Successfully reported this slideshow.
We use your LinkedIn profile and activity data to personalize ads and to show you more relevant ads. You can change your ad preferences anytime.
RACE 的简介 花卉生物工程研究所:许志茹 2004 、 03 、 13
RACE 技术的简介 <ul><li>cDNA 完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。 </li></ul><ul><li>完整的 cDNA  序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。 </li></ul><ul><l...
RACE 的优点 <ul><li>与筛库法相比较,有许多方面的优点 </li></ul><ul><li>1 )此方法是通过 PCR 技术实现的,无须建立 cDNA 文库,可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。 </li></ul><ul><l...
实验室现有的 RACE 试剂盒的简介 <ul><li>RACE 是一种从一个相同的 cDNA 模板进行 5‘ 和 3‘ 末端快速克隆的方法。此方法会产生较少的错误条带。此过程中使用的酶混合物非常适合长链 PCR 。 </li></ul><ul>...
RACE 引物的设计: <ul><li>基因特异性引物( GSPs )应该是: </li></ul><ul><li>23 - 28nt </li></ul><ul><li>50 - 70 % GC </li></ul><ul><li>Tm 值≥...
反应中涉及到的一些事项 <ul><li>cDNA 的合成起始于 polyA + RNA 。如果使用其它的基因组 DNA 或总 RNA ,背景会很高。  </li></ul><ul><li>RACE PCR 的效率还取决于总的 mRNA 中目的 ...
<ul><li>表 4 中给出了所有引物的相互关系。重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。另外,重叠的引物可以为 PCR 反应提供一个对照。并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。 </li></ul><ul><li>引物 GSP 中的 GC ...
<ul><li>如果要用重叠片段来检测设计的引物, GSp1 和 GSp2 之间至少是 100 - 200 碱基。只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。 </li></ul><ul><li>降落 PCR 可以明显的增加 RACE ...
<ul><li>验证基因特异性引物的对照: </li></ul><ul><ul><li>单个引物的阴性对照:只用一个引物 GSP 来进行阴性对照。这样不应该产生任何的条带。如果可以看到明显的产物,应该改变循环的参数,或重新设计原始引物。 </l...
具体的实验步骤 <ul><li>cDNA 第一条链的合成: </li></ul><ul><li>我们建议进行 cDNA 合成的对照反应,这样可以对样品的 cDNA 的合成进行鉴定。加入各种试剂之后,在气浴中 42 度保温一个小时。 </li><...
<ul><li>建议进行阳性对照 ,cDNA 的质量取决于制备的 polyA+RNA 的质量。非哺乳动物样品的 mRNA 大约在 0.5 - 3kb 之间。 </li></ul><ul><li>通过电泳检测 cDNA 的产量,与对照进行对比,这...
接头的连接及连接产物的稀释 <ul><li>按照程序进行连接反应。 </li></ul><ul><li>如果没有对比样品和对照的产量,利用 Tricine - EDTA buffer 制备接头连接的 ds cDNA 的 1/50 和 1/250...
RACE - PCR 扩增 <ul><li>进行 5’ 和 3’ 的 RACE - PCR 扩增。 </li></ul><ul><li>利用以下的程序进行降落 PCR 反应: </li></ul><ul><li>94 度  30 秒 </li>...
<ul><li>当循环结束时,利用 1.2% 琼脂糖凝胶电泳分析每一个管中的产物 5μl ,使用适当的分子量 marker 。 </li></ul><ul><li>可以根据你的基因的特异性来设计最理想的循环参数。如果看不到带或者只有微弱的带,在...
RACE 产物的验证:   <ul><li>应该对 RACE 的片段进行验证 , 以此来确定是否已经扩增了理想的产物。如果得到的是多条带或者研究的是多基因家族的成员,验证是非常有用的。 </li></ul><ul><li>有 3 种验证 RAC...
比较由 GSP 和 NGSP 获得 RACE 产物。 <ul><li>对于 5‘ 末端的 RACE 产物,比较由 AP1 和 GSP1 扩增出来的产物和由 AP1 和 NGSP1 扩增出来的产物。 </li></ul><ul><li>对于 3‘...
RACE 产物的克隆和测序: <ul><li>可以利用胶回收试剂盒来回收 RACE 产物,此试剂盒适合回收 2.5kb 以下的 RACE 产物;对于长的片段,可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法,最后用 Tricine - ...
- <ul><li>对于 5‘ 端的 RACE 产物,我们建议挑取至少 8 - 10 个不同的克隆以获得 5‘ 端的最大可能性的序列。(反转录并不总是进行到 mRNA 模板的 5’ 末端,尤其是长模板。另外, T4 DNA 聚合酶会移走 5‘ ...
全长 cDNA 的获得 <ul><li>通过部分或全部测序鉴定了 RACE 产物后,可以通过两种选择获得全长的 cDNA 。 </li></ul><ul><li>通过 PCR 的方法。 </li></ul><ul><li>通过克隆的方法。 </...
通过 PCR 的方法获得全长 cDNA : <ul><li>扩增长的 cDNA 需要较长的延伸时间,但是如果延伸的时间过长,可以产生拖带,所以要慎重的设计引物。 </li></ul><ul><li>根据从 5‘ 和 3‘RACE 产物获得序列信...
通过 PCR 的方法获得全长 cDNA : <ul><li>进行如下的热循环: </li></ul><ul><li>94 度  30 秒 </li></ul><ul><li>25 个循环  94 度  5 秒 </li></ul><ul><li...
通过 PCR 的方法获得全长 cDNA : <ul><li>在 1.2% 的琼脂糖凝胶上分析 5μl 的样品。通常情况下,可以见到一条单一带,如果这样,利用胶来纯化全长的 cDNA 。 </li></ul><ul><li>制备 1.2% 的 T...
通过 PCR 的方法获得全长 cDNA : <ul><li>利用胶回收试剂盒回收 cDNA 。此试剂盒适合回收 2.5kb 以下的 RACE 产物;对于长的片段,可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法,最后用 Tricine ...
通过克隆产生全长的 cDNA :   <ul><li>如果你已经获得了含有重叠部分的 5‘ 和 3’RACE 产物,同时在 cDNA 的重叠部分含有一个酶切位点的话,通过克隆技术可以获得全长的 cDNA 。  </li></ul><ul><li...
Appendix : cDNA 接头和引物 <ul><li>接头在设计的时候可以使 cDNA 的扩增成功进行: </li></ul><ul><ul><ul><li>接头的 5‘ 端在第一个循环中没有 AP1 引物的结合位点。 AP1 的结合位点...
<ul><li>谢谢大家! </li></ul>
Upcoming SlideShare
Loading in …5
×

香港六合彩

1,090 views

Published on

幸好手下的香港六合彩人都还算能干机警。我放心的回香港过年。小洛在我香港六合彩到达以前已经被程家的保镖护送回香港了。他见到我生涩香港六合彩的开口叫我“妈”。我拉着他回到我房间。我们安香港六合彩静的坐着,他不想说什么我亦不开口。当然明白他现香港六合彩在的感觉,我十一岁的时候父亲再婚我也一句话不香港六合彩说。那时候不是赌气,是在预测还会有什么发生,我已香港六合彩经对势必发生的事情很少抵抗了,包括情绪上的,那时候。我突然觉得我们一家香港六合彩人都他妈的真混蛋,这乱七八糟的是什么关系。伤害的人还不够多么。我一时没顾及后香港六合彩果,问了小洛一句:“小洛,不开心的话妈妈陪你回上海过年,我们去崇明岛香港六合彩放烟火。”这种哄小孩的话当然是哄不了小洛的,但是这个时候他香港六合彩异常脆弱,我还是看见他眼睛里大片大片的动摇和难过。我无能为力,就香港六合彩像当年看着爸爸对陌生的女人许下誓言之吻的时候就像看着裴启翰带走于末的时候就像等待郑香港六合彩敬森签字离婚的时候,这种感觉让我疲惫不堪,甚至呼吸困难,然而每香港六合彩一次我都没有一个可以依靠的地方,只能自己安抚自己。这么多次的香港六合彩洗礼,难道还没有习惯吗,现在我能给小洛的只有那么一点微不足道的依香港六合彩靠了。
  他最终还是摇摇头,说了一句我曾经说过的对香港六合彩白:“没关系的,反正都要成为事实,我难道香港六合彩还能睁着眼睛说什么事都没发生过么?”

Published in: Technology, Sports
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

香港六合彩

  1. 1. RACE 的简介 花卉生物工程研究所:许志茹 2004 、 03 、 13
  2. 2. RACE 技术的简介 <ul><li>cDNA 完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。 </li></ul><ul><li>完整的 cDNA 序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。 </li></ul><ul><li>末端克隆技术是 20 世纪 80 年代发展起来的。 RACE(rapid-amplification of cDNA ends ) 是通过 PCR 进行 cDNA 末端快速克隆的技术。 </li></ul>
  3. 3. RACE 的优点 <ul><li>与筛库法相比较,有许多方面的优点 </li></ul><ul><li>1 )此方法是通过 PCR 技术实现的,无须建立 cDNA 文库,可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。 </li></ul><ul><li>2 )节约了实验所花费的经费和时间。 </li></ul><ul><li>3 )只要引物设计正确,在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长。 </li></ul>
  4. 4. 实验室现有的 RACE 试剂盒的简介 <ul><li>RACE 是一种从一个相同的 cDNA 模板进行 5‘ 和 3‘ 末端快速克隆的方法。此方法会产生较少的错误条带。此过程中使用的酶混合物非常适合长链 PCR 。 </li></ul><ul><li>使用此方法的要求是必须知道至少 23 - 28 个核苷酸序列信息,以此来设计 5’ 末端和 3‘ 末端 RACE 反应的基因特异性引物( GSPs )。 </li></ul>
  5. 5. RACE 引物的设计: <ul><li>基因特异性引物( GSPs )应该是: </li></ul><ul><li>23 - 28nt </li></ul><ul><li>50 - 70 % GC </li></ul><ul><li>Tm 值≥ 65 度, Tm 值≥ 70 度可以获得好的结果 </li></ul><ul><li>需要实验者根据已有的基因序列设计 5‘ 和 3‘RACE 反应的基因特异性引物( GSP1 和 GSP2). 由于两个引物的存在, PCR 的产物是特异性的。 </li></ul>
  6. 6. 反应中涉及到的一些事项 <ul><li>cDNA 的合成起始于 polyA + RNA 。如果使用其它的基因组 DNA 或总 RNA ,背景会很高。 </li></ul><ul><li>RACE PCR 的效率还取决于总的 mRNA 中目的 mRNA 的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。 </li></ul><ul><li>在进行 5‘ 和 3’RACE PCR 的时候应该使用热启动。 </li></ul>
  7. 7. <ul><li>表 4 中给出了所有引物的相互关系。重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。另外,重叠的引物可以为 PCR 反应提供一个对照。并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。 </li></ul><ul><li>引物 GSP 中的 GC 含量要在 50 - 70 %之间。这样可以使用降落 PCR 。避免使用自身互补性的引物序列,否则会产生回折和形成分子内氢键。另外,避免使用与 AP1 互补的引物,尤其是在 3‘ 末端。 </li></ul>
  8. 8. <ul><li>如果要用重叠片段来检测设计的引物, GSp1 和 GSp2 之间至少是 100 - 200 碱基。只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。 </li></ul><ul><li>降落 PCR 可以明显的增加 RACE PCR 产物的特异性。在最开始的循环中,退火温度高于 AP1 引物的 Tm 值,可以增加对特异性条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降回到 AP1 的温度,可以进行随后的 PCR 循环。 </li></ul>
  9. 9. <ul><li>验证基因特异性引物的对照: </li></ul><ul><ul><li>单个引物的阴性对照:只用一个引物 GSP 来进行阴性对照。这样不应该产生任何的条带。如果可以看到明显的产物,应该改变循环的参数,或重新设计原始引物。 </li></ul></ul><ul><ul><li>利用两个 GSPS 进行阳性对照:(只有两个 GSP 可以产生重叠的时候才可以采用此步。)为了确定 RNA 样品中目的基因确实表达,利用两个 GSP 和接头连接的 cDNA 来产生阳性对照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。如果没有这个片段,应该重复 cDNA 的合成,或者从一个不同的组织或细胞来源进行 cDNA 的合成。 </li></ul></ul><ul><li>制备和抽提 polyA+RNA </li></ul><ul><li>不要使用 DEPC 处理过的水。 </li></ul><ul><li>纯化完 mRNA 之后,利用琼脂糖凝胶电泳检测 mRNA 的质量。哺乳动物的 mRNA 样品是 0.5 - 12kb 的拖带,在其中有 4.5 和 1.9kb 的 rRNA 的条带。非哺乳动物的 mRNA 应略小。 </li></ul>
  10. 10. 具体的实验步骤 <ul><li>cDNA 第一条链的合成: </li></ul><ul><li>我们建议进行 cDNA 合成的对照反应,这样可以对样品的 cDNA 的合成进行鉴定。加入各种试剂之后,在气浴中 42 度保温一个小时。 </li></ul><ul><li>注意: 在水浴或酒精浴中保温回减少反应体积,从而降低第一链的合成效率。 </li></ul><ul><li>将管放于冰上,以终止第一链的合成反应。 </li></ul><ul><li>直接进行第二链的合成。 </li></ul><ul><li>cDNA 第二链的合成: </li></ul><ul><li>第二链合成的酶混合物中,含有聚合酶、 RNaseH 和连接酶。 T4 DNA 聚合酶的功能是补平 dscDNA 的末端。我们建议做阳性对照,试剂盒中提供人类骨骼肌的 mRNA 。 </li></ul>
  11. 11. <ul><li>建议进行阳性对照 ,cDNA 的质量取决于制备的 polyA+RNA 的质量。非哺乳动物样品的 mRNA 大约在 0.5 - 3kb 之间。 </li></ul><ul><li>通过电泳检测 cDNA 的产量,与对照进行对比,这样可以有利于在以后的步骤中对 cDNA 进行稀释。 </li></ul>
  12. 12. 接头的连接及连接产物的稀释 <ul><li>按照程序进行连接反应。 </li></ul><ul><li>如果没有对比样品和对照的产量,利用 Tricine - EDTA buffer 制备接头连接的 ds cDNA 的 1/50 和 1/250 的稀释物,用两种稀释物进行以下的 RACE PCR 反应,直到鉴定出哪一种稀释可以得到好的效果。 </li></ul>
  13. 13. RACE - PCR 扩增 <ul><li>进行 5’ 和 3’ 的 RACE - PCR 扩增。 </li></ul><ul><li>利用以下的程序进行降落 PCR 反应: </li></ul><ul><li>94 度 30 秒 </li></ul><ul><li>5 个循环 : 94 度 5 秒 </li></ul><ul><li>72 度 4 分 </li></ul><ul><li>5 个循环 : 94 度 5 秒 </li></ul><ul><li>70 度 4 分钟 </li></ul><ul><li>20 - 25 个循环: 94 度 5 秒 </li></ul><ul><li>68 度 4 分钟 </li></ul><ul><li>注意: </li></ul><ul><li>我们建议使用降落 PCR 反应,这就要求 GSP 的 Tm 值≥ 70 度。 </li></ul>
  14. 14. <ul><li>当循环结束时,利用 1.2% 琼脂糖凝胶电泳分析每一个管中的产物 5μl ,使用适当的分子量 marker 。 </li></ul><ul><li>可以根据你的基因的特异性来设计最理想的循环参数。如果看不到带或者只有微弱的带,在 68 度多加 5 个循环。最佳的延伸时间取决于扩增条带的长度。如果片断的长度在 2 - 5kb 的时候,经常使用 4min , 0.2-2kb 的时候将延伸时间减到 2 - 3min ,对于 5 - 10kb 的条带,延伸时间增加到 10min 。 </li></ul>
  15. 15. RACE 产物的验证: <ul><li>应该对 RACE 的片段进行验证 , 以此来确定是否已经扩增了理想的产物。如果得到的是多条带或者研究的是多基因家族的成员,验证是非常有用的。 </li></ul><ul><li>有 3 种验证 RACE 产物的方法: </li></ul><ul><li>( 1 )比较由 GSP 和 NGSP 获得 RACE 产物。 </li></ul><ul><li>( 2 ) Southern blot </li></ul><ul><li>( 3 )克隆并测序 </li></ul><ul><li>我们建议最好测得 RACE 产物的部分序列。有的时候需要嵌套引物的存在。 </li></ul>
  16. 16. 比较由 GSP 和 NGSP 获得 RACE 产物。 <ul><li>对于 5‘ 末端的 RACE 产物,比较由 AP1 和 GSP1 扩增出来的产物和由 AP1 和 NGSP1 扩增出来的产物。 </li></ul><ul><li>对于 3‘ 末端的 RACE 产物,比较由 AP1 和 GSP2 扩增出来的产物和由 AP1 和 NGSP2 扩增出来的产物。这对于鉴定多条带是否是上一个 PCR 的特异性产物是非常有用的。 </li></ul><ul><li>如果条带是正确的,在嵌套 PCR 反应中的条带应该是略微小一些。基本 PCR 和嵌套 PCR 产物的迁移率的不同取决于cDNA结构中 GSP1 和嵌套引物的位置。 </li></ul>
  17. 17. RACE 产物的克隆和测序: <ul><li>可以利用胶回收试剂盒来回收 RACE 产物,此试剂盒适合回收 2.5kb 以下的 RACE 产物;对于长的片段,可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法,最后用 Tricine - EDTA buffer 30μl 重新悬浮 DNA 样品。 </li></ul><ul><li>电泳 5μl 回收的样品来鉴定回收的质量。 </li></ul><ul><li>将回收的 PCR 产物直接克隆到 /A 型的 PCR 克隆载体中。另外还可以利用接头和 / 或 cDNA 合成引物中的 Not1 、 Srf1 、 Xma1 、 ECOR1 等酶切位点,将产物克隆到常规载体中 </li></ul>
  18. 18. - <ul><li>对于 5‘ 端的 RACE 产物,我们建议挑取至少 8 - 10 个不同的克隆以获得 5‘ 端的最大可能性的序列。(反转录并不总是进行到 mRNA 模板的 5’ 末端,尤其是长模板。另外, T4 DNA 聚合酶会移走 5‘ 末端的 0 - 20 个碱基。) </li></ul><ul><li>一旦鉴定了含有插入片断的克隆,应该获得多的序列信息。理想的是,可以对整个开放读码框进行测序。包括 5‘ 和 3‘ 的非翻译区。 </li></ul>
  19. 19. 全长 cDNA 的获得 <ul><li>通过部分或全部测序鉴定了 RACE 产物后,可以通过两种选择获得全长的 cDNA 。 </li></ul><ul><li>通过 PCR 的方法。 </li></ul><ul><li>通过克隆的方法。 </li></ul>
  20. 20. 通过 PCR 的方法获得全长 cDNA : <ul><li>扩增长的 cDNA 需要较长的延伸时间,但是如果延伸的时间过长,可以产生拖带,所以要慎重的设计引物。 </li></ul><ul><li>根据从 5‘ 和 3‘RACE 产物获得序列信息设计 5’ 和 3‘GSP 引物。这些引物应该来自 cDNA 的 3’ 或者 5‘ 的末端,应该是 23 - 28nt 长。不应该在引物的末端加上限制性位点,这样会导致高背景。在某些时候可以设计 3’ 和 5‘ 的嵌套引物。但是还是应该先利用一对引物进行 PCR 反应。 </li></ul>
  21. 21. 通过 PCR 的方法获得全长 cDNA : <ul><li>进行如下的热循环: </li></ul><ul><li>94 度 30 秒 </li></ul><ul><li>25 个循环 94 度 5 秒 </li></ul><ul><li>72 度 2 - 15 分钟 </li></ul><ul><li>延伸的时间应该等于预期的 cDNA 长度加上 2 分钟。例如:预期得到 6kb 的条带,用 6 + 2 = 8 分钟的延伸时间。 </li></ul><ul><li>注意:如果没有条带或者条带弱,增加 5 个循环;或者优化 PCR 的条件。 </li></ul>
  22. 22. 通过 PCR 的方法获得全长 cDNA : <ul><li>在 1.2% 的琼脂糖凝胶上分析 5μl 的样品。通常情况下,可以见到一条单一带,如果这样,利用胶来纯化全长的 cDNA 。 </li></ul><ul><li>制备 1.2% 的 TAE buffer 制备琼脂糖凝胶。不使用 TBE buffer , TBE 的胶很难制备全长的 cDNA 。 </li></ul><ul><li>将剩下的 45μl 反应物点样,选用适当的 marker 。 </li></ul><ul><li>利用长波紫外观察 cDNA (≧ 300nm )切下全长的 cDNA 。注意:应该尽量减少紫外对 cDNA 的照射。 </li></ul>
  23. 23. 通过 PCR 的方法获得全长 cDNA : <ul><li>利用胶回收试剂盒回收 cDNA 。此试剂盒适合回收 2.5kb 以下的 RACE 产物;对于长的片段,可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法,最后用 Tricine - EDTA buffer 30μl 重新悬浮 DNA 样品。 </li></ul><ul><li>将全长的 cDNA 克隆到 T/A 型的 PCR 克隆载体中。 </li></ul>
  24. 24. 通过克隆产生全长的 cDNA : <ul><li>如果你已经获得了含有重叠部分的 5‘ 和 3’RACE 产物,同时在 cDNA 的重叠部分含有一个酶切位点的话,通过克隆技术可以获得全长的 cDNA 。 </li></ul><ul><li>利用酶切获得的 3‘ 和 5’ 扩增产物,并且利用 T4 DNA 连接酶将它们连接起来。利用接头和 cDNA 合成引物中的内切酶将最终的全长 cDNA 克隆到载体中。 </li></ul><ul><li>在哺乳动物基因组中, NOT1 和 Srf1 酶切非常稀少,大约 10 6 bp 才出现一次,因此在绝大多数的 cDNA 中是不出现的。 </li></ul>
  25. 25. Appendix : cDNA 接头和引物 <ul><li>接头在设计的时候可以使 cDNA 的扩增成功进行: </li></ul><ul><ul><ul><li>接头的 5‘ 端在第一个循环中没有 AP1 引物的结合位点。 AP1 的结合位点只有通过 GSP 的扩增之后才能够产生。 </li></ul></ul></ul><ul><li>这些特点中的每一个都可帮助减少 cDNA 片段扩增过程中出现的非特异性扩增。另外,它们允许从一个复杂的 DNA 片段的混合物中扩增出靶样品――所有的产物都有相同的末端结构,因为使用了单一的一套 GSPs 。 </li></ul>
  26. 26. <ul><li>谢谢大家! </li></ul>

×