Kulacık Mantarı Geliştiriciliği

1. Gelişme raporu
Mustafa Kemal SOYLU
1Atatürk Bahçe Kültürleri Merkez Araştırma Enstitüsü

2. Proje ekibi
1. M.Kemal SOYLU
2. Mustafa Öztürk
3. Ethem Emre Özkoç
4. Dr. Mehmet Özdemir
5. Orhan Üçüncü
6. Gökhan Yıldırımlı
7. Ahmet Yiğit
8. Fahrettin Doğan
9. Mustafa Yeğin
10.Prof.Dr.Kaya BOZTOK
Proje yararlanıcısı: Yalova Orman İşletme müdürlüğü
Proje ortakları:
Atatürk Bahçe Kültürleri Merkez Araştırma Enstitüsü
Ege Üniversitesi Bahçe Bitkileri Bölümü
Proje süresi: 12 ay (ekim 2011-ekim 2012)
2Atatürk Bahçe Kültürleri Merkez Araştırma Enstitüsü

3. Genel Amaçlar
 Bölgemiz mantarcılık sektörünün ulusal ve uluslar
arası rekabet gücünü arttırmak
 Mantar ürün çeşitliliğini arttırmak
 Tarımsal kalkınmayı sağlamak
 Kırsal alanlarda yeni iş ve ististam olanakları
sağlanarak köyden kente göçü azaltmak ve işsizliği
önlemek
 Bölge planı uygulanarak model ormancılığın
gelişimine katkıda bulunmak
3Atatürk Bahçe Kültürleri Merkez Araştırma Enstitüsü

4. Özel Amaçlar
 Yabani kulacık mantarlarının (Pleurotus eryngii
kompleks türleri) moleküler karakterizasyonunu
yaparak farklı ırk ve varyetelerini belirlemek
 Yeni kulacık mantarı çeşit ve/veya çeşit adaylarını
ıslah etmek
 Kulacık mantarının yetiştiriciliğini geliştirmek
4Atatürk Bahçe Kültürleri Merkez Araştırma Enstitüsü

5. Temel Faaliyetler
5Atatürk Bahçe Kültürleri Merkez Araştırma Enstitüsü
No Faaliyet Süre Uygulama
birimi
Görevliler
1. P. eryngii kompleks
türlerinin moleküler
karekterizasyonu
1-6. ay PSU Mustafa Kemal SOYLU
Prof. Dr. Daniel ROYSE
2. Kulacık mantarının
seleksiyon ıslahı
7-9.ay ABKMAE Mustafa Kemal SOYLU
Prof. Dr. Kaya BOZTOK
3. Kulacık mantarının
yetiştiriciliğinin
demonstrasyonu ve
eğitimi
10-
12.ay
YOİM Dr. Mehmet Özdemir
Mustafa Öztürk
Orhan Üçüncü
Gökhan Yıldırımlı

6. Faaliyet 1. Pleurotus eryngii kompleks türlerinin moleküler karakterizasyonu
1.1. Kültür koşulları ve DNA’nın izolasyonu
Pleurotus eryngii kompleks türleri izolatları, steril Patates
dekstroz broth (PDB) içeren 125 ml’lık erlenlerde geliştirilecektir.
Broth ve miselyum, miracloth® (Calbiochem)’ dan geçirilerek
filtre edilecektir. Miselyum steril suyla çalkalanacak ve iki kez
suyu sıkılacaktır. 2 ml’lik epandorf tüplere yerleştirilerek
liyofilize edilecek ve oda sıcaklığında bir cam desikatörde
depolanacaktır. Liyofilize miselyum elle 1.5 ml epandorf tüp
içinde bir mikro havaneli ile öğütülecektir. DNA ekstraksiyonu
DNeasy® bitki kiti (Qiagen) kullanılarak, üretici firmanın
protokolüne göre yapılacaktır. DNA konsantrasyonu, agoroz
jelde ve spektrometrede hesaplanacaktır. DNA stok solüsyonları
20 µg/µl’ye steril distile su ile ayarlanacak ve kullanılıncaya kadar
-20 OC’de saklanacaktır (Rodriguez ve ark. 2010).
6Atatürk Bahçe Kültürleri Merkez Araştırma Enstitüsü

7. 1.2. Kullanılacak gen bölgeleri ve primerler
Çalışmada EF-1ά ve RPB2 gen bölgelerinin kullanılması planlanmaktadır.
EF-1ά gen bölgesi için kullanılacak primerler:
EF160R (5’CCGATCTTGTAGACGTCCTG 3’) ve
EF595F (5’ CGTGACTTCATCAAGAAGATG 3’) primerleri,
4-6 ekzonları hedefleyen ve 4 ve 5 intronlarını uzatan EF1ά geninin bir
kısmını çoğaltmak için kullanılacaktır.
RPB2 gen bölgesini çoğaltmak için:
fRPB2 5F (5’ GAYGAYMGWGATCAYTTGG) ve
bRPB2 7.1R (5’ CCCATRGCYTGYTTMCCCAT AGC 3’) primerleri kullanılacaktır
PCR karışımı hazırlanırken toplam PCR reaksiyonu 25 µl olacak şekilde, her
primerden 10 µM ve 60 ng DNA kullanılacaktır. PCR koşulları, Rodriguez ve
ark. 2010’nın belirttiği şekilde yapılacaktır: EF1ά amplikasyon için 94 OC/4 dk;
36 döngü 94 OC/1 dk, 55 OC/1 dk, 72 OC/1 dk ve son uzama basamağı 72 OC/10
dk’dır. RPB2 geninin amplikasyonu için PCR koşulları; 94 OC/5 dk; 35 döngü
94 OC/1 dk, 57 OC/1 dk, 72 OC/90s ve son uzama basamağı 72 OC/10 dk’dır. PCR
ürünleri ethidium bromide (0.16 µl/ml) ile boyanarak %1’ lik agaroz jel içinde
elektroforez ile görüntülenecektir. DNA yükleme buffer (5x, 2 µl/ml) + 5 µl
PCR ürünü jele yüklenerek ve 2.3 – 3.3 v/jel ile yaklaşık 30 dakika
elektroforezlenecektir.
7Atatürk Bahçe Kültürleri Merkez Araştırma Enstitüsü

8. 1.3. DNA Sekans Analizi
PCR ürünleri, saflaştırma kitiyle, temin edileceği üretici
firmanın talimatlarına göre saflaştırılacaktır. Sekans
analizi için saflaştırılmış örnek, DNA’nın 40 ng/ µl’ye
ayarlanması için (SPD1010 SpeedVac® system ile)
yoğunlaştırılacak veya seyreltilecektir. EF-1ά (EF595 F) için
forward primer ve RPB2 (b11R1 ve bRPB2 7.1 R) için reverse
primerleri sekans analizlerinde (1 µM her biri)
kullanılacaktır. Birçok örnekle aynı anda çalışabilmesi için
sekans analizleri için tasarlanmış 96’lık plateler
kullanılacaktır. Sekans analizi, Beckman CEQ 8800 marka
DNA sekans analiz cihazında yapılacaktır.
1.4.Sekans Veri Analizleri
Sekans kromotogramları, Sequencer version 4.10 (Gene
Codes, Ann Arbor, MI) yazılımı ile görüntülenecek ve
incelenecektir. Sekans dizilimleri, istatistik analizleri ve
dendogramların hazırlanması PAUP 4.0b10 (Swofford,
2002) programında yapılacaktır.
8Atatürk Bahçe Kültürleri Merkez Araştırma Enstitüsü

9. Faaliyet 2.Kulacık mantarının seleksiyon ıslahı
2.1 Farklı sıcaklıklarda gelişebilen üstün
performanslı izolatların seçimi
Elde edilen ve moleküler karekterizasyon
sonucunda seçilen izolatlar ve standart çeşit (M
2600), PDA ortamında, dört farklı sıcaklıkta (15,
20, 25, 30 OC) kültüre alınarak farklı sıcaklıklarda
gelişebilen, misel gelişim hızı yüksek olan üstün
performanslı izolatlar seçilecektir. Deneme
tesadüf parselleri deneme deseninde 3 tekerrürlü
olarak kurulacaktır.
9Atatürk Bahçe Kültürleri Merkez Araştırma Enstitüsü

10. 2.2. Farklı sıcaklıklarda mantar oluşturabilen P. eryngii
kompleks türleri izolatlarının belirlenmesi
 Daha önceki aşamalarda seçilen izolatlardan tohumluk miseller elde edilecektir. P.
eryngii kompleks türleri mantarının tohumluk misel üretiminde buğday tanesi
kullanılacaktır. Misel sardırma materyalinin nem oranları % 60-70 civarına
ayarlandıktan sonra, alçı ve kireçle pH’ları 6.5 civarına ayarlanarak kavanozlara 2/3’ü
oranlarında ya da otoklav ısısına dayanıklı plastik torbalara doldurulacaktır. Otoklavda
121oC’de 1.2 atm basınçta bir saat tutularak sterilize edilecektir. Aşılama odasında
misellerden her bir kavanoza ya da plastik torbaya 2 parça ilave edilecektir. Misellerin
optimasyonu aşamasında belirlenecek olan en uygun sıcaklıkta tohumluk misel
gelişimleri sağlanacaktır.
 %48 talaş, %22 pamuk çiğidi küspesi, %25 Buğday kepeği, %3 mısır küspesi, %1 şeker, %1
alçı içeren standart bir yetiştirme ortamı %70 nem içermesi sağlandıktan sonra 1 kg’lık
otoklava dayanıklı plastik torbalara doldurularak 121 oC’de 1 saat sterilize edilecektir
(Royse 2003).
 P. eryngii kompleks türleri mantarlarına ait tohumluk miseller sterilize edilmiş olan
yetiştirme ortamına % 5 oranında inoküle edilecek ve 25 OC ve %90 neme ayarlanan
inkübasyon odasında misel gelişimleri sağlanacaktır.
 Misel gelişimi tamamlandıktan sonra; primordiyum ve mantar oluşum aşamasında ise
dört farklı sıcaklıkta (15-20-25 ve 30 OC) farklı kulacık mantarı izolatları
yetiştirilecektir. Diğer iklim özellikleri (Işık: 750 lux, nem:% 90, havalandırma: 4-5
kez/s) sabit tutulacaktır. Yapılacak olan verim ve kalite özelliklerine göre daha üstün
nitelikli izolatlar çeşit adayı olarak seçilecektir.
 Deneme tesadüf bloklarında bölünmüş parsellerde 3 tekerrürlü olarak kurulacaktır.
Ana parseller, Sıcaklıklar; alt parseller ise farklı izolatlar olacaktır.
10Atatürk Bahçe Kültürleri Merkez Araştırma Enstitüsü

11. Denemede incelenecek gözlem ve analizler
Misel gelişimi ile ilgili ölçümler
1. Kültürlerin gelişmeye başlama süreleri (gün)
2. Kültürlerin gelişme hızı (mm), tipi ve formu
3. Kültürlerin gelişim süreleri (gün)
11Atatürk Bahçe Kültürleri Merkez Araştırma Enstitüsü

12. Yetiştirme ortamında incelenecek analiz ve gözlemler
1. Toplam Azot Analizi
2. Kül Analizi
3. Karbon Hesaplaması
4. C:N Oranının Hesaplanması
5. Fosfor Analizi
6. Diğer Mineral Madde Analizleri
7. pH Analizi
8. Nem İçeriği
12Atatürk Bahçe Kültürleri Merkez Araştırma Enstitüsü

13. Verim ile ilgili ölçümler
 Ortamda misel gelişim süresi (gün)
 Primordium oluşum süresi (gün)
 Primordium sayısı
 Mantar sayısı ve oranı
 Toplam Verim
 Biyolojik etkinlik
Atatürk Bahçe Kültürleri Merkez Araştırma
Enstitüsü 13

14. Mantarların kalitesi ile ilgili yapılacak analizler ve ölçümler
1. Mantar Ağırlığı
2. Şapka Çapı
3. Sap Çapı
4. Sap Uzunluğu
5. Protein içeriği
6. Renk
7. Toplam Kuru madde
8. Kül tayini
9. Askorbik asit
10. pH
11. Antioksidan Aktivitesinin Tayini
12. Toplam Fenolik Madde Miktarı
14Atatürk Bahçe Kültürleri Merkez Araştırma Enstitüsü

15. Faaliyet 3. Kulacık mantarının yetiştiriciliğinin demonstrasyonu ve
eğitimi
 Kulacık mantarı yetiştiriciliği için Orman ve Kırsal alandaki köylerden
birinde demostrasyon amaçlı kulacık mantarı üretimi
gerçekleştirilecektir.
 Mantarın üretileceği tohum ve yetiştirme ortamı Atatürk Bahçe Kültürleri
Merkez Araştırma Enstitüsünde yapılacaktır. Tohumluk misel ekili
torbalar demostrasyon alanındaki odaya yerleştirilecektir. Odanın
iklimlendirmesi yapılarak üretim için gerekli sulama ve bakım işleri
Orman İşletme Müdürlüğünce yürütülecektir.
 Ayrıca Hedef gruplara Kulacık mantarı yetiştiriciliği ile ilgili eğitim
verilecektir. Eğitim sırasında Penisylvanya State Üniveristesi’nden Prof.Dr.
Daniel Royse seminer verecektir. Uygulamalı bir eğitim verilecektir.
 Eğitim için çiftçi broşürü, kitapçık ve afiş hazırlanacaktır. Broşür ve
Kitapçıklar eğitime katılan hedef gruba dağıtılacaktır. Afişler ise Tarım ve
Orman teşkilatlarına ve konu ile ilgili sivil toplum örgütlerine ve Mantar
işletmelerine dağıtılarak buralarda asılacaktır.
15Atatürk Bahçe Kültürleri Merkez Araştırma Enstitüsü

16. BEKLENEN SONUÇLAR
 P.eryngii kompleks türlerinin filogenetik analizi yapılarak
Türkiye’de farklı ırk ve varyeteler belirlenecektir.
 Bu mantar kompleks türlerinin bir ırkı (var. nebrodensis)
IUCN’in türü çok tehlikede olan kırmızı listesindedir.
Ülkemizde de P.eryngii kompleks türleri bulunduğu doğal
alanlarda yok olma tehlikesi ile baş başa kaldığı görülmüştür. Bu
proje ile bu mantar türünün gen kaynağı olarak saklanması
sağlanmış olacaktır.
 Ayrıca bu çalışma ile, farklı sıcaklıklarda mantar oluşturabilen
çeşit veya çeşit adayları da elde edilebilecektir. Türkiye’nin
yaklaşık 25 bin ton kültür mantarı üretimi vardır. Bu mantar
üretiminde kullanılan tohumluk misel çeşitleri yabancı
çeşitlerdir. Henüz yerli bir çeşidimiz yoktur.
 P. eryngii kompleks türleri, farklı sıcaklıklarda da
geliştirilebildiğinden (15-20-25-30 OC) enerji maliyeti de büyük
ölçüde düşmüş olacaktır.
16Atatürk Bahçe Kültürleri Merkez Araştırma Enstitüsü

17. BÜTÇE
17Atatürk Bahçe Kültürleri Merkez Araştırma Enstitüsü
Bütçe Miktar (TL) Oranı
Ajanstan talep edilen bütçe 210.000 % 70
Eş-finansman 90.000 % 30
Toplam bütçe 300.000 % 100

18. TEŞEKKÜRLER
Atatürk Bahçe Kültürleri Merkez Araştırma Enstitüsü 18