some bacterial toxins is trigger for ASF rooting in Euroasian nosoareal among breed herds of pigs and wild boars. Investitions for search of biosecurity solutions.

1. THREAT OF HIDDEN SPREAD OF THE AFRICAN SWINE FEVER AS AN CONCURRENT INFECTIONS IN UKRAINE
ЗАГРОЗА ПРИХОВАНОГО ПОШИРЕННЯ АФРИКАНСЬКОЇ ЧУМИ В УКРАЇНІ У ВИГЛЯДІ АСОЦІЙОВАНИХ ІНФЕКЦІЙ
Andriy Buzun / Андрій Бузун
National Scientific Centre “Institute for Experimental & Clinical Veterinary Medicine”, National Academy of Agrarian Sciences, 83 Pushkins’ka Str., 60112 Kharkiv, Ukraine/
Національний науковий центр «Інститут Експериментальної та Клінічної Ветеринарної Медицини» Національної Академії Аграрних Наук України ( Харків)
The African Swine Fever (ASF) mix-infections are worse
matter for laboratory diagnosis by approaches which are
traditional for ASF mono-infection. The Potty’ case of ASF
introduction in Georgia in 2007 when the presence of porcine
circovirus resulted in a 3-5-month delay in the diagnosis of ASF is
good proof for this dictum (Rowlands RJ, 2008).
Purpose-Purpose- To understanding of causes of ASF false-negative
diagnoses in Ukraine we studied the field case of ASF concurrent
infection with Pasteurella haemolytica.
Асоційовані інфекції африканської чуми свиней (АЧС)
становлять суттєву проблему для лабораторної діагностики.
Наприклад присутність в пробах 2-го типу цирковірусу свиней
на місяці затримала проведення заходів проти АЧС у Грузії
(Rowlands RJ, 2008).
Мета–Мета– З’ясування можливих причин отримання фальш-
негативних результатів лабораторної діагностики АЧС.
INTRODUCTION –
ОБҐРУНТУВАННЯ
Primary bacteriological seeding on meat-peptone broth was
conducted in the field conditions from blood of sick pigs at the
peak of fever (40,0–40,5°C, n =5), and from the lungs and spleen of
fresh-fallen piglets (n=2). Tubes with seeds were transportation in
lab and incubated under 38o
C and then by traditional schedule for
Pasteurella growing and identification with use of blood-containing
agar. All of ASF agent manipulations were conducted by State
Veterinary Staffs with use standard protocol for ASF diagnosis by
PCR. Epizootic strain “1082” of Pseudorabies virus (PRV) was
growth on permissive cell line “ПТП” (secondary cells of piglet
testis) for enhance of titer to 106
TCID50/ml. Pasteurella eхotoxins
(leukotoxine) were obtained by microfiltration of the P.
haemolytica mass (after 18 hr. growing) through standard syringe
membranes 0,22 µ. The influence of these toxins on PRV
replication was estimated by traditional virus titration in presence
of different toxins concentrations (dilutions 1:10, 1:20 and 1:40
that haven’t cytopathic effect on Porcine Testis Secondary cells
line).
Відбір проб (n=7) проводили одночасно з їх посівом у
м'ясо-пептонний бульйон; посіви транспортували в
лабораторію, де проводили бакдослідження за стандартною
процедурою ННЦ «ІЕКВМ». Лабораторну діагностику АЧС
методами імунофлуоресценції (МФА) та ПЛР проводила
державна ветеринарна служба. Штам “1082” вірусу хвороби
Ауєскі (ХА) вирощували у перещеплюваних клітинах
тестикулів поросят (ПТП). Пастерельозний екзотоксин
отримували методом мікрофільтрація бакмаси P. haemolytica
через мембрани з порами 0,22µ. Вплив екзотоксину на
реплікацію вірусу ХА вивчали шляхом зараження клітин ПТП
вірусом (3.25 lg ТЦД50/мл) в суміші з екзотоксином у
концентраціях, що не викликали цитопатичної дії (1:10, 1:20
та 1:40)
METHODS - МЕТОДИ
Studied diversified agricultural holding that situated on South of Sumy region (UA). It had previous history of pasteurellosis in
cattle (herd n=1500) and pig (herd n=380) for about 20 years. The evidences from holding staffs suggested natural origin of
Pasteurellosis (nidi among rodents & wild boars). The owner requested diagnostic investigation and treatment help after death of 47
pigs of different ages during last months (April-May 2015). These pigs had signs of sub-acute form of disease resembling
intoxication: sub-febrile fever only on start then worming, wasting, coughing and sudden death. Sows had abortions and nonviable
litter. Sows in that farm received non-pasteurized cattle milk regularly. Because that ASF of wild boars was found at the end of July
2015 in northern Sumy region (250 km apart), and the corpse of fallen wild boar was revealed in the creeks near agroholding,
pathological samples from died (n=2) and sick pigs (n=1) of holding sent to a central laboratory for diagnostic studies on ASF.
Diagnosis on ASF by direct immunofluorescence (IF) and PCR was negative. 3 days apart when ASF suspicion discarded owner
asked for help in the NSC "ICVM“.
In the tissues of sick and dead pigs was found Pasteurella haemolytica. Application anti-pasteurellosis measures improved the
situation, but after 4 days of their start there are revealed the typical signs of ASF in 3 swine from 280. The appropriate samples
were immediately investigated by State veterinary service. As based on IF and PCR results ASF diagnosis was confirmed.
Given the foregoing we generate hypothesis for the possible impact of the bacterial toxins on replication of ASF virus. For check
of it we used PRV as an "surrogate" agent, because the BSL-3 conditions were insufficient. Established (see Table) that the toxin in
1:10 dilution completely blocks virus replication (n = 8, P <0.01), while in presence of 1:20 dilution was delay of it replication on 36
hr. (n=8, P<0.01). On Figure above presented the result of tube-test for Pasteurella’ leukotoxine checking on bovine leucocytes
(n=4).
Спалах хвороби (без фебрильної гарячки та геморагічного діатезу) стався в травні 2015 у багатогалузевому
агрохолдингу на півдні Сумщини, який впродовж не менш 20 років був стаціонарно неблагополучному по пастерельозу
свиней та ВРХ. В червні було виключено АЧС, після чого власник звернувся по допомогу в ННЦ «ІЕКВМ».
У тканинах хворих і полеглих свиней була виявлена Pasteurella haemolytica. Застосування протипастерельозних заходів
покращило ситуацію, але через 4 доби з їх початку з типовими ознаками АЧС захворіли 3 свині з 280. Державна ветслужба
негайно дослідила проби і на основі МФА та ПЛР діагноз АЧС було підтверджено.
Враховуючі викладене вище ми сформулювали робочу гіпотезу про можливий вплив бактерійного токсину на
реплікацію збудника АЧС, за відсутності BSL-3, перевіряли з використанням вірусу ХА, як «сурогатного» збудника.
Встановлено (див. Таблицю), що токсин у розведенні 1:10 повністю блокує розмноження вірусу (n=8, P<0.01), а у розведенні
1:20 відтерміновує його реплікацію (n=8, P<0.01). На рисунку внизу представлено результати контролювання активності
пастерельозного лейкотоксину за текстом за цитопатичною дією на лейкоцити ВРХ (n=4).
RESULTS - РЕЗУЛЬТАТИ
CONCLUSIONS - ВИСНОВКИ
The data can be interpreted as partial suppression of ASF materials accumulation in target tissues by bacterial toxin. So likely those toxins of P. haemolytica are responsible for the hidden spread of
the ASF virus among populations of pigs and wild boar in ASF Eurasian Nozoareal is real. There further research are need for validation of our hypothesis.
Acknowledgment- I thanks a lot to my colleague Dr. Helen Koltchik which conducted routine bacteriological investigations and growing of bacterial mass. Especially thanks to IECVM administration,
Metabiota and Black & Veatch corporations (USA) for valuable advice and organizational assistance
Отримані дані можна тлумачити як пригнічення бактерійним токсином накопичення збудника у цільових для діагностики АЧС тканинах. Отже ймовірно, що токсини Pasteurella
haemolytica є відповідальними за приховане поширення вірусу АЧС серед популяцій свиней і дикого кабана у Євразійському нозоареалі цієї хвороби. Для валідації гіпотези потрібні
подальші наукові дослідження
Подяка – Подяка моїй колежанці, д-ру Олені Кольчик, за кваліфіковане проведення традиційних бактеріологічних досліджень та накопичення бакмаси. Особлива подяка адміністрації ННЦ
«ІЕКВМ» та корпораціям Metabiota й Black & Veatch (США) за цінні поради та організаційну підтримку.

2. Національний науковий центр «Інститут
експериментальної та клінічної ветеринарної медицини»
Україна 62341, м Харків, вул. Пушкінська, 83
тел. (057) 7072036
ТУ У 24.4 – 00437087-030:2015
Вакцина емульсована інактивована
проти репродуктивно-респіраторного синдрому та цирковірусних інфекцій
свиней з місцевих штамів ДПДГ Інститут рису НААН
450,0 см3
(Для виробничих випробувань в рамках співпраці закладів НААН України)
Серія 1405 експериментальна Контроль 2
Виготовлена 14.10.2016. Термін придатності 9 міс. Застосовувати згідно клінічного
протоколу ННЦ «ІЕКВМ» б/н від 23.05.2016
Національний науковий центр «Інститут експериментальної
та клінічної ветеринарної медицини»
Україна 62341, м Харків, вул. Пушкінська, 83
тел. (057) 7072036
ТУ У 24.4 – 00437087-033:2016
Лікувально-профілактичний імуноглобулін
проти репродуктивно-респіраторного синдрому та
цирковірусних інфекцій свиней
450,0 см3
(Для виробничих випробувань в рамках співпраці закладів НААН України)
Серія 1400 експериментальна Контроль 1
Виготовлений 23.08.2016. Термін придатності 24 міс.
Застосовувати у Скадовському р-ні Херсонської області згідно клінічного протоколу
ННЦ «ІЕКВМ» б/н від 23.05.2016