Tesina per l'obtenció del títol de màster en Bioquímica, Biologia molecular i Biomedicina de la UAB.

1. Wnt controla a través de CK1ε la funció
de p120ctn/Kaiso
Memòria del treball experimental realitzat per l’obtenció del títol de Màster en Bioquímica,
Biologia Molecular i Biomedicina.
Ero Lugilde Iglesias
Bellaterra, Setembre del 2009
1

2. Memòria del treball experimental presentat per Ero Lugilde Iglesias per l’obtenció del títol
del Màster en Bioquímica, Biologia Molecular i Biomedicina.
Treball realitzat a la Unitat de Biofísica del Departament de Bioquímica i Biologia
Molecular de la Universitat Autònoma de Barcelona sota la direcció de la Dra. Mireia
Duñach Masjuan.
2

3. Índex
1.- Introducció
1.1.- Unions adherents ……………………….……......……….....……………………. 1
1.1.1.- Les cadherines: E-cadherina ……………….....……………………….. 2
1.1.2.- Les catenines ……….…………………….....…………………………… 2
1.2.- Regulació expressió gens diana de wnt ……….……………………………....... 4
1.2.1.- Kaiso ………………………………………………………………......….. 4
1.2.2.- TCF ……………………………………………….………………........…. 5
1.2.3.- CK1ε ……………………………………………………………….....…… 5
1.3.- Regulació unions adherents ……………………………….……………....….….. 5
1.3.1.- Regulació E-cadherina ……………………………………………......… 5
1.3.2.- Regulació β-catenina ………………………………………….…....…... 6
1.3.3.- Regulació p120 ……………………………………………………......… 6
2.-Objectius ………………………………....…………………………….………………....…... 8
3.- Materials i mètodes
3.1.- Organismes I condicions de cultiu ……………………….………………….....… 9
3.1.1.- Cultius bacterians ……………………………………………….…....…. 9
3.2.- Línies cel·lulars eucariotes ……………………………….…………………...….. 9
3.2.1.- Manteniment dels cultius cel·lulars …………..…………………......… 10
3.2.2.- Obtenció de medi condicionat amb Wnt .......................................... 10
3.2.3.- Recompte de cèl·lules ………………………..………………………... 11
3.2.4.- Congelació/descongelació/emmagatzematge .……………………... 11
3.3.- Mètodes d’obtenció de l’ADN ………………………………………………....…. 11
3.3.1.- Extracció de l’ADN plasmídic ….…………………………………...….. 11
3.4.- Mètodes d’expressió i purificació de proteïnes …...……………………...……. 12
3.4.1.- Proteïnes recombinants en procariotes ………………………...….…. 12
3

4. 3.4.2.- Expressió i obtenció de proteïnes en línies cel·lulars ………….…… 13
3.4.2.1- Transfeccions transitòries ……………………………….…..... 13
3.4.2.2- Extractes cel·lulars totals, citoplasmàtics i nuclears ……..... 14
3.5.- Tècniques electroforètiques per l’estudi de proteïnes : Western blot ............. 15
3.6.- Assaig de interacció proteïna - proteïna ………………………………………... 15
3.6.1.- Assaig d’unió de proteïnes recombinants ………………………..…... 15
3.6.2.- Assaig de Pull Down …………………………………………….…….... 16
3.6.3.- Assaig de Co-immunoprecipitació ………………………………..…… 16
3.7.- Tampons ......................................................................................................... 17
4.- Resultats …………………………………………………………………………………....... 18
4.1.- Wnt modula de manera inversa la interacció de p120ctn
amb Kaiso i E-
cadherina ................................................................................................................ 18
4.2.- p120ctn interacciona amb la isoforma ε de la família de quinases CK1 ........ 19
4.3.- CK1ε interacciona entre els aminoàcids 234 i 390 de p120ctn ...................... 20
4.4.- Kaiso surt del nucli sota l’estímul de Wnt, sortida que es veu interrompuda per
el silenciament de la CK1ε ...................................................................................... 22
4.5.- Disminueix la interacció entre Kaiso i TCF-4 sota l’estímul de Wnt ............... 23
4.6.- β-catenina augmenta la interacció amb TCF-4 i la disminueix amb Kaiso sota
l’estímul de Wnt ...................................................................................................... 24
5.- Discussió ………………………………………………………………..........……………… 25
6.- Conclusions …………………………………………………………….......……………….. 27
7.- Bibliografia …………………………………………………………….......………………… 29
4

5. 1.- Introducció
1.1.- Unions adherents
Les unions adherents posen en contacte cèl·lules adjacents, a través de la interacció
entre E-cadherines de cèl·lules veïnes amb els filaments d’actina del citoesquelet.
L’establiment de les unions adherents en cèl·lules epitelials és el primer pas per la
formació de qualsevol altre tipus d’unió cel·lular: unions estretes, d’ancoratge i oclusives.
Mutacions en els gens codificants de les proteïnes relacionades amb aquest sistema,
o la desregulació de l’expressió d’aquestes, resulten sovint en la pèrdua de l’ordre tissular,
pèrdua de la diferenciació, i augment de la invasivitat i malignitat dels tumors.
Aproximadament un 90% de tots els càncers humans s’originen per anomalies en la
proliferació de cèl·lules epitelials (Walther & Kerr, 2009).
La base de l’estructura de les unions adherents la formen les cadherines,
glicoproteïnes de membrana que en presència de Ca2+ poden formar unions homotípiques
amb les cadherines de les cèl·lules veïnes. El domini citoplasmàtic de la E-cadherina
interacciona amb el citoesquelet d’actina a través
d’unes proteïnes pont que són la β-catenina, l’αcatenina i l’eplina.
Aquesta
unió
cadherines-citoesquelet
és
necessària per un correcte establiment de les unions
adherents. El complex s’ha de trobar complet i unit al
citoesquelet per a ésser funcional. Així l’E-cadherina
s’uneix directament a la β-catenina, aquesta a l’αcatenina i aquesta última interacciona amb el
citoesquelet a través de l’eplina (William & Nelson,
2006).
Figura 1. Estructura de les unions adherent
5

6. 1.1.1.- Les cadherines: E-cadherina
Són una gran família de molècules d’adhesió, amb més de 80 membres. Es
divideixen en subfamílies segons les diferències estructurals. Les cadherines més
estudiades són les de tipus I o clàssiques, i majoritàriament, són les que formen part de
les unions adherents. Aquestes unions són dinàmiques i s’estableixen entre cèl·lules de
teixits epitelials (E-cadherina) o neuronals (N-cadherina).
Les cadherines estan formades per una regió extracel·lular, que té cinc subdominis
d’uns 100 aminoàcids cadascun, un únic domini transmembrana i un domini citoplasmàtic.
La regió extracel·lular és responsable de la formació dels contactes intercel·lulars, a través
d’una unió homotípica amb les cadherines de les cèl·lules veïnes. Aquesta unió entre
cadherines és depenent de Ca2+ (Overduin et al., 1995; Shapiro et al., 1995).
L’E-cadherina és una glicoproteïna de 850 aminoàcids i la cadherina més
representativa en el teixit epitelial. Les molècules d’E-cadherina d’una mateixa cèl·lula
formen dímers paral·lels. Aquest dímer és la unitat funcional (Brieher et al., 1996), i s’uneix
a dímers de cèl·lules adjacents formant una espècie de cremallera. El domini citoplasmàtic
de la E-cadherina consta d’uns 150 aminoàcids on s’uneixen les catenines. La pèrdua
d’unió al citoesquelet comporta la pèrdua de la funcionalitat de les unions adherents
(Pokutta and Weis, 2000).
1.1.2.- Les catenines
Les catenines que formen part de les unions adherents són: α-catenina, β-catenina i
p120-catenina, de les quals només les dues últimes s’uneixen directament a E-cadherina.
La disrupció de la unió entre β-catenina amb α-catenina o E-cadherina provoca la pèrdua
de l’adhesió entre cèl·lules.
1.1.2.1.- α-catenina
L’α-catenina és una proteïna de 102 kDa amb tres regions d’elevada homologia a
vinculina. Aquesta proteïna es presenta com a homodímer en solució, i es dissocia en
unir-se amb β-catenina (Koslov et al., 1997).
6

7. La sobreexpressió d’α-catenina té efectes antiproliferatius. Sembla que la unió de βcatenina a α-catenina inhibeixi la unió del complex β-catenina/TCF-4 al DNA (Giannini et
al., 2000a).
1.1.2.2.- β-catenina
La β-catenina té una estructura que està formada per un domini central anomenat
armadillo i extrems N- i C-terminals, d’uns 100 aminoàcids cadascun. El domini armadillo
consta de dotze repeticions de 42 aminoàcids cadascuna (Huber and Weis, 2001). Per
aquesta regió, β-catenina interacciona amb la majoria de factors.
A més de formar part de les unions adherents, una altra funció de β-catenina és
actuar com a coactivador transcripcional de gens implicats en el desenvolupament i en
mantenir la capacitat proliferativa de les cèl·lules. La ruta de senyalització de Wnt
estabilitza la β-catenina i (Behrens et al., 1996; Korinek et al., 1997) facilita la seva
translocació al nucli, on s’uneix a factors de transcripció de la família TCF/LEF1, i activar
la transcripció de gens regulats pel complex β-catenina/TCF-4.
1.1.2.3.- p120-catenina (p120ctn)
La p120-catenina (p120ctn) és una proteïna amb diferents isoformes produïdes per
splicing, donant lloc a proteïnes amb extrems terminals més curts, d’entre 85-115 kDa.
p120ctn s’uneix a la regió juxtamembrana d’E-cadherina, però no interacciona amb βcatenina, ni α-catenina (Daniel and Reynolds, 1995). També conté un domini armadillo
central amb 10 repeticions de 42 aminoàcids i un domini N-terminal de 325 aminoàcids
que té una funció reguladora (Reynolds, 2007). L’associació de p120ctn amb Kaiso i Ecadherina té lloc pel domini central armadillo; altres cofactors com les tirosina quinases
Fer o Fyn (Kim and Wong, 1995) o la RhoA GTPasa (Castaño et al., 2007; Yanigisawa et
al., 2008) interaccionen per l’extrem N-terminal (Reynolds, 2007).
p120ctn està implicada en l’agrupament i la dimerització lateral de les cadherines
(Anastasiadis and Reynolds, 2000) i en l’estabilització de cadherines a la membrana
plasmàtica (Chen et al., 2003; Davis et al., 2003; Xiao et al., 2003). Aquesta proteïna
7

8. també està implicada en la regulació de l’activitat de les proteïnes G monomèriques RhoA,
Rac i Cdc42, i s’ha descrit que està implicada en els moments posteriors a la formació
d’una adhesió inicial (Nakagawa et al., 2001).
Igual com passa amb β-catenina, la p120ctn també té un paper en la regulació de la
transcripció. Quan no està unida a E-cadherina, p120ctn pot interaccionar amb el
repressor transcripcional Kaiso (Daniel and Reynolds, 1999). Estudis realitzats amb
Xenopus Laevis han demostrat que p120ctn allibera la repressió causada per Kaiso en els
gens diana de Wnt (Park et al., 2005).
1.2.- Regulació de l’expressió dels gens diana de wnt
1.2.1.- Kaiso
Proteïna que pertany a la família dels factors de transcripció BTB/POZ. Està
implicada en desenvolupament i càncer. Consta de un domini N-terminal BTB/POZ molt
conservat i de tres dits de zenc en la segona meitat de la proteïna. El domini BTB/POZ
permet la homodimerització i en certs casos permet la heterodimerització (Albagli and
Leprince, 1995).
Kaiso té la capacitat d’entrar i sortir del nucli en funció de p120ctn. Quan Kaiso no
està interaccionant amb p120ctn, pot unir-se a TCF-4 i impedir la unió de TCF-4 al DNA, i
reprimir per tant la transcripció de gens dependents de Wnt. La interacció de p120ctn amb
Kaiso, allibera TCF-4 facilitant l’activació d’aquest gens dependents de β-catenina/TCF-4.
Segons Ruzov et al. (2009a, 2009b) la inhibició de la via de Wnt per Kaiso és depenent de
la associació amb TCF-3/4, el qual exclou la unió d’aquest factor al DNA. Kaiso a més
d’unir-se a TCF-4 també es pot unir directament a seqüències específiques metilades del
DNA. Quan Kaiso s’uneix al DNA recluta co-repressors tals com NCOR1, SIN3A o
Groucho, pas imprescindible per la repressió mediada per Kaiso.
8

9. 1.2.2.- TCF-4
Efector de la via de wnt. Proteïna nuclear de 80 kDa, conté un domini N-terminal de
unió a β-catenina, seguit de un domini TLE de unió al co-represor Groucho, un domini
central HMG d’unió a DNA i un extrem C-terminal d’unió a la proteïna CtBP. El domini
HMG reconeix la seqüència A/TA/TCAAA. La unió de β-catenina a TCF desplaça el corepressor Groucho i permet l’activació dels gens dependents d’aquest complex βcatenina/TCF-4. Es postula que la unió de Kaiso a TCF-4 es produeix per el domini HMG
de TCF-4, i que aquesta interacció exclou la unió de TCF-4 al DNA (Ruzov, et al., 2009).
1.2.3.- CK1ε
S’ha descrit que la proteïna quinasa CK1ε es un efector positiu en la via de Wnt (Price,
2006). L’expressió de CK1ε estabilitza la β-catenina en embrions de Xenopus i en les
cèl·lules HEK293, i estimula la transcripció depenent de β-catenina/TCF-4 en aquesta
mateixa línia cel·lular (Peters et al., 1999; Sakanaka et al., 1999). També s’ha vist que
l’addició de CK1ε bloqueja la degradació de β-catenina en cultius de cèl·lules de Xenopus
(Gao et al. 2002).
1.3.- Regulació de les unions adherents
Les interaccions proteïna - proteïna són punts potencials de regulació. El grup a
descrit que la fosforilació de β-catenina i p120ctn juga un paper important en la regulació
dels complexos d’adhesió. La fosforilació de β-catenina i p120ctn permet la seva
alliberació del complex fent possible la seva funció com a coactivadors transcripcionals.
1.3.1.- Regulació de la E-cadherina
Es regula a nivell transcripcional. Un dels passos limitants en la formació dels
complexos d’adhesió és el seu nivell d’expressió (Gumbiner, 2000). La transcripció està
constitutivament activa en les cèl·lules epitelials, i aquesta es pot estimular per factors
9

10. com Wnt-1 o la Vitamina D, o inhibir-se per membres de la família Snail (Batlle et al.,
2000).
1.3.2.- Regulació de β-catenina
En cèl·lules epitelials els nivells de β-catenina es troben regulats de forma molt
precisa. Quan la β-catenina no es troba formant part de les unions adherents, s’uneix a un
complex de degradació format entre altres factors, per GSK3β, APC i axina. Una
fosforilació prèvia de β-catenina per CKIα (Ser45) [Revisat a (Polakis, 2002)], causa la
fosforilació seqüencial d’aquesta per GSK3β en quatre residus de l’extrem N-terminal.
Aquesta fosforilació és reconeguda per una ubiquitina lligasa i n’indueix una ràpida
degradació pel sistema ubiquitin-proteosoma (Xing et al., 2003).
La fosforilació de β-catenina en tirosines té un paper important en la regulació de les
unions adherents. Així, la fosforilació de la Tyr654 de β-catenina fa disminuir la seva
interacció amb E-cadherina mentre que la fosforilació en la Tyr142 inhibeix la unió a αcatenina (Piedra et al., 2001, 2003). La fosforilació de β-catenina en residus de tirosina
provoca la pèrdua de les unions, augmentant la seva fracció lliure en el citoplasma. La
defosforilació d’aquesta provoca un reensamblament dels complexos (Hu et al., 2001). El
pas de β-catenina al nucli, depèn dels nivells de β-catenina lliure al citoplasma. L’activació
de la via de Wnt o l’alteració d’alguna de les proteïnes del complex de degradació (fet
comú en la majoria de tumors de colon i en altres tumors epitelials), eviten la degradació
de la β-catenina lliure. Aquest augment de β-catenina lliure al citoplasma, permet la seva
translocació al nucli, unir-se a factors de la família TCF-4/Lef-1 i activar la transcripció de
gens implicats en mantenir la capacitat proliferativa de les cèl·lules.
1.3.3.- Regulacio de p120.
La regulació de la activitat de p120ctn es produeix per fosforilació/defosforilació del
domini N-terminal. Treballs molt recents del grup han identificat que la p120ctn es fosforila
per CK1 en la Ser268 i aquesta modificació inhibeix la interacció amb E-cadherina mentre
que facilita la unió de p120ctn a Kaiso. A més, aquesta fosforilació és induïda per Wnt i
10

11. contribueix a l’eliminació de la repressió ocasionada per Kaiso sobre gens diana de Wnt.
En cèl·lules deficients per p120ctn o CK1ε, no s’observa l’estabilització de β-catenina
induïda per Wnt.
11

12. 2.- Objectius
Aquest estudi forma part d’un projecte més ampli que pretén aprofundir en el control
de l’expressió gènica per les unions adherents en les cèl·lules epitelials, concretament
analitzar el paper de la p120-catenina.
- Els objectius concrets d’aquest treball són:
· Caracteritzar el domini d’interacció de CK1ε en p120ctn
· Determinar el paper de CK1ε en el canvi de la localització de Kaiso induït per p120ctn.
· Estudiar la interacció entre Kaiso i TCF-4, així com la modulació per factors Wnt
d’aquesta interacció.
12

13. 3.- Materials i Mètodes
3.- Organismes i condicions de cultiu
3.1.- Cultius bacterians
· Per obtenir ADN/proteïna utilitzem la soca DH5α de E. Coli.: fhuA2
(argF-lacZ)U169
phoA glnV44 Φ80 (lacZ)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17
· Per obtenir proteïna recombinant amb alta eficiència utilitzem la soca E. coli BL21 DE3
RIL: E. coli B F- ompT hsdS(rB- mB-) dcm+ Tetr gal λ(DE3) endA Hte [argU ileY leuW Camr]
Conté tRNA: ArgU (AGA, AGG), ileY (AUA), leuW (CUA). Clonat dins pACYC184
3.1.1.- Medi de cultiu bacterià
Pel creixement de la soca bacteriana es va utilitzar LB, un medi ric, en forma líquida
o sòlida. El medi s’esterilitza amb un autoclau (121ºC, 20min). Per la selecció dels bacteris
transformats s’afegeix antibiòtic al medi, a una concentració final depenent de l’antibiòtic a
utilitzar (Ampicilina 150mg/l, Kanamicina 30mg/l, Cloranfenicol 50mg/l). El medi sòlid,
després d’afegir-hi l’antibiòtic (un cop autoclavat i quan la temperatura del medi es inferior
als 50ºC), s’aboca sobre plaques de Petri en ambient estèril, i es deixar solidificar en
aquesta mateixa atmosfera (campana de flux laminar). S’emmagatzema a 4ºC fins a tres
mesos. Les condicions per fer el cultiu són de 37ºC sense agitació pel medi sòlid, i amb
agitació en medi líquid (110-220rpm). Les condicions d’emmagatzemament de les colònies
un cop transformades són a 4ºC durant 4-6 setmanes per medi sòlid, i d’anys a -80ºC pel
medi líquid complementat amb 15% glicerol.
3.2.- Línies cel·lulars eucariotes
· SW480: línia cel·lular humana d’adenocarcinoma de colon. Es troben en estadi tumoral
Duke’s B. Tenen un fenotip epitelial i creixen en adherència. Presenten una mutació en el
gen APC (adenomatous polyposis coli) que provoca una acumulació de β-catenina.
· HEK-293T: línia cel·lular humana embrionària de ronyó. Tenen un fenotip epitelial i
creixen en adhesió. Han estat transformades amb l’Adenovirus 5.
13

14. · L-cells/L-cells Wnt3a: línies cel·lulars derivades de la línia L-M(TK-) cells, procedents
de teixit connectiu subcutani de ratolí. Tenen un fenotip fibroblàstic i creixen en adhesió.
Les Wnt3a són clons estables seleccionats on s’ha integrat un plasmidi codificant per
aquest factor.
3.2.1.- Manteniment dels cultius cel·lulars
Les diferents línies cel·lulars es mantenen amb D-MEM (Dulbecco’s Modified
Eagle’s Medium) (Reactiva) amb un 10% de sèrum de fetus boví (FCS) (Biological
Industries) en flascons T-30/75. Aquest medi és complementat amb piruvat sòdic,
glutamina, aminoàcids no essencials i penicil·lina/streptavidina com a antibiòtics
(Promega, Gibco, Reactiva). Es creixen les cèl·lules a 37ºC amb 5% de CO2.
Quan les cèl·lules arriben a la confluència, s’elimina el medi rentant amb PBS i es
tracten amb tripsina (Gibco). Es recullen les cèl·lules en suspensió en un flascó i s’elimina
la tripsina del medi centrifugant a 900 rpm i decantant el sobrenedant. Les cèl·lules es
resuspenen en medi fresc i es sembra una alíquota en un flascó.
3.2.2.- Obtenció de medi condicionat amb Wnt
Aquest medi condicionat, així com el seu control, s’ha obtingut de L-cells Wnt3a i Lcells parentals. El manteniment de la línia cel·lular s’ha realitzat en condicions normals,
afegint selecció de puromicina en el cas de les L-cells Wnt3a per tal de mantenir la
expressió d’aquesta característica.
Per obtenir el medi es sembra una desena part de les cèl·lules en suspensió en
plaques de petri, sense antibiòtic, per tal de no afectar a les cèl·lules que volem estimular
posteriorment. Als 4 dies es recull el sobrenedant de les plaques (1er lot) i es substitueix
per medi fresc. Als 3 dies es torna a recollir el sobrenedant (2on lot). S’eliminen les
cèl·lules sembrades en aquestes plaques ja que han crescut massa i i ja no son útils. Els
dos lots de medi es centrifuguen per eliminar les partícules cel·lulars que s’hagin desprès
del cultiu i s’ajunten. Aquest medi es pot guardar a 4ºC durant setmanes, o a -20ºC durant
mesos.
14

15. 3.2.3.- Recompte de cèl·lules
Per determinar el nombre de cèl·lules que conté la suspensió un cop tripsinitzada,
s’utilitza un microscopi òptic i una càmera de Neubauer. Permetent-nos comptabilitzar les
cèl·lules presents en un volum conegut de suspensió i calcular la concentració de cèl·lules
que tenim. S’addiciona Tripan Blue (Sigma) a la barreja de la càmera per controlar la
integritat de les cèl·lules, descartant sempre els cultius que presenten tincions positives
superiors al 5%.
3.2.4.- Congelació/descongelació/emmagatzemament
Per conservar les cèl·lules durant un període llarg de temps, es resuspenen de 25.106 cèl·lules en 900 µl de D-MEM + 10% FCS i es posen en un criotub, on prèviament
hem introduït 100 µl de dimetilsulfòxid (DMSO) (Sigma). El criotub es congela en un Cryo
1ºC freezyng container (NalgeneTM) dins d'un congelador de -80 ºC, permetent una
disminució gradual de la temperatura fins a -80ºC. Finalment es dipositen en un banc de
nitrogen líquid.
Per la descongelació de la línia cel·lular, aquesta es posa en un bany per arribar
ràpidament a 37ºC un cop extreta del banc de nitrogen líquid. Quant el medi està gairebé
descongelat es recull i dilueix en 10ml D-MEM + 10% FCS. Aquest es centrifuga i decanta
per eliminar el DMSO, es resuspèn i sembra el pellet restant en un flascó.
3.3.- Mètodes d’obtenció del DNA
3.3.1- Extracció del DNA plasmídic
A partir d’un cultiu líquid saturat de bacteris, podem aïllar el seu DNA plasmídic per
ser digerit, subclonat, transformat o transfectat. En aquest treball per obtenir el DNA amb
diferents graus de puresa s’han utilitzat els kits comercials WizardR Plus SV Minipreps
(Promega) o Maxipreps (Quiagene), seguint les seves instruccions per tal d’extreure el
DNA per a les diferents utilitzacions.
15

16. 3.4.- Mètodes d’expressió i purificació de proteïnes
3.4.1.- Proteïna recombinant en procariotes
A partir d'una colònia de E. coli transformada amb un pGEX on hem introduït la
proteïna desitjada, es creix una petita alíquota 16h a 37ºC/220rpm en LB-ampicil·lina. A
continuació es fa una dilució 1:100 del cultiu en el mateix medi i es manté a 37ºC/220rpm
fins a assolir una densitat òptica a 600nm de 0,6-0,8 (aquest valor ens indica que el cultiu
es troba en la fase exponencial del seu creixement). En aquest punt s’indueix l’expressió
dels productes codificats el en pGEX afegint 0'1mM de IPTG (isopropil β-D-tiogalactosid)
mantenint les mateixes condicions de creixement. Després de 2h d’inducció es
centrifuguen les cèl·lules a 8000rpm/4ºC durant 10'.
Depenent de la solubilitat de la proteïna, procedirem a seguir una lisis diferent:
- Proteïnes solubles: El sediment es resuspèn en PBS. A continuació, es lisen els
bacteris sotmetent la barreja a sonicació durant 15'' en petites alíquotes de 1 ml. S’afegeix
Tritó X-100 (Sigma) a una concentració final de l'1% per ajudar a solubilitzar les proteïnes.
Es centrifuga a 10.000rpm/4ºC durant 10' i es descarta el pellet (conté fragments de
membrana i altres restes cel·lulars).
- Proteïnes poc solubles: El sediment es resuspèn en STE + lysozim. Es deixa
reposar 15' a 4ºC. S’afegeix Sarcozyl a 1% final i es vorteja 1'. A continuació es sotmet la
barreja a sonicació durant períodes alternats de sonicació/repòs de 30'. S’afegeix Tritó X100 (Sigma) a una concentració final de l’1% i es centrifuga a 10.000rpm/4ºC durant 20'.
Es descarta el pellet. S’afegeix un 2% més de Tritó X-100 i es vorteja 2'.
Per aconseguir la proteïna d’interès s’incuba el sobrenedant (barreja de proteïnes
bacterianes amb la que volem) amb un volum 1:100 (v:v) de resina Glutatione-Sepharose4B (Pharmacia). Aquesta resina duu glutatió unit a la superfície permetent així una unió
específica a GST. S’aconsegueix així en un sol pas de cromatografia la retenció a la
16

17. resina de la proteïna d’interès. Per descartar la resta de proteïnes es renta la resina varies
vegades amb PBS.
En aquest punt podem escollir si volem obtenir la proteïna sola o la proteïna de fusió amb
la GST. Els diferents passos són:
- Per obtenir la proteïna unida a GST: la resina s’incuba amb 20 mM de glutatió
reduït (Sigma) en 50 mM Tris pH 8'0. S’aconsegueix així separar la GST del glutatió unit a
la resina (aquesta proteïna té més afinitat pel glutatió reduït que per l’oxidat unit a la
resina). Per eliminar tot el glutatió del medi es posa el sobrenedant en un sac de diàlisi, i
es dialitza durant 20h a 4ºC canviant repetidament el tampó de diàlisis que utilitzem.
- Per obtenir la proteïna sense GST: s’incuba amb el tampó de tall de la
PreScission Protease (PSP) (Amersham-Pharmacia). S’afegeix 1 unitat de PSP per cada
50µg de proteïna de fusió i es manté la barreja a 4ºC de 4 a 16h en agitació.
Finalment recollim el sobrenedant i el conservem a -20 ºC amb 50% de glicerol.
Per determinar el grau de puresa de les proteïnes recombinants (unides a GST o en
forma lliure) es va utilitzar l’electroforesi monodimensional en gels de poliacrilamida seguit
d'una tinció de Comassie (Apartat Electroforesi de gels de poliacrilamida. SDS-PAGE
(Laemmli)). Comparant després per densitometria amb un escàner GS-700 (BIO-RAD) la
intensitat de les bandes d’interès amb quantitats conegudes d’albúmina sèrica bovina
(BSA) (SIGMA).
3.4.1.- Expressió i obtenció de proteïnes en línies cel·lulars
3.4.1.1- Transfeccions transitòries
Es tripsinitzen, resuspenen i compten les cèl·lules. Es sembren de 2-5·104
cèl·lules/cm2 en plaques de mida adient a l’experiment a realitzar. Les cèl·lules s’incuben
entre 16-24h fins a aconseguir una confluència entre 50-80%. Segons el tipus cel·lular i la
seva dificultat en la transfecció utilitzem un o altre protocol.
- PEI: proporciona una transfecció adequada en moltes línies cel·lulars, però
algunes són molt resistents a la transfecció i aquest mètode no és possible. Degut a la
17

18. toxicitat d'aquest producte és recomanable canviar el medi entre 6-12h després de la
transfecció.
La quantitat d'ADN que s’utilitza va en funció de la mida de la placa. Es barreja en
un tub 125 µl de medi sense antibiòtics per cada µg d'ADN. Sobre aquesta barreja es
posen 10 µl de PEI per cada µg de DNA i es vorteja uns 15''. Es deixa reposar a
temperatura ambient 20' i s’afegeix a la placa.
- Lipofectamina 2000: Seguint les instruccions del fabricant, per cada cm2 de
superfície de placa on tinguem sembrades les cèl·lules es barregen 0,4 µg d’ADN amb 25
µl d’Opti-MEMR (Life Technologies). Paral·lelament es prepara una segona solució amb 1
µl de Lipofectamine 200 (Invitrogen) en 25 µl d’Opti-MEMR també per cada cm2. Després
d’un temps d’incubació de 5’, es barregen les dues solucions i la barreja de transfecció
resultant s’incuba 20’ més a temperatura ambient. Es substitueix el medi de les plaques
sembrades per Opti-MEMR + 10%FCS i s’afegeix a les cèl·lules la barreja de transfecció.
Passades 3-5h es canvia el medi de les plaques per D-MEM + 10%FCS fresc.
Un cop passades entre 12-72h, temps suficient per permetre l’expressió dels
productes d’interès, es procedeix a recuperar les cèl·lules.
3.4.2.2- Extractes cel·lulars totals, citoplasmàtics i nuclears
Per extreure les proteïnes de les cèl·lules hem utilitzat diferents tipus d’extractes
depenent del que es volia obtenir. Les plaques amb el cultiu de cèl·lules es van rentar amb
PBS. Un cop retirat el PBS, s’afegeix tampó de lisi (la quantitat depèn de la superfície de
la placa). Es fa un scraping de les plaques i el lisat es recull en un eppendorf. Aquest lisat
es deixa 10-30’ a 4ºC en agitació, s’homogeneïtza, es centrifuga i es recull el sobrenedant,
que es conserva a -20ºC.
- Extractes tipus Kemler: Per aconseguir una lisis suau, i extreure majoritàriament les
proteïnes del citoplasma, conservant la majoria d’interaccions proteiques, s’utilitza tampó
de lisi tipus Kemler, homogeneïtzant amb xeringa i centrifugant 15' a 12.000 rpm.
18

19. - Extractes NP-40: Per a obtenir una lisis més forta utilitzem entre un 0,1-1% de NP-40
segons la lisis que volem aconseguir. Els extractes s’homogeneïtzen amb xeringa i es
centrifuguen 10' a 14.000 rpm.
- Extractes RIPA: Per aconseguir una lisis més forta i extracció de gairebé totes les
proteïnes cel·lulars, conservant només les interaccions més fortes, s’utilitza el tampó de
lisi tipus RIPA. S’homogeneïtza amb xeringa i centrifuga 10' a 14.000 rpm.
- Extractes fraccionats: Per aconseguir extractes nuclears, es procedeix fent extractes
citoplasmàtics amb tampó Kemler, però conservant el sediment després de la
centrifugació. Sobre aquest sediment es fa una extracció tipus RIPA, i el sobrenedant
d’aquesta és el que considerem extractes nuclears.
3.5.- Tècniques electroforètiques per a l’estudi de proteïnes: Western
blot:
Per tal d'analitzar les proteïnes recombinants obtingudes en els cultius i els resultats
dels experiment realitzats es va utilitzar l’electroforesi unidimensional en gels de
poliacrilamida, seguint el mètode de Laemli. (Roure et al, 1999)
3.6.- Assaig d’interacció proteïna-proteïna
3.6.1.- Assaigs d’unió amb proteïnes recombinants
Els diferents assaigs d’interacció es duen a terme incubant les quantitats indicades
de les diferents proteïnes recombinants, en un volum final de 200 µl tampó de binding
durant 25-30' a 25ºC. Els complexos formats s’aïllen afegint 20 µl de resina efectiva
Glutatió-Sepharosa 4B (Sigma), que reté específicament la GST i incubant 25' a 25ºC.
Seguidament es renta la resina x3 amb 500 µl de tampó de binding per eliminar les restes
de proteïna lliure, no unida a la resina a traves de GST. Els complexos retinguts per la
resina es solubilitzen afegint tampó de carrega d’electroforesis i bullint les mostres 5'.
19

20. Els complexos solubilitzats s’analitzen per electroforesi de poliacrilamida (SDSPAGE), i posteriorment el gel es transfereix a una membrana de nitrocel·lulosa per ser
analitzat per Western Blot. En tots els casos es realitzen controls amb la proteïna GST
sola per eliminar la possible associació inespecífica a la GST.
3.7.2.- Assaigs de Pull-Down
Els assaigs de Pull-Down es van realitzar incubant les quantitats indicades de
proteïna recombinant unida a GST o GST sola com a control, amb una quantitat fixa
d’extractes cel·lulars, en un volum final de 500 µl en tampó de lisis corresponent durant 45'
a 25ºC o 2-16 h a 4ºC. Els complexos formats s’aïllen afegint 20 µl de resina efectiva
Glutatió-Sepharose 4B (Sigma) 25' a 25ºC o 45º a 4ºC. Seguidament es renta la resina x3
amb 500 µl de PBS + 0,1-0,5% NP-40 per eliminar les restes de proteïna lliure, no unida a
la resina a través de GST. Els complexos proteics s’elueixen directament amb tampó de
carrega, i posteriorment s’analitzen per Western Blot. En tots els casos es realitzen
controls amb la proteïna GST sola per eliminar la possible associació inespecífica a GST.
3.7.3.- Assaigs de Co-Immunoprecipitació
S’incuba 250-750 µg d’extractes cel·lulars amb 1 µg/ml de l’anticòs corresponent,
en un volum final de 250-750 µl en tampó de lisis durant 2-16h a 4ºC en agitació. Es
centrifuga el material insoluble 2' a 14.000 rpm i es descarta el sediment. El sobrenedant
s'incuba durant 90' a 4ºC amb 20 µl de proteïna G-Sepharose (Sigma).
Quan s'ha utilitzat un anticòs d’hibridoma procedent de sobrenedant de cultiu
cel·lular, primer s’incuba aquest sobrenedant amb 20 µl de proteïna G-sepharosa (Sigma)
per tal d’unir prèviament l’anticòs a la resina, i es renta aquesta amb PBS x3 amb 500 µl
de PBS. Posteriorment s’incuba aquesta reïna amb els extractes cel·lulars. El material
immunoprecipitat es renta x3 amb 750 µl de PBS + 0,1-0,5% NP-40. Els complexos
proteics s’elueixen directament amb tampó de carrega, i posteriorment s’analitzen per
Western Blot amb anticossos específics contra les proteïnes que es volen analitzar.
20

21. 3.8.- Tampons:
GEB: 20 mM glutatió reduït (SIGMA), 50 mM Tris-HCl pH 8,5, 100 mM NaCl
LB: 0,5% p/v extracte de llevat, 1% p/v bacto-triptona, 170 mM NaCl, pH 7'0
LB-Agar: 0,5% p/v extracte de llevat, 1% p/v bacto-triptona, 170 mM NaCl, 1,5% d’agar,
pH 7'0
PBS: 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4/1,8 mM KH2PO4 (pH 7,4)
PEI: 1 mg/ml PEI en H2O miliQ, ajustar a pH 7,0 amb HCl i esterilitzat per filtració amb
filtres de 0,22 µm.
STE: 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA
Tampó de binding: 50 mM Tris pH 7,8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 3 mM
MgCl2, 0,1% (p/v) Tritó X-100, Inhibidors de proteases i fosfatases
Tampó de càrrega: Tris 100 mM pH 6,8, 4% glicerol, 2% SDS, 0,06% 2-b-mercaptoetanol
Tampó de diàlisis: 25 mM Tris pH 8,3, 120 mM NaCl, 1 mM EDTA i 1 mM DTT
Tampó de lisis típus Kemler: 25 mM Tris pH 7,6, 210 mM NaCl, 1 mM EGTA, 0,1%
Nonidet-40, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 3 mM aprotinina, 10 mM leupeptina, 10 mM
pepstatina, 1 mM PefaBlock, 1 mM NaF, 2,5 mM β-glicerolfosfat, 0,5mM Va3+
Tampó de lisis NP-40: 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4/1,8 mM KH2PO4 (pH
7,4), 0,25-1% Nonidet-40, 3 mM aprotinina, 10 mM leupeptina, 10 mM pepstatina, 1 mM
PefaBlock, 1 mM NaF, 2,5 mM β-glicerolfosfat, 0,5mM Va3+
Tampó de tall de la PSP: 50 mM Tris pH 7,8, 120 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA
Tampó de lisis RIPA: 25 mM Tris pH 7,6, 210 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% Nonidet-40,
0,5% deoxicolat sòdic, 0,1% SDS, 3 mM aprotinina, 10 mM leupeptina, 10 mM pepstatina,
1 mM PefaBlock, 1 mM NaF, 2,5 mM β-glicerolfosfat, 0,5mM Va3+
21

22. 4.- Resultats
4.1.- Wnt modula de manera inversa la interacció de p120ctn amb Kaiso i Ecadherina
La p120ctn pot estar unida a l’E-cadherina i/o al repressor transcripcional Kaiso, a tots dos
s’uneix de manera excloent per la regió armadillo. En les cèl·lules epitelials p120ctn es
troba majoritàriament unida a l’E-cadherina. Donat que in vitro altres membres del grup
havien trobat que p120ctn es fosforila per CK1, regulant de manera inversa la interacció
de p120 amb E-cadherina i Kaiso i havent estat descrit que CK1 es un efector de la via de
Wnt, vam voler analitzar si l’activació d’aquesta via podia induir l’alliberació de p120ctn del
complex d’adhesió, i afavorir la seva interacció amb Kaiso. Es va immunoprecipitar
p120ctn de cèl·lules SW480 control i estimulades durant 5 h amb factor Wnt3a. El resultat
es analitzat per Western blot amb anticossos específics per l’E-cadherina i Kaiso. A la
figura 2 s’observa com en les cèl·lules activades amb Wnt3a, la p120ctn disminueix la
seva interacció amb E-cadherina i augmenta amb Kaiso, indicant que p120ctn s’allibera
del complex d’adhesió cel·lular.
Fig. 2. Wnt modula de manera inversa la interacció de p120ctn amb Kaiso i E-cadherina. Es va
immunoprecipitar p120ctn d’extractes totals de cèl·lules SW480 control i estimulades amb Wnt3a (protocol
descrit a materials i mètodes). WB amb anticossos específics anti p120ctn, E-cadherina, Kaiso i actina per
normalitzar.
22

23. 4.2.- p120ctn interacciona amb la isoforma ε de la família de quinases CK1.
Està descrit que la isoforma CK1ε és un efector positiu de la via de Wnt (Price, 2006) i que
estimula la transcripció depenent de β-catenina/TCF-4. Experiments anteriors del grup
havien demostrat que la quinasa CK1 interacciona amb p120ctn i la fosforila. Es per això
que vam voler identificar la isoforma de CK1 responsable de fosforilar p120ctn in vivo. Es
va immunoprecipitar p120ctn d’extractes cel·lulars SW480 per analitzar si alguna isoforma
interaccionava amb la p120ctn. Com es mostra a la figura 3A, es va poder detectar CK1ε
com el membre de la família que interacciona amb p120ctn, mentre que no ho fa una IgG
irrelevant. Altres isoformes com la CK1α, no estaven presents en l’immunocomplex.
A continuació es va analitzar si aquesta interacció de p120ctn amb CKIε varia al
activar la via de Wnt. Per això es va immunoprecipitar p120ctn de cèl·lules SW480 control
i estimulades per Wnt3a. Com es pot observar a la figura 3B, la interacció de p120ctn amb
CK1ε es manté constant en les cèl·lules control i en les activades amb Wnt3a, el que fa
pensar que CK1ε es manté unida a p120ctn tant quan aquesta es troba formant part del
complex d’adhesio, com quan es troba unida al repressor kaiso.
23

24. Fig. 3. p120ctn interacciona amb la isoforma CK1ε i aquesta interacció no canvia en estimular les
ε
cèl·lules amb Wnt3a. A) Es va immunoprecipitar p120ctn d’extractes totals de cèl·lules SW480 (protocol
descrit a materials i mètodes) i les proteïnes associades es van analitzar per WB amb anticossos específics
anti p120ctn, CK1ε, CK1α, i actina per normalitzar. B) Es va immunoprecipitar p120ctn d’extractes totals de
cèl·lules SW480 control i estimulades amb Wnt3a (protocol descrit a materials i mètodes). WB amb
anticossos específics anti p120ctn, CK1ε, i actina per normalitzar.
4.3.- CK1ε interacciona entre els aminoàcids 234 i 390 de p120ctn .
Per tal de mapejar la regió de p120ctn per on interacciona CK1ε, es van utilitzar diferents
construccions de p120ctn disponibles al laboratori i que es mostren en la figura 4.
Fig. 4. Diagrama dels fragmenta de p120ctn utilitzats en aquest treball per caracteritzar el domini
d’interacció amb CK1ε.
Es van expressar i purificar els diferents mutants delecionats de p120 units a GST i es va
fer un assaig de pull-down de CK1ε utilitzant com a font d’aquesta quinasa extractes
24

25. cel·lulars totals de cèl·lules SW480. Es van incubar, per separat, els mateixos pmol dels
diferents fragments de p120ctn-GST amb els extractes totals.
Fig. 5. CK1ε interacciona entre els aminoàcids 234 i 390 de p120ctn. Assaigs de pull down de CK1ε es
van dur a terme incubant 10 pmols dels diferents mutants delecionats de p120ctn fusionats a GST o GST
sola amb extractes totals de cèl·lules SW480 (protocol descrit a materials i mètodes). On s’indica es van
afegir 20 pmols de p120ctn (1-347) a la incubació. Els complexos proteics es van purificar i analitzar per WB
amb anticossos específics anti CK1ε i anti GST per normalitzar.
Com s’observa a la figura 5, la CK1ε interacciona amb els fragments de p120ctn
que contenen els aminoàcids (1-390), (102-end) i (234-end) (carrils 3, 4 i 5,
respectivament). No interacciona amb els fragments (1-347) ni (350-end) per separat
(carrils 2 i 6, respectivament). Aquests resultats suggereixen que CK1ε s’uneix a la
seqüència d’aminoàcids 234-390 de p120ctn. En un cas, (figura 5, carril 7) s’incuben dos
fragments de p120ctn (1-347 i 350-end) amb els extractes, només p120ctn(350-end) conté
GST. Curiosament, si s’observa unió de CK1ε a GST-p120(1-347) quan s’afegeix a
l’assaig d’incubació el fragment (350-end) de p120ctn, indicant que aquestes dues meitats
de la proteïna interaccionen i refan el lloc d’unió de p120ctn per CK1ε o bé que la regió
d’interacció es troba al voltant de l’aminoàcid 350. Recordar que la regió reguladora de
p120ctn es troba en el seu extrem N-terminal (aminoàcids 1 a 347).
25

26. 4.4.- Kaiso surt del nucli sota l’estímul de Wnt, sortida que es veu interrompuda per
el silenciament de la CK1ε.
Se sap que Wnt modula la repressió a nivell transcripcional produïda per Kaiso; per una
altra part Kaiso pot entrar i sortir del nucli, sortida en la que participa p120ctn. Es per
aquest motiu que ens vam plantejar si Wnt podia induir la sortida de Kaiso del nucli,
eliminant d’aquesta manera el seu efecte repressor. Per analitzar-ho, es van preparar
extractes citosòlics i nuclears de cèl·lules control i estimulades per Wnt. A la figura 6
(carrils 1-4) s’observa que en el cas de les cèl·lules control, Wnt indueix la sortida de
Kaiso del nucli cap el citosol.
A la vegada ens vam plantejar si CK1ε tenia un paper en la localització cel·lular de
Kaiso, donat que CK1ε modula l’activació dels gens diana de Wnt i que Kaiso és un
repressor d’aquests gens, i del fet que, com s’ha vist en experiments anteriors, CK1ε
modula la localització de p120ctn i aquesta última la localització de Kaiso. Es van preparar
també extractes citosòlics i nuclears de cèl·lules interferents per CK1ε utilitzant un shRNA
específic per CKIε. En la figura 6 (carrils 5-8), en les cèl·lules interferents per CK1ε no
s’observa la sortida de Kaiso del nucli al citosol sota l’estímul de Wnt.
Fig. 6. Kaiso surt del nucli sota l’estímul de Wnt, sortida que es veu interrompuda per el silenciament
de la CK1ε. Es van preparar extractes citosòlics i nuclears (descrit a materials i mètodes) de cèl·lules HEK293T estimulades o no amb Wnt3a, tant de cèl·lules control com de cèl·lules interferents per CK1ε en les
26

27. qual es va transfectar un shRNACK1ε. WB amb anticossos específics anti Kaiso, CK1ε per comprovar el
silenciament, i Lamina i Piruvat kinasa per normalitzar nuclis i citosols.
4.5.- Disminueix la interacció entre Kaiso i TCF-4 sota l’estímul de Wnt.
La funció repressora de Kaiso depen de la seva localització nuclear, on pot interaccionar
directament amb seqüències específiques del DNA i també s’ha descrit molt recentment,
que s’uneix al factor de transcripció TCF-4 inhibint en aquest cas, la unió de TCF-4 al
DNA i per tant la transcripció dels gens diana de Wnt. L’activació de la via Wnt estabilitza
la β-catenina, facilita la seva translocació nuclear i l’activitat transcripcional del complex βcatenina-TCF-4. Vam analitzar si Wnt modificava la interacció entre Kaiso i TCF-4. Es va
immunoprecipitar Kaiso (figura 7A) i TCF-4 (figura 7B) de cèl·lules SW480 control i
cèl·lules estimulades per Wnt. Al mateix temps s’analitza la possible formació de
complexes TCF-4 i p120ctn, ja que entre p120ctn i Kaiso ja ha estat descrita.
Fig. 7. Wnt3a disminueix la interacció entre Kaiso i TCF-4. Es va immunoprecipitar Kaiso (7A) i TCF-4
(7B) d’extractes totals de cèl·lules SW480 control i estimulades amb Wnt3a (protocol descrit a materials i
mètodes). WB amb anticossos específics anti Kaiso, TCF-4, p120ctn i actina per normalitzar.
.
27

28. Tal com esperavem, sota l’estímul de Wnt, disminueix la interacció de Kaiso amb
TCF-4 comparat amb la situació control, tant en immunoprecipitar Kaiso (Fig. 7A) com
TCF-4 (Fig. 7B). Tampoc es detecta p120ctn unida a TCF-4.
4.6.- β–catenina augmenta la interacció amb TCF-4 i la disminueix amb Kaiso sota
l’estímul de Wnt.
Wnt estabilitza la β–catenina lliure al citosol, que transloca al nucli, s’uneix a TCF-4 i
indueix l’activació dels gens diana d’aquest complex β-catenina/TCF-4. Vam analitzar si
Wnt augmentava la fracció de β–catenina unida a TCF-4, i si aquest augment afectava als
nivells de Kaiso unit al complex. Es va immunoprecipitar β–catenina de cèl·lules
estimulades amb Wnt3a i cèl·lules control,
Fig. 8. Wnt augmenta la interacció de β–catenina amb TCF-4 i disminueix la unió de Kaiso amb TCF-4.
Es va immunoprecipitar β-catenina d’extractes totals de cèl·lules HEK-293T control i estimulades amb wnt3a
(protocol descrit a materials i mètodes). WB amb anticossos específics anti Kaiso, TCF-4, i β-catenina i
actina per normalitzar.
Tal com està descrit, Wnt incrementa la β-catenina unida a TCF-4, comparat amb
les cèl·lules no estimulades (figura 8). A més, es detecta Kaiso en el complex de βcatenina-TCF-4. Wnt disminueix la asscoació del repressor Kaiso al complex β-cateninaTCF-4.
28

29. 5.- Discussió
p120ctn es troba unida al domini juxtamembrana de l’E-cadherina, estabilitzant -la
(Daniel and Reynolds, 1995) i també interacciona amb el repressor transcripcional Kaiso
(Daniel and Reynolds, 1999). Experiments anteriors del grup han descrit que la quinasa
CK1 interacciona amb p120ctn i la fosforila. Aquesta fosforilació in vitro, indueix la pèrdua
d’interacció amb de p120ctn amb E-cadherina i un augment de la interacció de p120ctn
amb el repressor transcripcional Kaiso. En aquest treball s’ha pogut demostrar que la
isoforma de CK1 que s’uneix a p120ctn és la CK1ε. A més, en activar la via Wnt en línies
cel·lulars, hem observat que p120ctn perd la interacció amb l’E-cadherina i augmenta la
interacció amb Kaiso (figura 2), aquesta interacció és excloent ja que es produeix per la
mateixa regió, el domini armadillo de p120ctn. L’estimulació de la via de Wnt, no fa variar
la interacció entre p120ctn i CK1ε, de manera que aquesta ultima acompanya a p120ctn
quan aquesta es troba unida a la E-cadherina i quan ho està a Kaiso.
La regió per on CK1ε interacciona amb p120ctn (figura 5), és a través de la
seqüència d’aminoàcids 234 i 390 de la p120ctn, és a dir al final de l’extrem N-terminal
regulador i a l’inici de la primer repetició armadillo de la p120ctn. A més, es veu que per la
unió de CK1ε es requereix la major part d’aquesta seqüència, ja que no s’obté interacció
entre ambdues proteïnes quan s’utilitzen per separat els fragments 1-347 i 350-end de
p120ctn, però si que se’n obté quan s’utilitzen ambdós fragments conjuntament.
Està descrit que la sobre-expressió de p120ctn permet l’export nuclear de Kaiso.
Com es mostra la figura 6, el paper de la CK1ε es fonamental per tal que p120ctn
interaccioni amb el repressor Kaiso, fent que aquest es desplaci del nucli al citosol. Així,
en les cèl·lules control Kaiso es deslocalitza del nucli al citosol sota l’estímul de Wnt3a,
sortida que no s’observa quan tracten amb Wnt3a cèl·lules que tenen silenciada la CK1ε
amb un shRNA específic per aquesta isoforma. En absència de CK1ε i en estimular les
cèl·lules per Wnt, p120ctn no pot desprendre’s de la unió a Ecadherina i per tant no pot
29

30. interaccionar amb Kaiso, ni retenir aquest repressor fora del nucli. Aquests resultats posen
de manifest el paper fonamental d’aquesta quinasa en la regulació de la via de Wnt.
El complex β-catenina/TCF-4 promou la transcripció dels gens diana de la via de
Wnt. En condicions control, Kaiso pot interaccionar amb TCF-4 (figura 7A) i aquest
complex impedeix la unió de TCF-4 al DNA (Ruzov et al., 2009). En activar la via de Wnt,
hem observat que disminueix la interacció de Kaiso amb TCF-4 (figura 7A i 7B),
possiblement perquè la p120ctn (alliberada de la unió a l’E-cadherina) reté Kaiso fora del
nucli o competeix la unió de Kaiso amb TCF-4. Això facilitaria la unió de TCF-4 al DNA. A
més, com se sap des de fa anys, Wnt estabilitza la β-catenina lliure al citosol, que es
transloca al nucli on s’uneix a TCF-4 permetent així l’activació dels gens diana d’aquest
complex, implicats en mantenir la capacitat proliferativa de les cèl·lules. La unió de βcatenina a TCF-4 també pot desplaçar el repressor Kaiso de la unió a TCF-4, tal com es
constata a la figura 8. D’aquesta manera, Kaiso en deixar d’estar unit a TCF-4 i exclòs del
nucli, facilitaria la unió del complex β-catenina/TCF-4 al DNA, desreprimint així la repressió
originada per Kaiso sobre els gens diana de Wnt, i facilitant la seva transcripció.
30

31. 6.- Conclusions
Tal i com es mostra en el model presentat (Figura 9), al estimular la via de Wnt, la quinasa
CK1ε, fosforila p120ctn inhibint la seva interacció amb l’Ecadherina i provocant la seva
sortida del complex d’adhesió cel·lular. A més, aquesta fosforilació augmenta la seva
interacció amb el repressor transcripcional Kaiso, fet que indueix la seva sortida del nucli
cap el citosol (Fig.9 B). Donat que en el nucli, la unió de Kaiso a TCF-4 impedeix que TCF4 s’uneixi al DNA; l’export nuclear de Kaiso induït per Wnt facilita la unió de TCF-4 al DNA
i per tant contribuint a la desrepressió dels gens diana de Wnt (Fig. 9 C).
Situació control
A
S ituació +Wnt
B
W nt
E-Cadheri na
p120
β- c
a
E -Cadherina
MEDI EXTRACEL· LULAR
MEDI EXTRACEL·L ULAR
p120
CK1e
p
CK1e
β -c
at
α-cat
t
α-cat
eplina
eplina
p120
p
CK1e
Kai so
Actina
CSK
Actina
CSK
Kai so
β -c at
xx
Tcf4
Transcriptional activation
CIT OSOL
Kais o
Tcf4
CIT OSOL
W nt target genes
xx
Transcriptional activation
Wnt target gene s
S ituació +Wnt
C
E -Cadherina
MEDI EXTRACEL·L ULAR
p120
CK1e
β -c
at
α -cat
p120
Kaiso
e plina
CK1e
p
Actina
CSK
β-cat
CIT OSOL
Tcf4
x
Transcriptional activation
Wnt target genes
Fig 9.- Model proposat de l’activació dels gens diana de Wnt.
A la vegada β-catenina, que se sap que és estabilitzada per Wnt, augmenta la seva
interacció amb TCF-4 (Fig. 9 C). Aquests dos fets condueixen, per una banda, a la
31

32. desrepressió dels gens diana de Wnt, i per una altre l’activació de la transcripció dels gens
diana de Wnt pel complex β-catenina/TCF-4. S’ha descrit també el domini d’interacció de
CK1ε en p120ctn i comprovat el paper fonamental de CK1ε en la sortida del nucli de
Kaiso, ja que el seu silenciament evita el seu export nuclear.
32

33. 7.- Bibliografia
Albagli O, Dhordain P, Deweindt C, Lecocq G, Leprince D. 1995. The BTB/POZ domain: a new
protein-protein interaction motif common to DNA- and actin-binding proteins. Cell Growth Differ. 6(9):1193-8.
Anastasiadis PZ, and Reynolds AB. 2000. The p120 catenin family: complex roles in adhesion,
signaling and cancer. J Cell Sci. 113 ( Pt 8):1319-34.
Batlle E, Sancho E, Franci C, Dominguez D, Monfar M, Baulida J, and Garcia De Herreros A. 2000.
The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nat Cell
Biol. 2:84-9.
Behrens J, Von Kries JP, Kuhl M, Bruhn L, Wedlich D, Grosschedl R, and Birchmeier W. 1996.
Functional interaction of beta-catenin with the transcription factor LEF-1. Nature. 382(6592):638-42.
Brieher WM, Yap AS, and Gumbiner BM. 1996. Lateral dimerization is required for the homophilic
binding activity of C-cadherin. J Cell Biol. 135(2):487-96.
Castaño J, Solanas G, Casagolda D, Raurell I, Villagrasa P, Bustelo XR, Garcia de Herreros A, and
Duñach M. 2007. Specific phosphorylation of p120-catenin regulatory domain differently modulates its
binding to RhoA. Mol. Cell Biol. 27(5):1745-57.
Chen X, Kojima S, Borisy GG, and Green KJ. 2003. p120 catenin associates with kinesin and
facilitates the transport of cadherin-catenin complexos to intercellular junctions. J Cell Biol. 163(3):547-57.
Daniel JM, and Reynolds AB. 1995. The tyrosine kinase substrate p120cas binds directly to Ecadherin but not to the adenomatous polyposis coli protein or alpha-catenin. Mol Cell Biol. 15:4819-24.
Daniel JM, Spring CM, Crawford HC, Reynolds AB, Baiq A. 2002. The p120ctn-binding partner Kaiso
is a bi-modal DNA-binding protein that recognizes both a sequence-specific consensus and methylated CpG
dinucleotides. Nucleic Acids research 30(13)2911-9.
Daniel JM. 2007. Dancing in and out of the nucleus: p120ctn and the transcription factor Kaiso.
Biochimica et Biophysica Acta 1773(1)59-68
Davis MA, Ireton RC, and Reynolds AB. 2003. A core function for p120-catenin in cadherin turnover.
J Cell Biol. 163(3):525-34.
Gao ZH, Seeling JM, Hill V, Yochum A, and Virshup DM (2002). Casein kinase I phosphorylates and
destabilizes the β-catenin degradation complex. Proc Natl. Acad. Sci. USA 99(3):1182-7.
Giannini AL, Vivanco M, and Kypta RM. 2000a. Alpha-catenin inhibits beta-catenin signaling by
preventing formation of a beta-catenin*T-cell factor*DNA complex. J Biol Chem. 275(29):21883-8.
Gumbiner BM. 2000. Regulation of cadherin adhesive activity. J Cell Biol. 148(3):399-404.
33

34. Hu P, O'Keefe EJ, and Rubenstein DS. 2001. Tyrosine phosphorylation of human keratinocyte betacatenin and plakoglobin reversibly regulates their binding to E-cadherin and alpha-catenin. J Invest Dermatol.
117(5):1059-67.
Huber AH, and Weis WI. 2001. The structure of the beta-catenin/E-cadherin complex and the
molecular basis of diverse ligand recognition by beta-catenin. Cell. 105(3):391-402.
Kim L, and Wong TW. 1995. The cytoplasmic tyrosine kinase Fer is associated with the catenin
substrate pp120 and is activated by growth factors. Mol. Cell Biol. 15(8)4553-61.
Korinek V, Barker N, Morin PJ, van Wichen D, de Weger R, Kinzler KW, Vogelstein B, and Clevers
H. 1997. Constitutive transcriptional activation by a beta-catenin-TCF complex in APC-/- colon carcinoma.
Science. 275(5307):1784-7.
Koslov ER, Maupin P, Pradhan D, Morrow JS, and Rimm DL. 1997. Alpha-catenin can form
asymmetric homodimeric complexos and/or heterodimeric complexos with beta-catenin. J Biol Chem.
272(43):27301-6.
Nakagawa M, Fukata M, Yamaga M, Itoh N, and Kaibuchi K. 2001. Recruitment and activation of
Rac1 by the formation of E-cadherin-mediated cell-cell adhesion sites. J Cell Sci. 114(Pt 10):1829-38.
Overduin M, Harvey TS, Bagby S, Tong KI, Yau P, Takeichi M, and Ikura M. 1995. Solution structure
of the epithelial cadherin domain responsible for selective cell adhesion. Science. 267(5196):386-9.
Park JI, Kim SW, Lyons JP, Ji H, Nguyen TT, Cho K, Barton MC, Deroo T, Vleminchkx K and
McCrea PD. 2005. Kaiso/p120-catenin and TCF/β-catenin complexes coordinately regulate canonical Wnt
gene targets. Developmental cell, 8(6):843-54
Peters JM, MacKay RM, MacKay JP, and Graff JM. 1999. Casein kinase I transduces Wnt signals.
Nature 401(6751)345-50.
Piedra J, Martinez D, Castaño J, Miravet S, Duñach M, and Garcia de Herreros A. 2001. Regulation
of beta-catenin structure and activity by tyrosine phosphorylation. J Biol Chem. 276(23):20436-43.
Piedra J, Miravet S, Castaño J, Palmer HG, Heisterkamp N, Garcia de Herreros A, and Duñach M.
2003. p120 Catenin-associated Fer and Fyn tyrosine kinases regulate beta-catenin Tyr-142 phosphorylation
and beta-catenin-alpha-catenin Interaction. Mol Cell Biol. 23(7):2287-97.
Pokutta S, and Weis WI. 2000. Structure of the dimerization and beta-catenin-binding region of
alpha-catenin. Mol Cell. 5(3):533-43.
Polakis P. 2002. Casein kinase 1: a Wnt'er of disconnect. Curr Biol. 12(14):R499-R501.
Price MA, 2008. CK1, there’s more than one: casein kinase I family members in Wnt and Hedgehog
signalling. Review, Genes & Development 20(4):399-410.
34

35. Prokhortchouk A, Hendrich B, Jorgensen H, Ruzov A, Wilm M, Georgiev G, Bird A, Prokhortchouk E.
2001. The p120 catenin partner Kaiso is a DNA methylation-dependent transcriptional repressor. Genes and
Development. 15(13):1613-8
Reynolds AB. 2007. p120-catenin: past and present. Biochim Biophys Acta, 1773(1):2-7
Roure S, Miravet S, Piedra J, Garcia de Herreros A, Duñach M. 1999. Regulation of Ecadherina/catenin association by tyrosine phosphorylation. J. Biol. Chem. 274(51):36734-40.
Ruzov A, Hackett JA, Prokhortchouk A, Reddington JP, Madej MJ, Dunican DS, Prokhortchouk E,
Pennings S and Meehan RR. 2009a. The interaction of xKaiso with xTCF3: a revised model for integration of
epigenetic and Wnt signalling pathways. Development 136(5):723-7.
Ruzov A, Savitskaya E, Hackett JA, Reddington JP, Prokhortchouk A, Madej MJ, Chekanov N, Li M,
Dunican DS, Prokhortchouk E, Pennings S and Meehan RR. 2009b. The non-methylated DNA-binding
function of Kaiso is not required in early Xenopus laevis development. Development 136(5):729-38.
Ogden SR, Wroblewski LE, Weydig C, Romero-Gallo J, O’Brien DP, Israel DA, Krishna US,
Fingleton B, Reynolds AB, Wessler S and Peek RM Jr. 2008. p120 and Kaiso regulate Helicobacter pyloriinduced expresión of matrix metalloproteinase-7. Molecular Biology of the cell. 19(10):4110-4121.
Sakanaka C, Leong P, Xu L, Harrison SD, and Williams LT. 1999. Casein kinase Iε in the wnt
pathway: regulation of β-catenin function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(22):12548-52.
Shapiro L, Fannon AM, Kwong PD, Thompson A, Lehmann MS, Grubel G, Legrand JF, Als-Nielsen
J, Colman DR, and Hendrickson WA. 1995. Structural basis of cell-cell adhesion by cadherins. Nature.
374(6520):327-37.
Soto E, Yanagisawa M, Marlow LA, Copland JA, Perez EA and Anastasidis PZ. 2008. p120 catenin
induces opposing effects on tumor cell growth depending on E-cadherin expression. J Cell Biol, 183(4):73749
Spring CM, Kelly KF, O’Kelly I, Graham M, Crawfoed HC, Daniel JM. 2005. The catenin p120 inhibits
Kaiso-mediated transcriptional repression of the β-catenin/TCF target gene matrilysin. Experimental Cell
Research 305(2):253-265.
Van Roy FM and McCrea PD, 2005. A role for Kaiso-p120ctn complexes in cancer?. Nature Rev
Cancer- 5(12):956-64
Walther A, Johnstone E, Swanton C, Midgley R, Tomlinson I and Kerr D. 2009. Genetic prognostic
and predictive markers in colorectal cancer. Nature reviews Cancer. 9(7):489-499.
Weis WI, Nelson WJ, 2006. Re-solving the Cedherin-Catenin-Actin Conundrum. The Journal of
Bological Chemistry. 281(47):35593-7.
35

36. Xiao K, Allison DF, Buckley KM, KottkeMD, Vincent PA, Faundez V, and Kowalczyk AP. 2003.
Cellular levels of p120 catenin function as a set point for cadherin expression levels in microvascular
endothelial cells. J Cell Biol. 163(3):535-45.
Xing Y, Clements WK, Kimelman D, and Xu W. 2003. Crystal structure of a beta-catenin/axin
complex suggests a mechanism for the beta-catenin destruction complex. Genes Dev. 17(22):2753-64.
Yanigisawa M, Huveldt D, Kreinest P, Lohse CM, Cheville JC, Parker AS, Copland JA, and
Anastasiadis P. 2008. A p120-catenin isoform switch affects Rho activity, induces tumor cell invasion and
predicts metastasis disease. J. Biol. Chem. 283(26):18344-54.
36