本研究成功构建了携带 ;02<9=14,* 基因的 >?@1慢病毒载体，并进行了靶点的有效筛选。通过感染和检测，发现特定靶点敲减效率显著，提高了对肿瘤细胞功能研究的潜力。研究为慢病毒基因治疗提供了实验平台和数据支持。

1. !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
收稿日期!"#$%&’$&’(
基金项目!河北省科学技术研究与发展课题基金项目!#("%)’’"*"
作者简介! 王明栋 !’+%$,"# 男 # 研究生$ 主治医师# 电话%$*’",!
(+-’"$)#./012%3045/6-’(7’)*89:/
通讯作者!史彦芳#电话%$*’",(+-’"$)
慢病毒携带人 ;02<9=14,* 基因 >?@1 的有效靶点筛选
王明栋 ’
!史彦芳 ’
!王 洪 ’
!马文斌 "
!王任直 "
"’
河北大学附属医院神经外科!河北 保定 $%’$$$!"
北京协和医院
神经外科! 北京 ’$$%*$#
摘要!目的 构建携带人 ;02<9=14,* 基因的 >?@1A慢病毒载体 B测定感染滴度#并对不同靶点进行有效筛选& 方法 根据
;02<9=14,* 基因设计 C 对#经退火制备的双链 D?@!:215:#连接经双酶切的线性化 E;FG,;HIJK) 载体#转化后经 IF>
鉴定#阳性克隆测序#质粒抽提#经 F0F2" 导入 "+*L 细胞#包装成慢病毒#收集病毒上清并检测其滴度& 将含 ;02<9=14,*
基因的 >?@1 病毒颗粒#感染靶细胞#荧光显微镜观察细胞荧光#感染率 M($N时#收集细胞抽提 >?@#>L,IF> 检测
;02<9=14,*O/>?@ 水平#评价干扰效果& 结果 经测序$IF> 分析证实目的序列成功连接到载体上#载体构建成功#包装
成高滴度慢病毒& 感染 PFH,% 细胞系后#细胞荧光显示感染率 M($Q#定量 >L,IF> 检测结果发现%’R
和 *R
靶点敲减
;02<9=14,* 基因效率达 +(Q$-(Q& 结论 成功构建并筛选了携带有人 ;02<9=14,* 基因的 >?@1!慢病毒载体及有效靶点#
为进一步研究 ;02<9=14,* 在肿瘤细胞中的作用提供实验平台&
关键词!>?@ 干扰’半乳凝素 ,*!基因$发夹结构’慢病毒’有效靶点筛选
中图分类号!>%*$’(CS!T%-(!!!!!!!!文献标识码!@!!!!!!!!文章编号!’)%*,C"(C!"$$-"$%,’")C,$C
!"#$%&’(%)"* +*, ),-*%).)(+%)"* ". /01 )*%-&.-&-*2- 3-*%)4)&+3 567&5$$)"* 452%"& ". 8+352%)*,9
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B!VWXAY04,Z045’
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BAU@?;A><4,][1"
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D<E0^=/<4=O:ZO?<_^:‘_^5<^aBO@ZZ1210=<6OW:‘E1=02O:ZOW<<1OK41b<^‘1=aBOc0:6145O$%’$$$BOF[140SO"
D<E0^=/<4=O:ZO?<_^:‘_^5<^aBOI<d145O
K41:4OP<61902OF:22<5<OW:‘E1=02BOc<1e145O’$$%*$BOF[140
1:$%&+2%; <:=-(%)4- L:O9:4‘=^_9=O0O^<9:/1404=O2<4=1b1^02OK)OE20‘/16‘OZ:^O>?@O14=<^Z<^<49<Of>?@1gO:ZO502<9=14,*O5<4<O046O
‘<2<9=O=[<O:E=1/02O=0^5<=O‘<h_<49<O:ZO502<9=14,*O5<4<OZ:^O>?@18 O>-%?",$ D:_2<,‘=^046<6O:215:OD?@‘O3<^<O6<‘154<6O046O
‘a4=[<‘1]<6O099:^6145O=:O=[<O‘<h_<49<O:ZO502<9=14,*O5<4<B O046O2150=<6O14=:O214<0^1]<6OE;FG,;HIJK)OE20‘/16OZ:22:3<6OaO
=^04‘Z:^/0=1:4O14=:O9:/E<=<4=ODW(! 9<22‘8 O@Z=<^OIF>O046O‘<h_<49<O0402a‘1‘OZ:^Ob<^1Z190=1:4O:ZO=[<OE:‘1=1b<O92:4<‘B O=[<O
E20‘/16OE;FG,;HIJK)O;02,*‘[>?@,’O30‘O<i=^09=<6O046O=^04‘Z<9=<6O14=:OF0F2",=^<0=<6O"+*LO9<22‘O=:O:=014O=[<Ob1^02Ob<9=:^‘O
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046A*k
A
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@"*23’$)"* L[<A^<9:/1404=A2<4=1b1^02AK)AE20‘/16AZ:^A>?@1A:ZA;02<9=14,*A5<4<A[0‘A<<4A‘_99<‘‘Z_22aA9:4‘=^_9=<6B A3[19[A
E^:b16<‘A=[<A0‘1‘AZ:^AZ_^=[<^A‘=_6aA:ZA=[<A^:2<A:ZA502<9=14,*A5<4<A14A=_/:^A9<22‘8
A-B C"&D$; >?@A14=<^Z<^<49<SA‘/022A[01^E14A>?@SA502<9=14,*A5<4<SA2<4=1b1^_‘AE20‘/16SA16<4=1Z190=1:4A
AAAAAAAA半乳凝素 ,* !;02<9=14,*#;02,*" 属糖联蛋白家
族#为 " 半乳糖酐特殊凝集素的嵌合体#由糖识别域
和短 ? 段结构域组成# 其糖识别域为重复胶原相似
序列#富含甘氨酸$酪氨酸$脯氨酸!与基质金属蛋白
酶有协同作用"#并为转录后变体所调节& ;02,* 在亚
细胞定位后表现出多效性生物功能# 有细胞黏附$抑
制凋亡$细胞周期调节$E^<,/>?@ 等过程#其中在侵
袭性垂体泌乳素腺胞浆内蛋白和 />?@ 高表达对侵
袭性和预后判断方面有一定作用(’,C)
&
>?@ 干扰!>?@A14=<^Z<^<49<BA>?@1"技术实现了
对改变干细胞进行器官重构$改变模式生物系统疾病
进程$分析和构建疾病模型的工具向疾病治疗工具的
转变& 本研究在已知 ;02,* 基因情况的前提下#通过
设计$ 构建和鉴定表达 ;02,*A‘[>?@ 慢病毒载体#并
进行有效靶点筛选#为研究 ;02,* 在肿瘤细胞中的作
用机制和利用慢病毒基因治疗的可能性提供数据&
’AA材料和方法
’8’AA材料
细胞系 PFH,%$"+*L 本实验室保存& DP.PA培
养 基fD_299:l‘P:61Z1<6A.052<A<61_/g和 新 生 牛 血 清
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA南方医科大学学报fmAV:_=[AP<6AK41bgAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA"$$-S"-f%g’")C* *

2. 图 !""酶切鉴定图
!"#$% &’( )(*+,- ./ 0"#1-".2
#$%&"!’"($)*&)"+$,,&)! #$%&"-’".+$/01,"
2134563"&%780&",19&/315%:"#$%&";’".+$/01,"
$<3&)",19&/315%
=>?@AB 公司C"慢病毒#上海吉凯基因生物技术有限
公司C"质粒提取试剂盒"DEF 凝胶回收试剂盒"限制
性内切酶"GH"DEF 连接酶"大肠杆菌 DIJ!"G$K 酶"
,EG."(1L"(M(#N"逆转录酶$,EG.%5+195",G" O%$/&"
?%41P135)"QR@O"($/3&)"(1L36)& 购自 G$*$O$ 生物有
限公司& 引物’北京三博生物技术有限公司(合成$二
甲亚砜’D(QB(’自 Q$%3$"A)67 公司($紫外线分光光
度仪 ’日本 SNM-HT$Q410$,76 公司($ 总 OEF 抽提
G)175+% BU31M(V("=>?@ABC$相差倒置荧光显微镜为
B+80U$1W 公 司 产 品 $ 定 量 .AO 仪 =O>M;TTTC 为
@15O$, 公司公司产品$ 其他试剂均为进口或国产分
析纯)
!X-""方法
!X-X!"""/4OEF 慢病毒载体设计合成 根据E(YTT-;TZ"
=>&%@$%*"C">$+&W31%M;"0OEF 序列$设计靶向第 JZ[%
ZJ;%Z-%ZZ] 位序列的 >$+&W31%M;M/4OEF^其序列为*
J_MW$>>F>F>GAFGG>GGG>AFFM;‘$J‘M$$>AAAFF"
G>AFFFAF>FFGGM;‘!J‘M3$FAAAFA>AGGAFFG>"
F>FFM;‘$J‘M33>AFFGFAFFF>AG>>FGFFM;‘) 制
备双链 DEF"5+195$ 引入酶切位点 !"#"和 $%&"$
!-a".F>V 非变性 .F>V 凝胶检测双链形成效率)连
接经 !"’ ?"和 $%& ? 双酶切后的线形化 U>A#M>b. 载
体$ 转化 DIJ! 感受态细胞$ 挑选重组阳性克隆行
.AO 及测序鉴定) 阳性克隆行 .AO 引物*SUc*J‘M"
>AAAA>>GGFFGGG>AFGFGM;‘$D52%M*J‘M>GFFG"
FA>>GGFGAAFA>A>M;‘)
!X-X-""慢病毒包装 制备含有 >b. 慢病毒包装质粒
DEF 溶液 #NM/4OEF">$+&W31%M;"-T"#9$ 与 A$A+-=-XJ"
05+d#C"溶液混匀$将 DEFM 磷酸钙混合液转移至细胞
密度为 ZTae[Ta的单层 -;G 细胞培养液中$混匀$
培养$!-"4 后换培养基$继续培养 H]"4$收集转染 [-"4
的 -;G 细胞上清液$H"!+HTTT"9 离心 !T"01% 后以
TXHJ"#0 滤器过滤$ 再以 H"!%-J"TTT")d01% 离心 T"
01%$以冰 .@Q 液重悬病毒沉淀$H"!溶解过夜$分装
置于![T"!冰箱中保存& 重悬 -;G 细胞’J""!TJ
d0+(
于 Z 孔板$ 将梯度稀释后的病毒颗粒加入$;["!温
育 ]"4 后$ 更换含 !TT"0+d#"b@Q 的培养液继续培养&
倒置荧光显微镜下检测 >b. 表达量$计算病毒滴度&
!X-X;""细 胞 分 组 与 感 染 调 整 (AbM[ 细 胞 密 度 为
Ta时$进行转染试验$分为 F 组*空白组$@ 组无关
序 列 发 夹 结 构 慢 病 毒 阴 性 对 照 组 $A 组 U>A#"
>$+&W31%M;/4OEF 慢病毒干扰组’有 H 个靶点(& TXHa
的台盼兰计算细胞& 根据不同的 (B? 值$加入适宜量
病毒$!-"4 后观察细胞状态*未见明显细胞毒性作用$
培养 H]"4 后更换培养基!有明显细胞毒性$则立即更
换培养 基 ! 感 染 HeJ", 后 观 察 慢 病 毒 上 报 告 基 因
>b.dOb. 的表达情况$ 感染效率大于 JTa者继续培
养$ 然后收集细胞抽提 OEF 进行 OGM.AO 检测实
验!感染效率低于 JTa的实验组$重新进行感染实验&
!X-XH"O&$+310&M.AO 检验细胞中 >$+&W31%M;0OEF 水
平 >$+&W31%M; 引 物 和 FW31% 引 物 采 用 软 件 @&$W5%"
,&/19%&)"- 设计$引物序列*b"J‘M>F>AAGFAAAG>AA"
FAG>M;‘$OJ‘MG>FAGAGAAG>GG>GGAGAFGG>M;‘$
bJ‘M>G>>FAFGAA>AFFF>FAM;‘$OJ‘MFFF>>>G>"
GFFA>AFFAGFM;‘! 分别对慢病毒质粒感染的 Z"组
细胞用 G)175+"裂解提取总 OEF& 每组取 !"#+ 用紫外
线分光光度仪测 OEF 产量$将 0OEF 逆转录为稳定
的 WDEF$置于!]T"!保存备用& 实时定量 .AO 反应
体 系 为 *SU%D52%" U)10&) 各 为 !" #+%WDEF" !" #+%
QR@O"U)&01L"&L"3$K"!T"#+% 水 ["#+ 总体积为 -T"#+$
.AO"反应条件如下*J"!$!JQ!J"!$JQ!ZT"!$;T"/!
共 HJ 个循环& 每次延伸阶段读取吸光值& 熔解曲线*
.AO 结束后$J"!$!"01% 冷至 JJ"!$从 JJ"!至 J"!$
每一步增加 TXJ"!$保持 ;T"/$同时读取吸光值& 扩增
产物用 -a琼脂糖凝胶电泳$ 溴乙锭显色$O&$+M310&"
.AO 数值分析采用标准曲线分析法$ 制图软件采用
>)$U4.$,".O?Q("HXT"&
-""结果
-X!""目的基因 OEF 干扰慢病毒载体的制备与鉴定
>$+&W31%M; 基因 /4OEF 核苷酸序列经退火形成
双链 DEF"5+195$行 !-a.F>V 非变性 .F>V 凝胶检
测后$用 !"’ ?"和 $%& ? 双酶切 U>A#M>b. 载体后线
形化$与未经酶切载体比较’图 !($将线形化载体与
DEF"5+195 经行 GH 噬菌体连接$ 产物转化 DIJ! 感
受态细胞$挑选阳性重组克隆$.AO 鉴定$重组克隆
.AO片段为 ;]H"PU$未插入的空载体 .AO 片段为 ;--"
PU’图 -($鉴定结果与预期相符$测序结果表明合成
的 >$+&W31%M;/4OEF 序列插入正确&
第 [ 期 王明栋^等X慢病毒携带人 >$+&W31%M; 基因 OEF1 的有效靶点筛选 !-ZJ, ,

3. 图 !""内源靶点验证荧光图!#$为 %&’() 细胞未感染病毒的细胞组"*#为 %&’() 细胞加阴性病毒
感染的细胞组"&(’$为正常目的细胞加靶点 +(, 病毒感染的细胞组
!"#$% &’()*+, -.+/0.)1.+)2 34!(56!(’ 78#*/"9: -.+/0.);<4=(5>+.+ ?@:-"*) ?:AB:+-:6!4(=’
<4=(5>?CD7& >E.B0 ?"/: F0.B@
#
’-’+.-.+
/-/+&-&+
*-*+
图 -""0&1 结果
="#$G HC: 0:?B)/ .E I4D @0.JB-/".+
2345"+$657389:5;<=48>=?!2345;-$%3>@5>;?3AA5>;!2345!$;
*?34@;<=48>=?!2345;,$;0?3BC9A;7>=DE!2345B;F(G$;’=D>;B985
-H-;;慢病毒包装与滴度测定
重组慢病毒质粒 EI&2(I’0JKL;I3?5<894(!(BM16#
和包装质粒混合物共同转染 -G!N 细胞"在倒置荧光
显微镜下" 观察各孔细胞 I’0"-,"M 后呈现绿色荧
光"细胞生长良好"表明病毒包装成功"测定病毒滴度
O 表达 I’0 的细胞数!病毒颗粒梯度稀释倍数# 测得
病毒颗粒滴度为$-!+PG
NKJC?#
-H!""16# 干扰有效靶点的筛选
将 含 有 EI&2QI’0J"KL"I3?5<894Q!QBM16# 重 组
慢病毒质粒"感染各组 %&’Q) 细胞"荧光细胞数量在
FPR以上者"说明转染率在 FPR"内源性靶点得到验
证%图 !&"则进行实时定量 0&1"低于 FPR者则重新
感染#实时定量 0&1 中! & 组%+S
靶点&/ 组%-S
靶点&
. 组%!S
靶点&’ 组%,S
靶点&%&’Q) 细胞中 I3?5<894Q!
的 C16# 表 达 量 同 对 照 组 # 组 %PHL+)R &* 组
%PHGG-R& 相比较分别为 PHP-TR’PH,-LR’PH+-PR’
PH,))R"从统计图 , 可以明确看出 +S
和 !S
靶点的干
扰效率分别达 GFR和 TFR以上"+S
靶点为最佳靶点#
!""讨论
16# 发夹结构 %16#"M39>E94"B8>D<8D>5& 可能是
16# 二级结构中最简单的一种"具有决定 16# 折叠
的成核位置"决定 16# 酶高级结构相互作用"保护
C16# 不被降解及被 16# 结合蛋白识别等作用 #
03AA9B=4 研究证实$/9<5> 核酸酶的底物是短发夹结
构"引起靶序列降解(F)
# 本实验采用短发夹 16#"无
疑对细胞水平基因功能的研究有帮助#
慢病毒U?5489:9>3?":5<8=>"2VW系统与常用病毒载
体相比"具有$能感染非分裂期和分裂期细胞!容纳外
源性大目的基因片段! VXVI 外壳使载体具有更强
的稳定性!不影响细胞的连续传代等特点# 我们设计
了四个干扰序列"和阴性’空白对照组"构建有 KL 和
.’+"U"5?=47389=4""Y3<8=>W启动子表达的慢病毒质粒载
体".’+ 驱动 I’0"在荧光显微镜下呈现绿色荧光 (L)
"
通过检测 .I’0 则可表明质粒所带基因片段%内源性
靶点&已成功转入细胞内并表达#
B916#"的效率依赖其反义链与靶 C16# 之间严
"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""南方医科大学学报UZ"X=D8M"%5A"K49:W"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""第 -T 卷+-LL* *

4. 格的碱基配对!若某个碱基错配会降低它对靶基因的
抑制效果 "但近来研究有持相反的观点!!"#$%&中一
个碱基的改变并不影响其整体活性!甚至四个碱基突
变 !"#$%&的干扰效应仍然存在! 此现象从侧面对
!"#$%&的特异性提出质疑 # 本研究阳性重 组 克 隆
’(# 鉴定显示$插入序列与设计序列完全一致!证明
了 )*(+,*-’.&/0&*12345"6,7,!8#$%&表 达 质 粒 构 建
成功" 之后转染 9(-,: 细胞观察绿色荧光验证内源
性靶点# 并采用通过 %45"6 基因水平校正实时定量
’(# 检测! 证实 ;<
和 7<
靶点对 *12345"6,7=#$% 有
显著敲减效果!敲减效率达 >?@和 A?@以上!其中 ;<
为最佳靶点#
我 们 构 建 的 +B 载 体 C; 启 动 子 可 获 得 长 效
#$%" 及在宿主细胞中持续表达的 !"#$%!并对目的
细胞进行多次感染# 94916D!&9&E 等学者研究支持
了上述观点$ 哺乳动物细胞中可能缺少持续性表达
#$%" 效应的能力! 一般细胞在 FGH 次分裂后 #$%"
效率会消失%:I&A&
#
总之!构建发卡样 #$% 真核表达载体!成功阻
抑 *12345"6,7 基因在肿瘤细胞中表达!并筛选出基因
沉默的靶点!为进一步研究研究 *12345"6,7 在肿瘤细
胞中的作用及基因治疗建立了研究平台#
参考文献!
%;& (12"J"43&KI&(1!5LM66MNM&-I&B16&O36&PQ&*12345"6,7&16R&41643L%S&Q&T65&
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X!8#$%!Y"6RD43&!3‘D3643&,!)34"J"4&!"2364"6Z&"6&=1==12"16&4322%S&Q&
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%S&Q&P"M483="!5LI&;>>7I&7FX?YW&;F;F,AQ
%:& 94916D!&9EI&C1"63!&PPI&O"22M6&(’I&35&12Q&K=122&"653LJ3L"6Z&#$%,&
=3R"153R&Z363&!"2364"6Z&"6&E&2=)8M453!%S&Q&S&T==D6M2I&FVVF&;0>I&
?:?H,0VQ
%A& K53"6’I&KNMbMR1&’I&%6Z3L&9I&35&12Q&#$%"W&91==12"16&MM453!&RM&"5&
c"58MD5&#$%,R3)36R365&#$%&)M2=3L1!3%S&Q&#$%I&FVV7!>I&;A:,>FQ
图 H&&筛靶统计图与扩增产物熔解曲线
!"#$% &’(#)* +,())-"-# +*’*"+*",+ ’-. */) 012*"-3 ,4(5)+
67 */1 ’082"7",’*"6- 8(6.4,*+
%W&K51!5"4!&J"ZDL3d&PW&%=)2"J"415"M6&)LMRD45!&=325"6Z&4DLN3
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W&K"Z6"J"4165&Z12345"6,7&[6M4[,RMc6&b&=ML3&5816&>?@&16R&
A?@Q&E83&51LZ35&;<
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第 : 期 王明栋I等Q慢病毒携带人 *12345"6,7 基因 #$%" 的有效靶点筛选 ;F0:’ (