新規医療開発に関わる統計学 (バイオインフォマティクス)
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群馬大学未来医療研究人材養成拠点形成事業e-learning講義「新規医療開発に関わる統計学 (バイオインフォマティクス)」2014年4月7日収録。 内容としては初心者向け
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新規医療開発に関わる統計学 (バイオインフォマティクス)
- 1. 新規医療開発に関わる統計学 （バイオインフォマティクス） 坊農 秀雅(ぼうのう ひでまさ) 大学共同利用機関法人 情報・システム研究機構 ライフサイエンス統合データベースセンター (DBCLS)
- 2. 本講義の内容 1. バイオインフォマティクスとは?! 2. NGSとは? できること! 3. NGSデータ解析の概要! 4. 具体的な解析例! 5. データの解釈! 6. データの再利用 2
- 4. (かつての)バイオインフォマ ティクス研究者の職種別分類 • アルゴリズム屋! –方法を考える人! –「NP完全」がキーワード! • 実装屋! –プログラムやツールを書く人! • 解析屋! –プログラムを使って実際に生データを相手に手を 動かす人 数学的 抽象的 生物的 具体的 Biologistの範疇 4
- 7. DNA塩基配列解読の超高速化 •かつてはSanger法 •最近は「次世代シーケンサー(NGS)」 ‒Illumina: Sequence By Synthesis • http://www.youtube.com/watch?v=womKfikWlxM ‒Life Technologies(現 ThermoFisher Scientific) •ヌクレオチドがDNA鎖に取り込まれる過程でポリメラー ゼによって放出される水素イオンを検出 • http://www.youtube.com/watch?v=MxkYa9XCvBQ ‒PacBio: 一分子・リアルタイム(SMRT®)検出 • http://www.youtube.com/watch?v=NHCJ8PtYCFc 7
- 8. MiSeq •Illumina社のデスクトップ次世代シーケンサ •群馬大学にも導入済み •最新の v3 試薬だと1runで ‒300塩基(base) ‒x 5000万リード ‒= 15 Gb(参考: ヒトハプロイドゲノム 約3Gb) 8
- 9. NGSでできること • RNA転写量測定! –RNAseq(transcriptome sequencing)! • DNA結合タンパク質の結合配列の解析! –ChIPseq(ヒストンや転写因子)! • ChIPはChromatin immunoprecipitationの略! • 多型解析! –Exome(exon限定), Re-sequence! • その他、塩基配列解読が伴うさまざまな応用 9
- 10. NGSからの生データ •FASTQフォーマットのファイル ‒4行/readが基本単位 ‒MiSeq v3 •5000万リードx4行 •=2億行 •ファイルサイズも4Gbyte/file超 ‒FAT32フォーマットでは扱えない •いわゆる「開く」ことが不可能 10 SRR001356.1 2023DAAXX:5:1:123:563 length=33 TGTCGGTCCAGCTCGGCCTTGGGCTCCGTTTTC +SRR001356.1 2023DAAXX:5:1:123:563 length=33 -IIIIIIII8IIIIIIIIIII6IIIIIIIII9I @SRR001356.2 2023DAAXX:5:1:123:476 length=33 TCTGAACCCGACTCCCTTTCGATCGGCCGCGGG +SRR001356.2 2023DAAXX:5:1:123:476 length=33 IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIGIIIIIII-III @SRR001356.3 2023DAAXX:5:1:121:746 length=33 GTGGCAGCGTTTTTGGGCCCGCCGCTTGCCGTT +SRR001356.3 2023DAAXX:5:1:121:746 length=33 IIIII&IIIIIIIIIIIIIIIIHI1IIIIIIII
- 12. RNAseqとは？ • 「次世代シーケンサを利用して、サンプル中 の RNA の中身に関する情報を得るために cDNA をシーケンシングする方法」! –http://en.wikipedia.org/wiki/RNA-Seqより勝手に翻訳! • Whole transcriptome shutgun sequencing (WTSS) や! • Transcriptome sequencingとも 12
- 13. RNAseq データ 解析の流れ1 予測転写単位ごとの （推定）発現量情報 SRR001356.1 2023DAAXX:5:1:123:563 length=33! TGTCGGTCCAGCTCGGCCTTGGGCTCCGTTTTC! +SRR001356.1 2023DAAXX:5:1:123:563 length=33! -IIIIIIII8IIIIIIIIIII6IIIIIIIII9I! @SRR001356.2 2023DAAXX:5:1:123:476 length=33! TCTGAACCCGACTCCCTTTCGATCGGCCGCGGG! +SRR001356.2 2023DAAXX:5:1:123:476 length=33! IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIGIIIIIII-III! @SRR001356.3 2023DAAXX:5:1:121:746 length=33! GTGGCAGCGTTTTTGGGCCCGCCGCTTGCCGTT! +SRR001356.3 2023DAAXX:5:1:121:746 length=33! IIIII&IIIIIIIIIIIIIIIIHI1IIIIIIII FASTQ 1.tophat (bowtie) 2.cufflinks 3.cummeRbund 13 遺伝子アノ テーション ゲノム .fa ゲノムアノ テーション .gtf ゲノムに対する多重配列アラインメント .bam
- 14. 種々のデータフォーマット 14 ファイルフォーマット ファイル拡張子 1 FASTA .fa .fasta 2 FASTQ .fq .fastq 3 SRA/SRA-lite .sra .lite.sra 4 SAM/BAM .sam .bam 5 GTF(GFF) .gtf .gff 6 VCF .vcf
- 15. 1. FASTA • FASTAというプログラムで使われる配列データ形式! –プレーンテキスト。ファイル拡張子: .fa .fasta など! • 1行目に“>”で始まる1行のヘッダ行! • 2行目以降に実際のシーケンス文字列 15 >gi|5524211|gb|AAD44166.1| cytochrome b [Elephas maximus maximus]! LCLYTHIGRNIYYGSYLYSETWNTGIMLLLITMATAFMGYVLPWGQMSFWGATVITNLFSAIPYIGTNLV! EWIWGGFSVDKATLNRFFAFHFILPFTMVALAGVHLTFLHETGSNNPLGLTSDSDKIPFHPYYTIKDFLG! LLILILLLLLLALLSPDMLGDPDNHMPADPLNTPLHIKPEWYFLFAYAILRSVPNKLGGVLALFLSIVIL! GLMPFLHTSKHRSMMLRPLSQALFWTLTMDLLTLTWIGSQPVEYPYTIIGQMASILYFSIILAFLPIAGX! IENY 参考: http://ja.wikipedia.org/wiki/FASTA
- 16. 2. FASTQ • NGSデータの配列データ形式のデファクトスタンダード! –プレーンテキスト。ファイル拡張子: .fq .fastq など! • 1行目に“@”で始まる1行のヘッダ行! • 2行目に実際の塩基配列! • 3行目に”+”! • 4行目に2行目に記述した配列のクオリティ値 16 @SEQ_ID! GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTCAACTCACAGTTT! +! !''*((((***+))%%%++)(%%%%).1***-+*''))**55CCF>>>>>>CCCCCCC65 参考: http://ja.wikipedia.org/wiki/Fastq
- 17. 3. SRA, SRA-lite • FASTQ形式の代わりに使われている、NGS 配列データ配布フォーマット! –配列拡張子: .sra .lite.sra ! • SRA-toolkitを使ってFASTQを生成できる! –http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?view=software 17 fastq-dump -A SRR233129 SRR233129.lite.sra
- 18. 4. SAM/BAM • ゲノムマッピングしたときに生成されるアラ インメントのフォーマット! –リファレンスゲノム配列に対するアラインメント! • SAMはプレーンテキスト(ASCII)形式なのに 対して、BAMはバイナリ(binary)形式! 18 参考: http://genome.sph.umich.edu/wiki/SAM 1:497:R:-272+13M17D24M! 113! 1! 497! 37! 37M! 15! 100338662! 0! CGGGTCTGACCTGAGGAGAACTGTGCTCCGCCTTCAG! 0;==-==9;>>>>>=>>>>>>>>>>>= 19:20389:F:275+18M2D19M! 99! 1! 17644!0! 37M! =! 17919!314! TATGACTGCTAATAATACCTACACATGTTAGAACCAT! >>>>>>>>>>>>>>>>>>>><<>>><<>>4: 19:20389:F:275+18M2D19M! 147! 1! 17919!0! 18M2D19M! =! 17644!-314! GTAGTACCAACTGTAAGTCCTTATCTTCATACTTTGT! ;44999;499<8<8<<<8<<><<<<>< 9:21597+10M2I25M:R:-209! 83! 1! 21678!0! 8M2I27M! =! 21469!-244! CACCACATCACATATACCAAGCCTGGCTGTGTCTTCT! <;9<<5><<<<><<<>><<><>><9>
- 19. 5. GTF(GFF) • General Transfer Format. GFF(General Feature Format)のversion2! • ゲノムアノテーションのフォーマット! –例: ゲノム上のどこに遺伝子があるか 19 参考: http://asia.ensembl.org/info/website/upload/gff.html X! Ensembl! Repeat!2419108! 2419128! 42! .! .! hid=trf; hstart=1; hend=21! X! Ensembl! Repeat!2419108! 2419410! 2502! -! .! hid=AluSx; hstart=1; hend=303! X! Ensembl! Repeat!2419108! 2419128! 0! .! .! hid=dust; hstart=2419108; hend=2419128! X! Ensembl! Pred.trans.!2416676! 2418760! 450.19!-! 2! genscan=GENSCAN00000019335! X! Ensembl! Variation! 2413425! 2413425! .! +! .! ! X! Ensembl! Variation! 2413805! 2413805! .! +! .
- 20. 6. VCF • Variant Call Format! • 配列の多型を記述するフォーマット 20 参考: http://en.wikipedia.org/wiki/Variant_Call_Format ##fileformat=VCFv4.0! ##fileDate=20110705! ##reference=1000GenomesPilot-NCBI37! ##phasing=partial! ##INFO=<ID=NS,Number=1,Type=Integer,Description="Number of Samples With Data">! ##INFO=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Total Depth">! ##INFO=<ID=AF,Number=.,Type=Float,Description="Allele Frequency">! ##INFO=<ID=AA,Number=1,Type=String,Description="Ancestral Allele">! ##INFO=<ID=DB,Number=0,Type=Flag,Description="dbSNP membership, build 129">! ##INFO=<ID=H2,Number=0,Type=Flag,Description="HapMap2 membership">! ##FILTER=<ID=q10,Description="Quality below 10">! ##FILTER=<ID=s50,Description="Less than 50% of samples have data">! ##FORMAT=<ID=GQ,Number=1,Type=Integer,Description="Genotype Quality">! ##FORMAT=<ID=GT,Number=1,Type=String,Description="Genotype">! ##FORMAT=<ID=DP,Number=1,Type=Integer,Description="Read Depth">! ##FORMAT=<ID=HQ,Number=2,Type=Integer,Description="Haplotype Quality">! #CHROM POS ID REF ALT QUAL FILTER INFO FORMAT Sample1 Sample2 Sample3! 2 4370 rs6057 G A 29 . NS=2;DP=13;AF=0.5;DB;H2 GT:GQ:DP:HQ 0|0:48:1:52,51 1|0:48:8:51,51 1/1:43:5:.,.! 2 7330 . T A 3 q10 NS=5;DP=12;AF=0.017 GT:GQ:DP:HQ 0|0:46:3:58,50 0|1:3:5:65,3 0/0:41:3! 2 110696 rs6055 A G,T 67 PASS NS=2;DP=10;AF=0.333,0.667;AA=T;DB GT:GQ:DP:HQ 1|2:21:6:23,27 2|1:2:0:18,2 2/2:35:4! 2 130237 . T . 47 . NS=2;DP=16;AA=T GT:GQ:DP:HQ 0|0:54:7:56,60 0|0:48:4:56,51 0/0:61:2! 2 134567 microsat1 GTCT G,GTACT 50 PASS NS=2;DP=9;AA=G GT:GQ:DP 0/1:35:4 0/2:17:2 1/1:40:3
- 21. NGSに比べてマイクロアレイ • 2000年前後に使われ初めて、ある程度（技術と して）枯れてきた! –参考: 公共データベースの登録数の推移! –遺伝子発現バンク(GEO)目次 http://lifesciencedb.jp/geo/! • 本もそれなりに出ている 21
- 23. マイクロアレイのデータ形式の実際 • タブ区切りテキスト! –数万(=スポットの数)行! • (古い)Excelでも「開ける」! –Excel2003の行数制限内! • コマンドライン操作なしで中身が直接見れる 23
- 24. データ解析に必要なもの マイクロアレイ NGS(RNAseq) 解析ソフト +++ +++ 遺伝子 アノテーション +++ +++ ゲノム アノテーション - ++ ゲノム配列 - ++ コマンドライ ン操作 + +++ 計算機パワー + +++ 24
- 25. マイクロアレイとの違い: RPKM • Reads Per Kilobase per Million mapped reads! • ノーマライズした遺伝子発現量! –100万リード数マップされたとき、転写産物を 1000塩基長としたときのマップされたリード数! • FPKMもほぼ同じ! –Fragments Per Kilobase of exon per Million mapped fragments! – ! • Reference: Nat Methods, 5(7):621-628. 25
- 26. RNAseq データ解析の流れ2 • リファレンスゲノム配列が ないとき! –transcriptome の de novo assembly! • 「UniGeneを自分で作る」! –現状、より膨大な計算時間が • immature • state-of-the-art 26
- 27. 4. 具体的な解析例
- 28. The cat way • 理化学研究所の二階堂愛さんのブログ! –http://cat.hackingisbelieving.org/lecture/ ! ! ! ! • オープンソースソフトウェア! –Tuxedo suite! • bowtie,tophat,cufflinks! –R + Bioconductor 28 cuffdiff -p 24 ensembl_gene.gtf ! -L iPS_01,iPS_02,hESC_01,hESC_02,Fibroblast_01,Fibroblast_02! -o results iPS_01.bam,iPS_2.bam hESC_1.bam,hESC_2.bam Fibroblast_01.bam,Fibroblast_02.bam! tophat -p 8 -r 100 -o output_dir/iPS_01 bowtie2_indexes/mm9 iPS_01_1.fastq
- 29. RNAseq データ 解析の流れ1 ゲノムに対する多重配列アラインメント .bam ゲノムアノ テーション .gtf 予測転写単位ごとの （推定）発現量情報 SRR001356.1 2023DAAXX:5:1:123:563 length=33! TGTCGGTCCAGCTCGGCCTTGGGCTCCGTTTTC! +SRR001356.1 2023DAAXX:5:1:123:563 length=33! -IIIIIIII8IIIIIIIIIII6IIIIIIIII9I! @SRR001356.2 2023DAAXX:5:1:123:476 length=33! TCTGAACCCGACTCCCTTTCGATCGGCCGCGGG! +SRR001356.2 2023DAAXX:5:1:123:476 length=33! IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIGIIIIIII-III! @SRR001356.3 2023DAAXX:5:1:121:746 length=33! GTGGCAGCGTTTTTGGGCCCGCCGCTTGCCGTT! +SRR001356.3 2023DAAXX:5:1:121:746 length=33! IIIII&IIIIIIIIIIIIIIIIHI1IIIIIIII FASTQ ゲノム .fa 29 遺伝子アノ テーション 1.tophat (bowtie) 2.cufflinks 3.cummeRbund
- 30. 統計解析環境R • Rを使ったトランスクリプトーム解析! –(Rで)マイクロアレイデータ解析! • http://www.iu.a.u-tokyo.ac.jp/~kadota/r.html –(Rで)塩基配列解析 • http://www.iu.a.u-tokyo.ac.jp/~kadota/r_seq.html! ! • トランスクリプトーム解析 by 門田幸二 from 共立出版 –http://www.kyoritsu-pub.co.jp/bookdetail/9784320123700 30
- 31. 有償のソフトウェアの利用 •CLC Genomics workbench! •Agilent! –Avadis NGS! –GeneSpring! •TIBCO Spotfire 31
- 32. RNAseq データ 解析の流れ1 ゲノムに対する多重配列アラインメント .bam ゲノムアノ テーション .gtf 予測転写単位ごとの （推定）発現量情報 SRR001356.1 2023DAAXX:5:1:123:563 length=33! TGTCGGTCCAGCTCGGCCTTGGGCTCCGTTTTC! +SRR001356.1 2023DAAXX:5:1:123:563 length=33! -IIIIIIII8IIIIIIIIIII6IIIIIIIII9I! @SRR001356.2 2023DAAXX:5:1:123:476 length=33! TCTGAACCCGACTCCCTTTCGATCGGCCGCGGG! +SRR001356.2 2023DAAXX:5:1:123:476 length=33! IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIGIIIIIII-III! @SRR001356.3 2023DAAXX:5:1:121:746 length=33! GTGGCAGCGTTTTTGGGCCCGCCGCTTGCCGTT! +SRR001356.3 2023DAAXX:5:1:121:746 length=33! IIIII&IIIIIIIIIIIIIIIIHI1IIIIIIII FASTQ ゲノム .fa 1.tophat (bowtie) 2.cufflinks 3.cummeRbund 32 遺伝子アノ テーション
- 33. 統合TVに動画チュートリアルが • CLC Genomics Workbench でショートリー ドのマッピングを行う! –http://togotv.dbcls.jp/20110628.html 33
- 34. RNA-seq by Avadis NGS • http://togotv.dbcls.jp/20111124.html 34
- 35. ChIP-seq by Avadis NGS • http://togotv.dbcls.jp/20120626.html 35
- 37. Spotfireによるcuffdiff出力の可視化 37 % cuffdiff -p 8 Caenorhabditis_elegans.WBcel215.69.gtf -L N2,UV -o cuffdiff SRR454084.bam SRR454085.bam
- 38. RNAseq データ 解析の流れ1 ゲノムに対する多重配列アラインメント .bam ゲノムアノ テーション .gtf 予測転写単位ごとの （推定）発現量情報 SRR001356.1 2023DAAXX:5:1:123:563 length=33! TGTCGGTCCAGCTCGGCCTTGGGCTCCGTTTTC! +SRR001356.1 2023DAAXX:5:1:123:563 length=33! -IIIIIIII8IIIIIIIIIII6IIIIIIIII9I! @SRR001356.2 2023DAAXX:5:1:123:476 length=33! TCTGAACCCGACTCCCTTTCGATCGGCCGCGGG! +SRR001356.2 2023DAAXX:5:1:123:476 length=33! IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIGIIIIIII-III! @SRR001356.3 2023DAAXX:5:1:121:746 length=33! GTGGCAGCGTTTTTGGGCCCGCCGCTTGCCGTT! +SRR001356.3 2023DAAXX:5:1:121:746 length=33! IIIII&IIIIIIIIIIIIIIIIHI1IIIIIIII FASTQ ゲノム .fa 1.tophat (bowtie) 2.cufflinks 3.cummeRbund 38 遺伝子アノ テーション
- 39. 5. データの解釈
- 40. 発現解析 • 2つの状態を比べた時に遺伝子発現が! –上がった遺伝子群! –下がった遺伝子群! –例: ヒト培養細胞で低酸素刺激して発現が2倍上 がった遺伝子100個中20が転写因子。これは有意?! • ヒトには約三万個の遺伝子に約千ほどの転写因子。! • 30,000 x 20/100 = 6,000 なので…! • GSEA(Gene Set Enrichment Analysis) 40
- 41. DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery) 41
- 42. 42
- 43. 43
- 44. 44
- 45. 45
- 46. © 2013 DBCLS Licensed under CC 表示 2.1 日本 #NGLSBI © 2014 DBCLS Licensed under CC 表示 2.1 日本 RefEx: 遺伝子発現 リファレンスデータセット • 臓器ごとの発現比較を4つの実験手法と BodyParts3Dで! –正常組織・臓器における遺伝子発現のリファレンス! –再利用可能で有用なパブリックデータの活用例! • 「組織特異的遺伝子」検索機能の実装 46 EST Classical Expressed Sequence Tags GeneChip Affymetrix’s microarray CAGE Cap Analysis of Gene Expression RNAseq Transcriptome Sequencing http://RefEx.dbcls.jp/
- 47. © 2013 DBCLS Licensed under CC 表示 2.1 日本 #NGLSBI © 2013 DBCLS Licensed under CC 表示 2.1 日本© 2013 DBCLS Licensed under CC BY 2.1JAPAN 47http://RefEx.dbcls.jp/
- 48. © 2013 DBCLS Licensed under CC 表示 2.1 日本 #NGLSBI © 2013 DBCLS Licensed under CC 表示 2.1 日本© 2013 DBCLS Licensed under CC BY 2.1JAPAN 48
- 49. © 2013 DBCLS Licensed under CC 表示 2.1 日本 #NGLSBI © 2013 DBCLS Licensed under CC 表示 2.1 日本© 2013 DBCLS Licensed under CC BY 2.1JAPAN 49
- 52. SRA(Sequence Read Archive) • NGSのデータベース(除くヒト個人のデータ)! • NCBI/EBI/DDBJによって維持管理! –DDBJはDRAとも呼称 52 Image generated by http://sra.dbcls.jp/ NBDCヒトデータベース http://humandbs.biosciencedbc.jp/
- 54. 遺伝子発現データベース • GEO(NCBI)とArrayExpress(EBI)! –http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ –http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/ • RNAseqデータはこちらにも登録がある! –Transcriptome analysisとも! ! • 必要なデータを見つけづらい 54
- 55. GEO目次 55
- 56. UCSC Genome Browser! は再利用可能データの宝庫 ‘Track’を追加 56 http://genome.ucsc.edu/
- 58. カスタマイズしよう 58
- 59. 59
- 60. 60
- 62. 自分のデータもSRAへ登録 • 論文掲載の必須条件になっていることも! • データを他の研究者に再利用してもらうこと が研究の価値を高める上でとても大事! ! • 日本だとDRA(DDBJ)へ! • 日本語でのやりとり 62
- 64. データ登録 64