Electrochemical Detection Of Nitric Oxide In Biological Fluids
1. Electrochemical Detection ofElectrochemical Detection of
Nitric Oxide in Biological FluidsNitric Oxide in Biological Fluids
METHODS IN ENZYMOLOGY, VOL.
BARRY W. ALLEN, JIE LIU, and CLAUDE A. PIANTADOSI
2. Nitric Oxide in Blood
Name Description
Neuronal
NOS
(nNOS or NOS1)
Produces NO in
neuronal tissue
in both the central and
peripheral nervous system.
Inducible
NOS
(iNOS or NOS2)
Can be found in the
immune system
used by macrophages in
immune defence against
pathogens.
Endothelial
Three isoforms of NO synthase (NOS)
Furchgott R, Zawadzki J (1980).
3. Nitric Oxide in Blood
epentdent Vasodilator (Acetylcholine, Bradyk
r stress
matory
xia
4. Nitric Oxide in Blood
• NO has a half-life of about 4 s in biological
fluids and is oxidized to nitrite and nitrate
anions
5. Nitric Oxide in Blood
NO may be present in the blood in at least 2 active
Forms
1. Aqueous form as a dissolved gas
The half life of aqueous NO in red cell-free
plasma in vitro is around 1 min
(Rassaf et al., 2002).
2. Nitrosothiols or RSNOs
6. Nitric Oxide in Blood
(oxyhaemoglobin) (methaemoglobin) (nitrate)
J. P. Wallis (2005)
8. Why Detection of NO in Blood
Diseases or Conditions Associated with
Abnormal NO Production and Bioavailability
• Hypertension
• Obesity
• Dyslipidemias (particularly hypercholesterolemia and
hypertriglyceridemia)
• Diabetes (both type I and II)
• Heart failure
• Atherosclerosis
• Cigarette smoking
• Septicemia
• Etc.
9. Introduction
•Electrochemistry
–fluids in real time and in situ
•NO electrodes can be made
small enough to be used in vivo
•NO in biological fluids that are
maintained in contact with a
gaseous environment,
•Release of NO from blood cells
as they move between regions
10. Materials and Methods
Helix Diameter
1.85 mm
100 µM in diameter , 3 mm long.
Suspended a 20
µL
drop of rabbit
aortic blood
13. Gas flow
•Air–CO2 mixture (20% O2, 5%
CO2, 75% N2)
•CO2–nitrogen mixture (5%CO2,
95% N2)
Gas flow was maintained at
constant rate
14. Blood Samples
•Rabbit aortic blood 3 mL
•Containing 7 units of
lyophilized heparin
•kept on ice for up to 30
min before use.
15. Chemical Reagents
•Prepared 100 µM solutions in
deionized water
–ascorbate
–L-cystine
–2,3-diphospho-D-glyceric
acid (DPG)
–sodium nitrite
16. Electrochemical Methods
•Amperometry
•BAS 100 B/W potentiostat
equipped
•+675 mV (vs. Ag/AgCl,)
•The electrodes were
activated electrochemically b
y applying alternating potent
ials of 200 and 800 mV for 2
17. The data were not used
•the composite resistance of
the electrochemical cell was
measured three times, final
average was more than 10%
greater than the initial avera
ge, fouled or that the blood d
rop had dried,
•The bloodwas not fluid
20. Responses to Changing
Gas Mixtures
•Responses to Changing Gas
Mixtures
–NO oxidation signals were first
detected from 200 to 400 s
after the flowing gas was chang
ed
–spike was followed by a
continuous signal of 1–2 nA
21. Discussion
• The blood-drop preparation described
here may represent a useful approach for
further investigation of the response of NO
levels
22. Discussion
• limiting the potential or by applying
coatings to the electrode that exclude spe
cies that have certain characteristics of ch
arge or size
• always useful to confirm anyexperimental
result by using other nonelectrochemical
methods
23. Conclusions
•A highly sensitive
electrochemical system can b
e designed to detect nM
concentrations of NO activity
•From 200 to 400 s after a
suspended drop of rabbit arte
rial blood was exposed to a d
ecrease in ambient PO2
•an experimental condition—
24. Conclusions
•we did not measure the
change in either ambient PO2
or blood-drop PO2 in this
deliberately kept low in order
to prevent drying of the
blood drop, PO2 will change
slowly.
• we cannot assign this
Editor's Notes
NO เป็นก๊าซโมเลกุลขนาดเล็กที่ถูกสร้างขึ้นจาก NO Synthase ซึ่งมีอยู่ 3 Isoform
Neuronal NOS คือเอ็นไซม์ที่ เส้นประสาทสังเคราะห์ NO ที่ทำหน้าที่เป็นสารสื่อประสาท
Inducible NOS คือเอ็นไซม์ที่ macrophage สังเคราะห์ NO ที่ทำหน้าเป็นภูมิคุ้มกัน ทำลายสิ่งแปลกปลอม
Endothelial NOS คือเอ็นไซม์ที่อยู่ใน Endothelial cell ที่บุผนังหลอดเลือด ทำหน้าที่ควบคุมการไหลของกระแสเลือด
ขั้นตอนการสังเคราะห์ NO นั้นเริ่มต้นที่ ตัวกระตุ้น NOS ให้เปลี่ยนจากรูปจาก inactive เป็น active
เช่น สารกลุ่ม NO-depentdent Vasodilator เช่น Acetylcholine Bradykinin เป็นต้น จับกับ receptor ที่อยู่บนผิวของ Endotherail cell
เกิดการเปิดของ Ca ion chanel , Ca ion ในเซลที่เพิ่มขึ้นจะทำให้ NOS ทำงานโดยเปลี่ยนอะมิโนเอซิต L-arg เป็น L-Citruline
ได้ผลิตภัณฑ์อีกตัวออกมาคือ NO
เนื่องจาก NO เป็นก๊าชที่มีความไวต่อปฏิกิริยาสูงมาก จะเปลี่ยนแปลงอย่างรวดเร็ว
1. Aq NO ละลายอยู่ใน
2. Nitrite ,Nitrate
3. Nitrosothiols คือจะไปจับตัวกับสารที่มี กลุ่ม thial อยู่เช่น Albumin haemoglobin glutathione
4. Peroxynitrite รวมตัวกับ Super Oxide
แต่ form active คือที่สามารถทำงานได้คือ NO ที่สะลายอยู่ในของเหลว กับ กลุ่ม Nitrosothiols
ซึ่งมีงานวิจัยหนึ่งรายงานว่า Aq NO นั้นมีครึ่งชีวิตประมาณ 1 นาที
ตัวอย่าง NO ที่รวมตัวกับ Hb โดยจะเขาไปจับกับ Oxy. เปลี่ยนเปลี่ยนเป็น Meth. และ nitrite
Electrochemistry เป็นวิธีที่เหมาะสมที่ใช้วัดในสิ่งตัวอย่างที่มาจากสิ่งมีชีวิต เพราะสามารถวัดได้แบบ Real time และ วัดได้จากจุดที่หลั่งได้
NO Electrode ที่ใช้ในการวัดแบบ in vivo มีการผลิตค่อนข้างน้อย งานวิจัยนี้จะเป็นโมเดลให้กับการทดลองต่อๆไป
การวัดในครั้งนี้สิ่งตรวจที่มาจากสิ่งมีชีวิต นี้จะควบคุมปริมาณแก็สที่อยู่โดยรอบ โดยกระตุ้นการหลั่ง NO จาก RBC โดยการเปลี่ยนปริมาณของออกซิเจน
การออกแบบของงานวิจัยนี้เพื่อใช้ในการวัดเลือดที่ได้จากกระต่าย โดยให้
Working Electrode/Counter Electrode ทำจาก Pt อยู่ตรงกลางมีเส้นผ่านศูนย์กลาง 100 µm ยาว 3 mm
Ref Electrode ทำจาก Ag เคลือบด้วย Ag/AgCl ทำเป็นเกลียวเส้นรอบวง 1.85 mm
Sample Blood หยดลงตรงกลางปริมาณ 20 µL
การเตรียม Electrode ในเหมาะสมกับ NO
ใช้ Pt เส้นผ่านศูนย์กลาง 100 um
เคลือบด้วย carbon nanotubes
เคลือบด้วย ruthenium
และสุดท้ายเคลือบด้วย Nafion
จากนั้นมีการตรวจสอบว่าสารต่างๆที่เคลือบนั้น
หลังจากทำการเคลือบแล้วมีการติดที่ Electrode จริงเลยมีการ
ใช้ Scanning electron micrograhy ส่องดู ก็พบว่ามีการเคลือบของสารต่างๆเกิดขึ้น
ก๊าซที่ใช้ในการควบคุมการจำลองปรากฏการ hypoxia
เมื่อ NO จับอยู่กับสารอื่นเมื่ออยู่ในสภาวะขาดออกซิเจนหรือสภาวะ hypoxia ก็จะถูกปล่อยออกมา
จากนั้น electrode ก็จะทำการตรวจวัด NO ที่ถูกปล่อยออกมา
การเก็บตัวอย่างเลือดใช้เลือดกระต่าย
เก็บมา 3 ml ในสารกั้นเลือดแข็ง Heparin
และแช่ในน้ำแข็ง เป็นเวลา 30 นาทีก่อนนำมาทดสอบ
กลุ่มสารรบกวนต่างๆที่คาดว่าจะมีผลต่อการวัด NO
ก็จะเตรียมในความเข้มข้น 100 uM มี
ใช้หลักการ Amperometry โดยในแรงดันแล้ววัดกระแสที่เกิดขึ้น
ใช้เครื่อง BAS 100 B/W เป็นเครื่องในการให้แรงดันและวัดแส
ใช้ แรงดัน +675 mV
ก่อนการวัดทำการ activate electrode ด้วยกระแสไฟฟ้าสลับ 200 mV และ 800 mV อย่างละ 250 ms และ 500 ms ตามลำดับ
และทำทั้งหมด 120 s
การคัดเลือก Data มาวิเคราะห์
วัดความต้านทานของ electrode ก่อนทำการวัดและหลังการวัดอย่างละ 3 ครั้ง
ถ้าหลังมากว่า 10 % แสดงว่าเลือดแห้ง
เลือดแห้งไม่ใช้ data นั้น
เลือดไม่อยู่ในเกลียว
ผลของการวัดกับสารรบกวนเทียบกับ NO
การวัดเมื่อเปลี่ยน gas mixed แกนตั้งคือกระแสหน่วย nA แกนนอนเป็นเวลา
กราฟ A ลูกศรคือช่วงที่มีการเปลี่ยนก๊าซเมื่อเวลาผ่านไป 350 s พบว่าเกิด peak ของสัญญาณขึ้น
กราฟ B คือ Sample blood เหมือนกันแต่ไม่เปลี่ยนก๊าซ
จากการศึกษาดังกล่าวพบว่า peak จะเกิดขึ้นหลังเปลี่ยนก๊าซประมาณ 200-400 s
Peak ที่เกิดขึ้นวัดกระแสได้ประมาณ 1-2 nA
จากการเก็บตัวอย่างเลือดอาจจะทำให้เกิดผลกระทบปริมาณของ NO ได้
วิธีที่วัดคือการวัดการ transfer ที่ electrone ดังนั้นเราไม่อาจแน่ใจได้ว่าตัวที่ transfer ให้ นั้นมาจาก NO การเลือก selective membran และการ limite แรงดันสามารถช่วยแก้ปัญหานี้ได้
2. ควรจะเพิ่มการวัดด้วยวิธีอื่นเพื่อใช้ในการเปนียบเทียบด้วย
สามารถผลิต electrode ที่มีความไวต่อ NO ได้
หลังจากเปลี่ยนปริมาณ PO2 ไปแล้วประมาณ 200-400 s จะเกิดปฎิกิริยาเกิดขึ้น
ในการทดลองนี้ได้ใช้การจำลองภาวะ Hypoxia เพื่อกระตุ้นให้มีการปล่อย NO