tidak muncul warna
• Reaksi tersebut dapat membedakan antara vitamin
D2 dari ergosterol dan 7-dehidro-kholesterol; dan
juga membedakan antara ergosterol dengan 7-
dehidrokholesterol
•

28. KCKT
Jenis sampel: Vitamin D3 dalam jus jeruk
Penyiapan sampel: sampel diekstraksi dengan etil
eter-petroleum eter. Sampel ditambah dengan
standart internal vitamin D2, ditambah vitamin C
sebagai antoksidan dan diekstraksi
Kolom: kolom fase normal Inertsil
Fase gerak: Asetonitril-metanol (40:60) selama 20
menit
Detektor: UV-DAD 262 nm

29. Spektrofotometri
• Vitamin D2 dan D3 menunjukkan spectra
serapan uv yang identik, dengan
panjang gelombang maksimal 265 nm.
• Nilai ε dalam metanol atau heksan
adalah 18000 M-1cm-1
• Kisaran batas deteksi yang dilaporkan
dalam kolom adalah antara 1-10 ng

30. Vitamin E
• Disebut juga vitamin antisterilitas
• Sumber yang mengandung vitamin E :
ikan, ayam, kecambah, ragi, dan
sebagainya
• Kelompok vitamin E terdiri dari -, -, -
, dan -tokoferol dan beberapa esternya,
semisal ester asetat dan allofanat

31. Struktur Vitamin E

32. Kromatografi
(KCKT) Selimetri
Analisis Viatmin E
Kolorimeteri

33. Kromatografi KCKT
Prinsip :
• Untuk produk makanan umum: sampel disaponifikasi
dengan reflux,diestrak dengan heksan dan diinjeksi
kedalam fase normal kolom HPLC yang
disambungkan pada detektor fluoresesnsi
• Untuk margarin dan minyak nabati : sampel dilarutkan
dalam heksan, MgSO4 ditambahkan untuk mengganti
air keudia difilter dan diuji dengan HPLC
• Untuk minyak : dilarutkan dalam heksan dan diinjeksi
secara langsung ke dalam kolom HPLC

34. Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
(HPLC)
 Untuk produk makanan umum
1. Tambahkan 10 mL pirogallol 6% kesampel, campurkan dan aliri
dengan N2
2. Panaskan pada suhu 70°C .
3. Sonikasi selama 5 menit, didinginkan pada suhu ruang dan
tambahkan NaCl dan air
4. Ekstrak dengna heksana sebanyak 3 kali
5. Tambahkan 0,5 g MgSO4 dan homogenkan
6. Saringlh dan encerkan sampai volume dengan heksan dan injeksi
20µl
 Margarin dan minyak nabati
1. Tambahkan 40 mL heksan kedalam 10 g sampel dan homogenkan
2. Tambahkan 3 g MgSO4 dan campur, biarkan 2 jam .
3. Saring dan encerkan sampai volume dengan heksan dan injeksi
20µl

35. Metode Serimetri
Metode ini berdasarkan atas sifat mereduksi tokoferol
setelah tokoferol asetat dihidrolisis dengan asam.
Tokoferol tidak stabil dalam larutan basa

36. Metode Kolorimetri
Dalam AOAC (1995), penetapan kadar vitamin E dalam
makanan baik dalam bentuk kering mauun basah
dilakukan secara kolorimetri. Alfa0tokoferol diekstraksi
dari sampel dengan pelarut organik. Residu lemak
disabunkan, alfa-tokoferol diisolasi dengan
kromatografi lapis tipis, dan ditetapkan kadarnya secara
kolometri

37. Vitamin K
 Vitamin k digolongkan sebagai senyawa kimia : quinone
 Sumber yang mengandung vitamin K : susu, kuning telur,
sayuran segar
• Untuk analisis vitamin K dalam susu formula, prosedur
Rose-Gottlieb telah dimodifikasi dengan mengganti
perlakuan amonia/etanol dengan etanol yang diasamkan.
• Vitamin K dari sayuran,buah-buahan,serelia,daging dan
ikan telah diekstraksi dengan menggerus samel dalam
mortar hingga diperoleh granul halus sebelum di ekstraksi
dengan aseton. Setelah penambahan air dan heksan ke
ekstrak aseton ,maka vitamin K akan terpartisi semuanya
di lapisan atas (heksan), sementara senyawa-senyawa
polar berada di lapisan aseton / air

38. Struktur Vitamin K

39. Analisa Vitamin K
• Metoda analisis kuantitatif berdasar pada
interaksi 2,4-dinitro-fenilhidrazin dengan 2-
metil-1,4-naftoquinon dng adanya ammonia
alkoholis yang membentuk warna biru s/d biru-
hijau .
• Metoda lainnya didasarkan pada reduksi kata-
litik larutan quinon dalam butil alkohol dengan
indikator fenolsafranin. Hasil hidroquinon
kemudian ditambah larutan Na-2,6-dikhloro-
benzeneon-indofenol dalam butil alkohol
berlebihan, yang bebas udara. Menurunnya
intersitas warna proporsional dengan quinon
awal yang ada.

40. Vitamin C
Vitamin C atau yang biasa disebut Asam
karbonat adalah salah satu jenis vitamin
yang larut dalam air. Vitamin ini paling
tidak bisa stabil (mudah teroksidasi).
Serta vitamin C rusak karena reaksi enzim
askorbat-oksidase, labil pada suhu tinggi
dan stabil pada pH asam namun tidak
pada pH netal dan alkali.

41. • Ascorbic acid Dehydroascorbic acid
Vitamin C = ascorbic acid + dehydroascorbic acid

42. Analisa Vitamin C
Iodimetri
2,6-
dikllorofeno
lindofel
(DCIP)
Spektofoto
metri
Spektrofluo
rometri
Metode Instrumen Metode Non Instrumen

43. Metode Iodimetri
Dasar metode ini adalah sifat mereduksi
asam askorbat. Metode iodimetri (titrasi
langsung dengan larutan baku ioodium
0,1 N) dapat digunakan terhadapa asam
askorbat murni atau larutannya.
Prinsip
Yodium sebagai oksidator mengoksidasi
vitamin C, kelebihan yodium akan segera
terdeteksi dengan indicator amilum yang dalam
suasana basa berwarna biru muda.

44. Prosedur
• Timbang 100-300 gram sampel padat
• Hancurkan dalam blender sampai diperoleh slurry
• Timbang 10-30 g slurry masukkan ke dalam labu takar
100 ml
• Tambahkan aquades sampai tanda
• Saring dengan kertas saring atau disentrifuse untuk
memisahkan filtratnya
• Ambil 5-25 ml filtrate dengan pipet
• Masukkan ke dalam erlenmeter 125 ml
• Tambahkan 2 ml larutan amilum 1% (soluble starch)
dan tambahkan 20 ml aquades
• Kemudian titrasi dengan 0,01 N standar yodium
• T.A.T ditandai dengan terbentuknya warna biru muda
Perhitungan:
• 1 ml 0,01 N yodium= 0,88 mg asam askorbat

45. Metode 2,6-diklorofenolindofenol
(DCIP)
Metode 2,6-diklorofenolindofenol (DICP) ini
berdasarkan atas sifat mereduksi asam
askorbat terhadap zat warna 2,6-
dilorofenolindofenol. Asam askorbat akan
mereduksi indicator warna 2,6-diklorofenol-
indofenol membentuk larutan yang tidak
berwarna. Pada titik akhir titrasi, kelebihan
zat warna yang tidak mereduksi akan
berwarna merah muda dalam larutan asam.

46. Metode Kolorimetri
Asam askorbat dengan 4-metoksi-2-
nitroanilin yang telah didiazotasi
membentuk senyawa yang berwarna biru.
Metode Spektofotometri
Asam askorbat dalam larutan air netral
menunjukkan absorbansi maksimum pada
264 nm dengan nilai E1%= 579. Panjang
gelombang maksimum ini akan bergeser
oleh adanya asam mineral.

47. Metode Spektrofluorometri
Suatu metode spektrofluorometri untuk
menentukan kadar vitamin C yang
mendasar pada reaksi yang dikatalisis
oleh hemoglobin telah dikembangkan.
Metode spektrofluorometri lain untuk
analisis kuantitatif vitamin adalah
berdasarkan pada reaksi antara asam
askorbat (AA) dengan metilen biru (MB).

48. Vitamin B
• 8 vitamin yang larut dalam air dan memilki
peran penting dalam metabolisme sel
• Daftar jenis vitamin B
1. B1 (tiamin)
2. B2 (riboflavin)
3. B3 (niasin , termasuk asam nikotinat)
4. B5 (asam pantotenat)
5. B6 (piridoksin)
6. B7 (dikenal juga vitamin H(biotin)
7. B9 (dikenal sebagai vitamin M dan vitamin
B-c (asam folat))
8. B12 (kobolamin)

49. Vitamin B1 (Thiamin)
• Berbentuk kristal putih bersifat higroskopis
• Berbau ragi, titik leleh 246-250 C
• BM 337.26
• Mudah larut dalam air
• Membantu sel tubuh mengubah
karbohidrat menjadi energi
• Berperan penting bagi organ jantung, otot
dan sistem saraf agar berfungsi dengan baik

50. Metode Analisa Vitamin B1 (Thiamin)
I. Metode spektrofluorometri
II. Metode kolorimetri
III. Metode alkalimetri
IV. Metode argentomeri
V. Metdode gravimetri
VI. Kromatografi

51. Prosedur penetapan kadar vitamin
B1 secara Spektrofluorometri:
1. Penyiapan kolom kromatografi
2. Penyiapan larutan baku Tiamin HCL
3. Penyiapan sampel (ekstraksi)
4. Hidrolisis dengan enzim
5. Pemurnian
6. Oksidasi Tiamin menjadi Tiokrom

52. Penentuan thiamin dengan
Kolorimetri
PRINSIP :
Thiamin + garam reinecke  endapan
Endapan + aseton  larut  diukur
kadarnya pada λ 525 nm
*diperlukan standar thiamin

53. Kromatografi
• Kromatografi dengan deteksi UV-Vis dan fluoresensi
merupakan metode yang paling umum digunakan
untuk analisis vitamin B1 dalam bahan makanan.
• tiamin tidak bersifat fluoresen,akan tetapi vitamin
ini dan ester fosfatnya dapat direaksikan dengan
kalium heksasianoferat atau disebut juga dengan
kalium ferisianida,untuk menghasilkan senyawa
tiokrom yang bersesuaian yang menunjukan
fluoresensi biru yang kuat
• penggunaan tiokrom sebagai produk oksidasi tiamin
yang spesifik dan sangat berfluorosensi telah
digunaka secara rutin

54. Prosedur ekstraksi untuk analisis
tiamin dengan kromatografi
• Untuk pengujian vitamin total, ekstraksi harus membebaskan
tiamin dari matrik sampel yang kompleks dan menghidrolisis
esternya. Ekstraksi semacam ini melibatkan hidrolisis asam dan
enzim mengikuti AOAC
• The European Union Measurement and Testing Program Telah
mempublikasikan prosedur ekstraksi yang optimal dengan cara
:
1. autoklav-kan sejumlah 0,2 – 5,0 g sampel dalam HCL 0,1 N
selama 30 menit pada suhu 121 °C
2. Atur pH alikuot 4,0 dengan bufer natrium asetat4,0 M (Ph 6,1)
3. Tambahkan 100 mg takadiastase tiap g sampel
4. Inkubasikan pada suhu 37 °C sampai 45 °C
5. Didinginkan, disaring dan sentrifus

55. Penentuan thiamin dengan
fluorometer
PRINSIP :
• oksidasi thiamin menjadi thiokrom
(turunan thiamin yang dapat berpendar
dengan sinar UV)
• Bila senyawa yg dapat berfluoresen lain
dapat dipisahkan, maka tingkat fluoresensi
thiamin akan proporsional dng kadarnya
• REAGENSIA : kalium ferrisianida 1% baru

56. Metode analisis vitamin B1, engan fluoremetri
melibatkan tahapan-tahapan sebagai berikut:
1. Hidrolisis asam
2. Hidrolisis enzimatis
3. Pembersihan (clean up) ekstrak
4. Pembentukan tiokrom

57. Metode Argentometri
Adanya klorida dalam tiamin hidroksida dapat ditetapkan
secara argentometric dengan menggunakan metode
Volhard. Pada penetapan dengan metode Volhard
suasananya harus asam sebab jika suasananya basa akan
terjadi reaksi antara perak nitrat dengan basa membentuk
Ag(OH) yang pada tahap selanjutnya akan membentuk
endapan Ag2O, akibatnya perak nitrat tidak hanya bereaksi
dengan sampel tetapi juga bereaksi dengan basa.

58. Metode Gravimetri
Tiamin dalam tablet vitamin B1 dan dalam injeksi dapat ditetapkan
secara gravimetric dengan cara mengendapkan larutan tiamin
menggunakan asam silikowolframat.
PRINSIP :
Thiamin + garam reinecke  endapan  dikeringkan  ditimbang
*hanya dapat dilakukan jika sampel mengandung banyak thiamin
(>50 mg)
*jika kurang, lebih baik menggunakan fluorometer atau
kolorimeter

59. VITAMIN B2 (RIBOFLAVIN)
 Bentuk kristal jarum oranye-kuning
 Kurang larut dalam air (11 mg/100 ml)
 Dalam bentuk kristal bersifat stabil
 Dalam bentuk larutan, mudah rusak, terutama
dalam suasana alkalis dan oleh cahaya nampak
maupun sinar UV  analisa dilakukan di ruang
gelap
 Riboflavin relatif stabil terhadap panas

60. Penentuan Vitamin B2 (Riboflavin)
Metode Spektrofluorometri
Metode Spektofotometri

61. Metode Spektrofluorometri
1. Fluorometri langsung
• Prosedur manual. AOAC Official Method 970.65 merupakan metode utama yang
digunakan untuk analisis kandungan riboflavin dalam bahan makanan.
• Metode ini mengukur riboflavin total setelah hidrolisis asam FMN dan FAD menjadi
riboflavin bebas
• Hidrolisis disempurnakan dengan autoklav menggunakan HCL 0,1 N selam 30 menit
• Protein dipisahkan dengan mengatur pH 4,5 dan menyaring atau mensentrifusnya
untuk menjernihkan ekstrak
• pH selanjutnya ditingkan kan secara bertahap sampai pH 6,8 untuk mengecek
bahwa tidak ada pengendapan lanjut yang terjadi
• Prosedur AOAC mencatata bahwa penambahaan natrium hidrosulfit lebih dari 20
mg tiap tabung dapat mengurangi bahan-bahan berfluoresensi yang
mengganggu,yang dapat menimbulkan ketidakakuratan hasil uji

62. Cara penetapan langsung dapat digunakan terhadap campuran yang
bebas dari senyawa bewarna yang menggunakan atau senyawa
penganggu lain dan mengandung riboflavin lebih besar dari 0,1%.
Cara penetapan langsung dapat digunakan terhadap campuran yang
tidak mengandung senyawa berfluoresensi atau senyawa harus
dilakukan secepat mungkin karena riboflavin terurai oleh sinar
ultraviolet. Beberapa senyawa pengganggu dapat dioksidasi dengan
penambahan kalium permanganat, kemudian kelebihan pemanganat
dapat dihilangkan dengan penambahan hydrogen peroksida.

63. • Riboflavin dapat diperoleh dng penyerapan
menggunakan fuller’s earth dari extrak hati segar atau
extrak lain yg mengandung laktoflavin dlm larutan netral
atau asam kuat.
• Adsorpsi umumnya selesai dalam 10 menit.
• Selanjutnya dilakukan elusi dengan larutan dietilamina
10-15% atau lart NaOH 0.2% .
• Kadar vit. B2 dapat dianalisis secara fluorimetrik.

64. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
• Teknik ekstraksi standar yang sesuai untuk kromatografi dan
dapat diaplikasikan untuk semu jenis bahan makanan apapun
adalah dengan mengubah flavin terikat menjadi riboflavin
dengan cara melakukan autoklav sampel dengan asam mineral
encer , diikuti dengan digesti enzimatis pada pH optimum
• Kromatografi mampu memisahkan FMN dan riboflavin, oleh
karena itu estimasi total vitamin B2 dengan teknik ini
tergantung pada perubahan FMN menjadi riboflavin.

65. Metode Spektofotometri
Larutan riboflavin dalam dapar pH 4,0 menunjukkan
absorban simaksimum (λ maks) pada 444 nm dengan
E1%320. Cara ini digunakan untuk menetapkan
kemurnian ribloflavin atau untuk penetapan riboflavin
dengan kadar lebih besar dari 90%. Penetapan
riboflavin dilakukan dengan cara terindung dari cahaya.

66. Metoda Cepat Analisis Riboflavin dalam Susu
 10ml susu dlm 125ml erlenmeyer ditambah 25ml 0.1N HCl. Gojog
dan panaskan dlm autoclave 120oC selama 30 menit
 Dinginkan dan atur pH dng 1N NaOH menjadi pH 6.0 (jangan lebih
karena akan tidak stabil)
 Asamkan kembali dng 1N HCl sampai pH 4.5 kmd pindahkan kedlm
labu ukur 100ml, encerkan sampai tanda dng aquades, dan saring
dng kertas Whatman no.42
 Ambil filtrat jernihnya, baca transmitannya pada 440-400nm
(riboflavin berfluoresensi pd λ tsb)
 Buat kurva standar transmitansi lart standar riboflavin murni dng
kadar 0.1 – 0.5 g/ml dg perlakuan sama dng di atas.

67. VITAMIN B6 (PIRIDOKSIN
• Piridoksin berupa bubuk tak berwarna dan berasa
pahit
• Piridoksin mudah larut dalam air, alkohol, dan
aseton; bersifat stabil dalam asam, basa, dan panas,
namun terpengaruh oleh cahaya
• Dengan asam-asam mineral (misal HCl) akan
membentuk garam
• Piridoksin-HCl berbentuk bubuk putih, bersifat larut
dalam air dan alkohol, serta berasa asin

68. • Pyridoxin dapat diestimasi dng metoda kimiawi,
mikrobiologi dan bioassay.
• Pyridoxin memiliki gugus fungsional fenolat, sehingga
dapat membentuk reaksi warna yang dapat
dimanfaatkan dalam tehnik analisis.

69. Vitamin B2 (Riboflavin)
• Berbentuk kristal putih bersifat higroskopis
• Berbau ragi, titik leleh 246-250 C
• BM 337.26
• Mudah larut dalam air
• Membantu sel tubuh mengubah karbohidrat menjadi energi
• Berperan penting bagi organ jantung, otot dan sistem saraf
agar berfungsi dengan baik

70. Analisa Vitamin B2
• Metode spektrofluoro-metri
Riboflavin dapat diperoleh dengan penyerapan
menggunakan fuller’s earth dari extrak hati segar atau
extrak lain yg mengandung laktoflavin dlm larutan netral
atau asam kuat. Adsorpsi umumnya selesai dalam 10 menit.
Selanjutnya dilakukan elusi dengan larutan dietilamina 10-
15% atau lart NaOH 0.2% .
Kadar vit. B2 dapat dianalisis secara fluorimetrik.

71. Penentuan Vitamin B6
Spektofotometri Kolorimetri
Titrasi Bebas Air Kromatografi

72. Analisis vitamin b6
Fluorometri
• Metode fluometri melibatkan hidrolisi asam terhadap sampel-sampel
bahan makana, pemurnian secara kromatografi,serta perubahan
vitamin-vitamin yang terelusi menjadi asam 4-piridoksat, dan
perlakuan asam pada zat antara untuk membentuk turunan lakton
• Metode fluorometri telah digunakan untuk analisis vitamin b6 pada
kedelai .
• Ekstraksi sampel melibatkan :
• - sampel diautoklav dengan adanya asam sulfat
• - dibufer sampai pH 4,5 lalu didigesti dengan Claradiastase,
• - diencerkan ,dan disaring

73. Prinsip analisa piridoksin (metoda Hochberg,
Melnick, and Oser)
• Piridoksin yang terikat dibebaskan melalui hidrolisis
dengan HCl dan pemanasan
• Setelah diasamkan (pH 3,0), piridoksin bebas
diserap oleh absorben Lloyd
• Setelah pencucian dengan HCl, dilakukan elusi
terhadap piridoksin yang terserap dalam absorben,
dengan larutan NaOH
• Eluat dijernihkan dengan isopropil alkohol

74. • Supernatan diambil 3 kali dan diperlakukan sebagai berikut :
a. Supernatan saja
b. Supernatan + larutan standar piridoksin (sebagai standar internal)
c. Supernatan + asam borat (asam borat mengubah piridoksin
menjadi INAKTIF)
• Setiap tabung ditambah reagen Gibb (mengan-dung 2,6-dikhloro quinon
khloroimida)
• Piridoksin + 2,6-dikhloro-quinon-khloro-imida  terbentuk
kompleks berwarna biru

75. Prosedur analisa
a. Reagen Gibb (larutan A)
100mg 2,6-dikhloroquinonkhloroimida dilarut-kan
dalam 250ml isopropanol, dimasukkan dalam botol
gelap & disimpan di almari pendingin. Bila selama
penyimpanan timbul warna pink  reagen harus
dibuang (tdk murni)
b. Larutan ammonia-HCl (larutan B)
160g NH4Cl + 700ml aquades + 160ml NH4OH
jenuh, kemudian diencerkan sampai 1000ml

76. Metode Spektofotometri
Pada daerah ultraviolet, piridoksin, piridokamin, dan
piridoksal menunjukan daerah penyerapan yang
karakteristik walaupun tidak ada maksimum untuk
ketiganya. Kadar vitamin B6 jumlah dalam larutan buffer pH
6,75 dapat ditetapkan pada panjang gelombang 325 nm.
Pada panjang gelombang ini, piridoksin dan piridoksal
menunjukkan absorbansi maksimum pada 316 nm. Kurva
absorbsi piridoksin sendiri berubah dengan berubahnya pH
larutan. Larutan piridoksin dalam asam klorida 0,1 N
menunjukkan absorbansi maksimum pada 291 nm.

77. Metode Kolorimetri
Metode ini pertama kali diketengahkan oleh Seudi yang
mendasarkan pada reaksi fenol dengan 2,6-dikloro-p-
benzokuin-4-klorimina dengan menghasilkan warna biru
yang dapat disari dengan pelarut organik. Reaksi ini
merupakan reaksi umum untuk senyawa fenol yang
berkedudukan para terhadap gugus hidroksi lfenol tidak
tersubtitusi. Metode ini menunjukkan kepekaan yang
rendah jika sampel mengandung kurang dari 0,1 mg dan
peruraian dapat terjadi sebelum warna berkembang
mencapai maksimum.

78. Metode Titrasi Bebas Air
Piridoksin hidroklorida dapat
ditetapkan secara titrasi
bebas air setelah ditambah
raksa (II) asetat.
Metode Kromatografi
Kromatografi cair kinerja
tinggi (KCKT) dengan
detektor fluorometri telah
digunakan secara luas untuk
analisis kuantitatif vitamin
B6 dalam ayam dan bahan
lainnya.

79. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
• Kromatografi dengan elusi isoratik telah digunakan
untuk analisis bahan makanan . Metode ini
memberikan pemisahan vitamin-vitanin B6 (PN,PL,PM)
dalam 12 menit

80. ANALISIS VITAMIN B12
(KOBALAMIN) SECARA MIKROBIOLOGIS
Prinsip analisa (Apriyantono, 1989)
• Vitamin B12 dipisahkan dari makanan memakai larutan
buffer asetat pH 4,5
• Kobalamin (tidak stabil) ditambah Na-sianida 
terbentuk sianokobalamin yang stabil
• Kadar vitamin ditetapkan dengan menumbuh-kan
Lactobacillus leichmanii (bakteri tersebut membutuhkan
vitamin B12 untuk pertumbuhannya sehingga pada
kondisi terkontrol pertumbuhannya spesifik)

81. Vitamin B12

82. Penentuan Vitamin B12
Metode Kromatografi
Metode Spektofotometri

83. Metode Spektofotometri
• metode ini digunakan untuk produk-produk
farmasetik dengan konsentrasi tinggi
•Diukur pada panjang gelmbang 362 nm

84. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
• Pengembangan metode kromatograf ini untuk analisis
vitamin B12 dibatasi oleh sensitifitas dan selektifitasnya
yang rendah. Oleh karena itu, kebanyakan prosedur
melibatkan tahapan clean up dan pemekatan untuk
menguji vitamin ini dalam konsentrasi rendah
• Detektor spektrometer massa mampu menawarkan
sensitifitas dan selektifitas yang lebih baik dibandingkan
detektor UV

85. Contoh analisis vitamin B12 dengan KCKT
Sampel: produk-produk makanan
Penyiapan sampel:
vitamin B12 bebas menjadi digesti dengan α-amilase
vitamin B12 total menjadi digesti dengan α-amilase,pepsin
Clean up: kolom imunifitas
Kolom: C18
Fase gerak: gradien. Asam trifluoroasetat 0.025% dalam air ph(2.6)-
asetonitril. Kecepatan alir=0.25 ml/menit
Deteksi: UV 361 nm

86. Vitamin B9 (Asam Folat)
• Asam folat merupakan sekelompok senyawa yg
bersumber pada dedaunan hijau, memiliki karakter
seperti vitamin, yg memiliki aktivitas antianemia

87. ANALISIS FOLAT
SECARA MIKROBIOLOGIS
• Folat merupakan nama umum, termasuk asam folat.
Folat bersifat labil terhadap oksidasi, sinar, panas, dan
leaching saat makanan diolah
• Analisa dilakukan secara mikrobiologis
• Prinsip analisa
- Folat sampel diekstrak dalam buffer pada 100oC
- Ekstrak diperlakukan dengan -amilase, protease, dan
conjugase
- Respons pertumbuhan L. rhamnosus diukur dengan % transmitansi

88. Critical Point
• Perlu kehati-hatian tingkat tinggi untuk mencegah
folat teroksidasi dan mengalami degradasi fotokimia.
• Agen pereduksi (asam askorbat, -mercapto ethanol,
and dithiothreitol) efektif untuk mencegah oksidasi.

89. ANALISIS BIOTIN (vitamin H / B7)
• Biotin dianggap sebagai kelompok vitamin B
kompleks
• Merupakan kristal yang larut dalam air dan alkohol
• Bersifat stabil dalam suasana asam, alkalis, oleh
cahaya dan suhu normal
• Tidak stabil pada suhu tinggi maupun oleh senyawa
oksidator
• Analisa kadar biotin : metoda mikrobio-logis dan
bioassay

90. Terima Kasih
apakah ada pertanyaaan :D