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Single-cell RNA sequencing
- 2. Bulk RNA-seq vs. scRNAseq 1 2 3 4 Gene name Gene list Differentialexpression *** *** *** ns
- 3. Bulk RNA-seq vs. scRNAseq 1 2 3 4 Gene name Gene list Differentialexpression 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 Muscle Intestine Neuron *** *** *** ns
- 4. Bulk RNA-seq vs. scRNAseq 1 2 3 4 Gene name Gene list Differentialexpression 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 Muscle Intestine Neuron 기존의 bulk RNA-Seq로는 적은 수의 세포 때문에 생기는 영향은 드러나지 않을 가능성이 높다. 1 2 3 4 Target neuron *** *** *** ns
- 5. RNA-seq 시료 선충처럼 크기가 작은 생물은 total RNA 양도 적어, bulk RNA-Seq에서는 수천, 수만 마리의 평균값 밖에 볼 수 없다. Altun and Hall, 2005
- 6. Cell isolation Indexing Sequencing Alignment Dimensionality 축소 추가 분석
- 7. Cell isolation Indexing Sequencing
- 8. 실험 과정 Cell isolation Zhang et al., 2011 Whole organism Cao et al., 2017 Cell에서 발현되는 transcript에 cell마다 서로 다른 label을 달아줌 Altun and Hall, 2005
- 9. Cell isolation Synchronization Zhang et al., 2011
- 10. Cell isolation Growth Zhang et al., 2011
- 11. Cell isolation Cuticle 약화 Zhang et al., 2011
- 12. Cell isolation Proteinase 처리 Zhang et al., 2011
- 13. Cell isolation Isolated cells Zhang et al., 2011
- 14. Indexing Cao et al., 2017 RT (RNA cDNA) Tagmentation & PCR
- 15. Indexing Cao et al., 2017 RT (RNA cDNA) TranscriptAAAA TTTT Index UMI ACGACGCTCTTCCGATCT[8 bp UMI][10 bp index][30 dTs]VN UMI (unique molecular identifier): 각 transcript마다 다른 게 붙음 Index: 각 well마다 다른 게 붙음
- 16. Indexing Cao et al., 2017 RT (RNA cDNA) TranscriptAAAA TTTT Index UMI cDNA ACGACGCTCTTCCGATCT[8 bp UMI][10 bp index][30 dTs]VN UMI (unique molecular identifier): 각 transcript마다 다른 게 붙음 Index: 각 well마다 다른 게 붙음
- 17. Indexing Cao et al., 2017 Tagmentation ds cDNA Pooling & splitting Tn5 transposase 이때도 indexing 하나 추가해서 다시 pooling & splitting 가능
- 18. Indexing Cao et al., 2017 PCR i5 index i7 index P5 adapter P7 adapter
- 19. Indexing Cao et al., 2017 i5 index UMI RT index i7 index [i5 index #] X [RT index #] X [i7 index #] 104~106 조합 가능 이렇게 다 끝나면 전부 섞어서 한번에 sequencing 보낸다. Paired-end로 양끝을 읽어 한쪽은 index 읽고 한쪽은 RNA도 읽기 96 bp 45 bp
- 20. Alignment Dimensionality 축소 추가 분석
- 21. Alignment 시퀀싱 후에 paired-end read를 얻을 수 있는데, 이를 reference genome에 align해서 어떤 transcript가 발현됐는지 확인한다. Haas and Zody, 2010
- 22. Alignment 처리 Index 조합 정보(cell ID) + transcript 정보(gene ID) 108~109개 reads를 처리해서 각 cell마다 어떤 gene이 발현됐는지 통합해야 함
- 23. Alignment 처리 Index 조합 정보(cell ID) + transcript 정보(gene ID) 108~109개 reads를 처리해서 각 cell마다 어떤 gene이 발현됐는지 통합해야 함 Cell1 1 0 0 0 1 2 3 0 0 0 2 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 Cell2 0 0 1 0 2 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 Cell3 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 0 1 0 1 1 GeneID1 GeneID2 GeneID3 GeneID21 …… ……
- 24. Alignment 처리 Index 조합 정보(cell ID) + transcript 정보(gene ID) 108~109개 reads를 처리해서 각 cell마다 어떤 gene이 발현됐는지 통합해야 함 Cell1 1 0 0 0 1 2 3 0 0 0 2 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 Cell2 0 0 1 0 2 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 Cell3 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 0 1 0 1 1 GeneID1 GeneID2 GeneID3 GeneID21 …… …… 2만 개 유전자 104~105개 세포 104 rows (cell ID) X 20,000 columns (gene ID)도 크기 때문에, 직관적으로 보여주려면 차원을 축소시켜야 함
- 25. Dimensionality 축소 (예제: PCA) Sample = ER+ or ER- 두 종류 (cell ID) Expression = GATA3 or XBP1 두 종류 (gene ID) Ringnér 2008
- 26. Dimensionality 축소 (예제: PCA) Sample = ER+ or ER- 두 종류 (cell ID) Expression = GATA3 or XBP1 두 종류 (gene ID) Ringnér 2008
- 27. Dimensionality 축소 (예제: PCA) Sample = ER+ or ER- 두 종류 (cell ID) Expression = GATA3 or XBP1 두 종류 (gene ID) 두 유전자 발현 정보가 아니라, 이 둘을 적절히 조합한(linear combination) PC1을 새로운 축으로 삼으면 차원 축소 가능. Ringnér 2008
- 28. Dimensionality 축소(UMAP) Cell1 1 0 0 0 1 2 3 0 0 0 2 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 Cell2 0 0 1 0 2 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 Cell3 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 1 0 1 0 1 1 GeneID1 GeneID2 GeneID3 GeneID21 …… …… 20,000개짜리 gene 정보를 2~3개 축으로 축소 요샌 t-SNE나 UMAP 등을 씀 Becht et al., 2018
- 29. 그 외 분석 Cell마다 gene expression 확인 가능 Cell type 따라 평균 내면 정확도 높음 Cell type-specific expression 확인 모르는 cell type에 대한 marker 찾기 새로운 cell type ID Developmental trajectory 예측 Becht et al., 2018
- 30. 한계 Commercial product는 비쌈 ex) 10x Chromium은 16 rxn에 2,000만 원 + 시퀀싱 비용 한 cell에서 잡아낼 수 있는 유전자 종류 102개 수준 개별 세포가 실제 조직이라는 공간에서 어떻게 분포하는지는 알 수 없음 RNA 말고 다른 feature를 동시에 보는 일은 아직 어려움
- 31. 가능한 사례 – heterogeneity 높은 경우 Bulk RNA-Seq scRNAseq 같은 cell line이라도 gene expression 차이가 큰 cancer cell population 등에서는 새로운 현상을 보기에 유용하다.
- 32. 가능한 사례 – 모르는 게 많을 경우 발생 중인 human cell 25만 개를 scRNAseq으로 분석 중
- 33. 힘드니까 나머진 따로 물어보십쇼 감사합니다