Recommended
More Related Content
More from HsuChi Chen
More from HsuChi Chen (14)
模組化課程生醫微製程期末報告
- 1. Discussion A wearable microfluidic device for rapid detection of HIV-1 DNA Using recombinase polymerase amplification
- 3. PCR 1.變性(Denaturation): 高溫(90°C)斷DNA氫鍵 2.退火(Annealing): 50°C引子結合在DNA 3.延伸(Extension): 72°C DNA聚合酶合成
- 6. RPA • 1.能結合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶 • 2.單鏈DNA結合蛋白(SSB) • 3.鏈置換DNA聚合酶
- 8. 總結 • PCR • 螢光定量檢測方法 • RPA • 裝置實現
- 9. Reference • 3.圖:https://www.facebook.com/everythingaboutBiotech/photos/a.2035926766637950/2826438994253386 • 3.解說:https://www.youtube.com/watch?v=Sv05DQc12w8 • 4.圖:https://www.youtube.com/watch?v=ThG_02miq-4 • 4.解說:https://www.youtube.com/watch?v=ThG_02miq-4 • 論文:A wearable microfluidic device for rapid detection of HIV-1 DNA Using recombinase polymerase amplification
Editor's Notes
- 1.簡介 大家好，接下來我要講論文中關於discussion的部分。
- 2.裝置功能 首先先回顧一下是如何檢測HIV病毒的。HIV病毒主要感染人類免疫系統細胞，會存在免疫細胞、血漿、淋巴液或組織液的某些體液中。而我們獲得病毒最方便的方法就是抽血。 所以在戴上這個穿戴式微流體裝置之前，要先抽取血液樣本，獲得HIV-1 DNA這個病毒。接下來戴上裝置，他就會開始進行DNA的放大。 什麼是放大呢?放大就是不斷去複製DNA，使他數量級加倍，以方便我們可以後續的檢測，而在這邊論文一直提到PCR與RPA之間的比較，這個裝置是採取RPA的放大方法，接下來我會分別跟大家說明這兩種的放大機制。 而我們都知道每種化學或生物的反應都有限定他反應的溫度，以這個裝置用的RPA為例最佳的反應溫度就是攝氏37度，我認為蠻重要的是"溫度"控制，這決定了裝置實現的難易度。 之後再藉由一些檢測DNA放大的方式去測量結果。
- 3.PCR 首先來介紹PCR，這在最近新冠肺炎篩檢蠻夯的，不過這些基本原理其實高中生物都有教，我在這裡做個小複習。 這個原理就是我們先了解自然界是怎麼複製的再去做模仿，先透過解旋酶讓DNA雙股打開、透過RNA引子接上，然後利用DNA聚合酶把引子不斷延長，5端往3端去做複製。 然後我們把這原理去做改造，第一步我們不用DNA解旋酶了，我們直接加熱到90度讓DNA的雙股打開，因為高溫會破壞氫鍵，一旦打開後我們試管會加入DNA引子，這個DNA引子在高溫下連不上，因為氫鍵沒辦法形成，所以要降溫到50度，這時候引子就會連上，形成短暫的雙股 這時候試劑上就有比較不怕熱的DNA聚合酶，這個DNA聚合酶就會沿著引子的3'端往後不斷延長，這個反應就模擬自然界DNA複製，這時候燒到72度，因為這個溫度對聚合酶來說催化效率會比較好。 所以仔細看一下反應過程，溫度變化與控制是很重要的，高溫是讓雙股DNA打開；溫度降低是讓DNA引子連上，72度是因為現在DNA聚合酶最適合作用的溫度是在72度，這時候他的反應速度比較快，所以我們需要不停改變環境的溫度重複這個動作，90度、50度、72度這樣複製一輪，每一回DNA的數量就會double，所以這個技術叫DNA ampify放大技術，這裡指的是數量上的放大。 然後在做PCR的時候不是整條都被複製，我們在這DNA引子之間夾出的淺藍色區域才會被放大 而現在新冠肺炎的技術就是RT-PCR反轉錄聚合酶連鎖反應，就是把檢測的對象把DNA改成RNA，利用反轉錄酶還有DNA引子，以RNA為模板做出一股DNA，最後透過DNA聚合酶就做出雙股的DNA了，接下來過程就跟PCR一樣了。'
- 4.檢測方法 但這時候問題就來了，我要如何檢測病毒?這時候就需要一個探針，這個探針是經過精心設計的，它包含與代測病毒的某一段基因互補的基因序列，探針5'那一端附有一個螢光訊號源，當使用特定頻率照射時就會發出對應的螢光訊號，但是在另一端同時也設計了對應的訊號催滅劑，這使得當探針的結構是完整時，他所發出的訊號正好被其自身所吸收 不過當到剛才講到PCR的第3個階段時DNA聚合酶複製到達探針時，這個設計好的結構被破壞，他就會發出螢光訊號。如此這樣DNA每複製一次，大量探針的結構就會被破壞並發出螢光訊號，如此儀器所檢測的訊號就會指數性成長。 而由機器分析我們就可以把圖畫出來。當螢光強度到達某一設定程度，此時他做PCR的次數就是他的CT值(Treshold Cycle)。
- HIV病毒流行大多在資源匱乏的第三世界，但是使用傳統的PCR採檢，從樣本開始需要幾個小時又需要使用專門的熱循環機器。因此才改用新的技術 - 等溫核酸檢測，當中的2006年由英國公司開發的RPA技術(重組酶與聚合酶技術)，不像先前講的傳統的PCR需要DNA放大時需要一次次的熱循環，RPA只要讓環境維持在37度即可。
- 6.RPA RPA反應利用稱為重組酶的酶，該酶與寡核苷酸引子形成複合物，並將引子與雙鏈 DNA 中的同源序列配對。單鏈 DNA 結合 (SSB) 蛋白與置換的 DNA 鏈結合併穩定生成的 D 環，這是要避免他再次發生反應。然後從引子開始通過聚合酶進行 DNA 擴增，就這樣跟PCR一樣引發連鎖反應。
- 7.最終裝置介紹 雖然RPA改良了PCR需要反覆熱循環機制，只需要維持等溫在37度就好了。但是像是在2015年伊波拉爆發時，仍然需要不斷供應電力，因此才有人用人體熱量去加熱的構思，在這篇論文之前也有其他團隊是研發類似的，是用人體腋下的熱量去加熱有RPA試劑的管子，之後再用lateral flow(就是教授昨天講的那個驗孕棒的機制)去檢測的模型。 而這篇論文的作者認為用腋下去測，受試者可能身體不適，不方便也不衛生。因此設計了這個微流體裝置，用上了現在很夯的穿戴式裝置和智慧手機。智慧手機是做剛剛講的第4頁螢光圖形的運算分析；而裝置是用3D列印機，利用PDMS和DSA的鍵結使裝置洩漏的機會很低，能有效密封，這樣就不需要主動加熱或是涉及到PCR的熱循環了。 但同時也點出一個重要的缺點就是RPA試劑比PCR還來的貴。 大致總結一下測試流程: 1.一開始抽血獲取受試者血液 2.滴入微流體裝置並戴在手上 3.24分鐘左右將裝置上的芯片拿下來，並且放入小小的熒光檢測系統中 4.最後產生的熒光使用現在很普及的智慧手機，下載ImageJ這套軟體分析圖像，就可以看檢測結果。
- 8.總結 總結一下:一開始介紹了PCR這個核酸放大的技術與判斷檢測結果是否陰陽性的螢光定量。接下來由於PCR技術溫度控制起伏大，所以改用RPA技術，最後實現微流體穿戴式裝置。
- 以下為參考資料。