1. POT L’ESTÓMAC D’OVELLA DEGRADAR EXPLOSIUS?
El High Melting Explosive o HMX (octahydro-1,3,5,7-tetranitro-1,3,5,7-tetrazocine) és un
compost xenobiòtic (fabricat artificialment) que explota violentament a altes
temperatures. Gràcies a aquesta propietat s’utilitza en varis tipus d’explosius,
combustibles de coets i càrregues explosives.
El HMX té una adsorció en sòl i pressió de vapor baixa cosa que causa la seva filtració en
aigües subterrànies properes de llocs de fabricació, emmagatzematge i ús. Degut al seu
caràcter recalcitrant, la filtració produïda per l’ús de HMX en sòls i aigües subterrànies
provoca l’acumulació d’aquest. La vida mitjana del HMX és superior a 6 anys en sòl i més
de 20 en aqüífers. L’acumulació de HMX en el medi provoca una toxicitat tant en animals
com en humans residents, com per exemple danys en el fetge i en el sistema nerviós
central de rates, ratolins i conills (animals amb els que s’han dut a terme diferents
exàmens de toxicitat) en el cas de ser inhalat o amb el contacte amb la pell.
Degut a l’impacte ambiental provocat per l’acumulació de HMX és interessant dur
estratègies de bioremediació. Aquesta consisteix en l’ús de microorganismes per
eliminar o destoxificar substàncies químiques tòxiques o indesitjables del medi ambient.
Per a degradar el HMX es poden utilitzar diverses estratègies. Una d’elles és el
bioaugment que consisteix en la addició de microorganismes especialitzats al medi amb
la finalitat de potenciar la bioremediació. Una altra és la bioestimulació que introdueix
modificacions en el medi ambient (aport de nutrients, aport d’oxigen, ajust de pH, aport
d’acceptors d’electrons, etc.) per afavorir o potenciar l’activitat de la microbiota
autòctona (bioremediació intrínseca). També es pot utilitzar la fitoremediació que es
basa en la realització de bioremediació per part de plantes.
Lligant la fitoremediació amb el que s’ha comentat anteriorment sobre l’impacte
ambiental, s’ha demostrat que les plantes no transformen el compost d’interès (HMX)
però sí que el transporten als seus teixits aeris (Groom et. al., 2001). A més a més,
plantes herbàcies poden néixer sobre sòls contaminats amb HMX i són capaces
d’acumular-ho als seus brots. Diversos estudis (Fleischmann et. al., 2004; Smith et. al.,
2008; De Lorme & Craig, 2009; Eaton et. al.,2011; Perumbakkam & Craig, 2012 i Eaton
et. al. 2013) van aprofitar aquesta característica per introduir la degradació del HMX
pels microorganismes del rumen fent que les ovelles mengessin les herbes que
acumulen el HMX. El procés complet rep el nom de bioremediació fito-rumial.
L’estudi plantejat per Eaton, Hillary L. et. al. compara la degradació de HMX per part del
Whole Rumen Fluid (WRF) i per part de 23 soques obtingudes de col·leccions
internacionals. Aquestes 23 soques pertanyen al rumen d’ovelles i es van estudiar
anteriorment. Es coneix que degraden diversos compostos explosius, entre d’ells el
HMX. L’objectiu d’aquest estudi era comprovar si el poder de degradació del HMX
pertany a les soques individuals (23 soques individuals) o un consorci d’elles (WRF),
que seria la comunitat de microorganismes del rumen d’ovella. La composició de les
Iñigo Lejardi Mentxaka
Miriam Luque Montoro
Núria Oliveras Cañellas
Edwin Anthony Silva

2. mostres un cop realitzada la possible degradació de HMX és analitzada per HPLC (High
Pressure Liquid Chromatography), per identificar els possibles degradadors i després
s’analitzen per LC-MS/MS (Liquid chromatography-tandem mass spectometry) per la
quantificació de metabòlits.
L’HPLC s’utilitza per determinar la concentració de HMX a les diferents mostres i LC-
MS/MS s’utilitza per la separació de HMX i els seus metabòlits. La cromatografia líquida
(LC) utilitza una fase mòbil d’acetat d’amoni en aigua i metanol. S’ha de puntualitzar
que la LC-MS/MS és un sistema on l’eluent passa directament a l’anàlisi mitjançant dues
espectrometries de masses. El primer espectròmetre dóna com a resultat la m/z dels
components trobats per LC i el segon ens permet saber quins àtoms formen el compost.
Es varen cultivar les 23 soques pures en medis de cultiu preparats anaeròbicament i en
altes concentracions de CO2. La mostra WRF es va obtenir de dues ovelles mascles,
provinents de la Oregon State University (OSU) Sheep Center (Corvallis, OR),
alimentades amb alfals dos cops al dia. Es van fer controls: dos de medi, un control de
medi amb LCB i HMX i un control de medi amb LNB i HMX. Els medis LCB i LNB són
medis amb baixa concentració de carboni i de nitrogen. Aquests controls no tenen
microorganismes (s’autoclaven). L’objectiu d’ells és demostrar que no hi ha una
degradació de HMX de tipus química dels explosius. També es va fer un control de
solvent que porta WRF, LCB i LNB sense HMX per comprovar que el medi per si sol no
contingui HMX i per tant, els microorganismes no el degradin.
Els resultats mostren dos TIC (Total ion chromatograms) del WRF inoculat amb HMX en
dos temps: 0,25 h i a 24 h. D’aquesta mostra s’obtenen tres components amb m/z1=149,
m/z2=193 i m/z3=229. Quan s’augmenta el temps, la intensitat dels pics dels
cromatogrames augmenta i per tant, es dedueix que augmenta la concentració d’aquests
compostos. Els resultats de la LC-MS/MS mostren tres espectres, un per pic,
corresponents als pics del TIC, que fan una relació d’intensitat respecte la relació massa-
càrrega mostrant exactament la massa de cada compost.
Els pics mostren tres metabòlits, components generats de la degradació de HMX per part
de WRF. El pic m/z1 correspon a N,N’-dinitroetà-1,2-diamina (C2H6N4O4 ) i el pic m/z2
correspon a 2-(hydroximetil)-1-nitroguanidina (C2H6N4O3) i el pic m/z3 no s’ha pogut
relacionar amb cap compost ja que actualment encara s’està investigant. Utilitzant
patrons de fragmentació és a dir, el conjunt de pics m/z trobats en l’espectrometria, es
pot proposar quins productes s’obtenen de la degradació del HMX. Amb aquests
productes es poden construir rutes metabòliques que duen a terme els microorganismes
a l’hora de la degradació d’aquest compost químic.
Els resultats obtinguts amb les 23 soques pures mostren que cap d’elles no és capaç de
biotransformar o biodegradar HMX. Les espècies bacterianes utilitzades sí degraden
explosius com el RDX, compost molt semblant en l’estructura química al HMX. La teoria
de la toxicitat va quedar descartada ja que en estudis previs les concentracions de HMX
eren del doble utilitzant les mateixes soques. Probablement, el medi de cultiu no és
òptim per a que aquests microorganismes degradin el HMX.

3. Els resultats obtinguts demostren que el HMX és més recalcitrant a la degradació que
altres explosius com el TNT i el RDX. Hi ha estudis que plantegen la degradació del TNT,
RDX i HMX per part de les 23 soques utilitzades. Algunes soques degraden el TNT,
d’altres són inhibides per aquest explosiu, d’altres poden degradar RDX i TNT però no
HMX, una soca de les 23 degrada abans el TNT abans que el RDX i una altra soca que no
és capaç de degradar cap compost d’aquests.
A banda de la tècnica utilitzada en aquest estudi, existeixen altres alternatives
químiques per poder eliminar aquest tipus de compostos però són cares i complicades
de dur a terme. La més comuna és la fotocatàlisi amb TiO2 on s’utilitzen làmpades UV i
són necessaris uns pH bastant neutres i grans quantitats de TiO2. Tot i que les valors de
degradació de HMX i RDX són alts, són necessàries unes característiques molt
específiques i econòmicament no és tant viable com la bioremediació fito-rumial. A més
a més, no es coneixen bé les conseqüències que pot tenir l’acumulació del TiO2 en el
medi. En comparació amb la tècnica descrita en aquest article, aquesta és molt més
pràctica i fàcil de dur a terme.
La conclusió final d’aquest estudi és que com a comunitat (WRF) són capaços de portar a
terme la degradació del HMX degut a les interaccions que mantenen entre ells. Això vol
dir que per dur a terme rutes metabòliques de degradació del HMX es necessita un
consorci entre les diferents espècies de microorganismes del rumen ja que per si soles
no són capaces de dur-la a terme. El consorci permet combinar i completar les funcions
metabòliques dels diferents microorganismes per a que col·lectivament biodegradin els
compostos. En definitiva, es pot dir que la bioremediació fito-rumial és una tècnica molt
vàlida a l’hora de degradar compostos energètics com el TNT i el HMX.