1. Southern Blot
Transfert de Southern a été nommé d'après Edward M. Southern, qui a développé
cette procédure à l'Université d'Edimbourg dans les années 1970. Pour simplifier, les
molécules d'ADN sont transférés à partir d'un gel d'agarose sur une membrane.
Transfert de Southern a été conçu pour localiser une séquence particulière d'ADN
dans un mélange complexe. Par exemple, Southern blot peut être utilisé pour localiser
un gène particulier dans un génome entier.
La quantité d'ADN nécessaire à cette technique dépend de la taille et de l'activité
spécifique de la sonde. Sondes courtes ont tendance à être plus précis. Dans des
conditions optimales, vous pouvez vous attendre à détecter 0,1 pg de l'ADN pour
lequel vous êtes poussé.
Ce diagramme montre les étapes de base impliqués dans un transfert de Southern.
Regardons cette technique plus en détail.
1. Digest l'ADN avec une appropriée enzyme de restriction.
2. Exécutez la digestion sur un gel d'agarose.
3. dénaturer l'ADN (généralement pendant qu'il est encore sur le gel).
Par exemple, la tremper dans environ 0,5 M NaOH, qui séparerait l'ADN double brin
dans l'ADN simple brin. Seulement ssADN peut transférer.
Une étape de dépurination est facultative. Fragments de plus de 15 ko sont difficiles à
transférer à la membrane de transfert. Dépurination avec HCl (environ 0,2 M HCl
pendant 15 minutes) prend les purines, la coupe l'ADN en fragments plus petits.
2. Soyez conscient, toutefois, que la procédure peut également être entravée par des
fragments qui sont trop petites.
Soyez sûr de neutraliser l'acide après cette étape, ou la base après l'étape préalable si
vous ne dépurination pas.
4. Transférer les ADN dénaturé à la membrane.
Traditionnellement, une membrane de nitrocellulose est utilisé, bien que le nylon ou
une membrane de nylon chargée positivement peuvent être utilisés. La nitrocellulose a
typiquement une capacité de liaison d'environ 100 ug / cm, tandis que le nylon a une
capacité de liaison d'environ 500 ug / cm. De nombreux scientifiques estiment nylon
est préférable car il se lie plus et moins fragile. Transfert se fait habituellement par
action capillaire, ce qui prend plusieurs heures. Le transfert de l'action capillaire attire
le tampon par capillarité à travers le gel dans une de la membrane, qui se liera
ADNsb.
Vous pouvez utiliser un appareil de transfert de vide à la place de l'action capillaire.
Dans cette procédure, un vide aspire SSC à travers la membrane. Cela fonctionne de
manière similaire à l'action capillaire, excepte plus SSC passe par le gel et la
membrane, de sorte qu'il est plus rapide (environ une heure). (SSC fournit le niveau
de sel élevé que vous avez besoin pour transférer l'ADN.)
Après vous transférez votre ADN sur la membrane, le traiter avec de la lumière UV.
Cette liaison transversales (via des liaisons covalentes) l'ADN à la membrane. (Vous
pouvez aussi faire cuire nitrocellulose à environ 80 ° C pendant une couple d'heures,
mais il faut savoir qu'il est très combustible.)
5. Sonde marquée avec la membrane ADNsb. Ceci est également connu comme
l'hybridation.
Quoi que vous l'appelez, ce processus repose sur l'hybridation ssADN (recuit) à
l'ADN sur la membrane en raison de la liaison de brins complémentaires.
Sonder est souvent fait avec 32 P ATP marqué, biotine / streptavidine ou une sonde
bioluminescente.
Une préhybridation étape est nécessaire avant l'hybridation pour bloquer les sites non-
spécifiques, puisque vous ne voulez pas contraignant la sonde simple brin simplement
n'importe où sur la membrane.
Hybrider, utiliser le même tampon que pour les pré-hybridation, mais ajouter votre
sonde spécifique.
6. Visualisez votre séquence cible marqué radioactivement. Si vous avez utilisé une
sonde radiomarquée 32 P, alors vous voulez visualiser par autoradiographie. Détection
biotine / streptavidine est fait par des méthodes colorimétriques, et la visualisation
bioluminescente utilise luminescence.
3. 32 P ATP marqué
Traiter le fragment ADN double brin que vous utilisez comme une sonde avec une
quantité limitante d'Dnase, ce qui provoque des entailles double brin de l'ADN.
Ajouter 32P, dATP, et d'autres dNTP à l'ADN polymerase I, qui a 5 'à 3' de la
polymérase et une activité de 5 'à 3' exonucléase.
Nick translation se produit et que
l'entaille se traduit sur le brin d'ADN, l'activité de la polymérase continue à Nick
tandis que l'activité d'exonucléase continue de se remplir dans l'entaille. Comme cela
se produit, 32 p devient incorporé, et donc les étiquettes, l'ADN. Chauffer l'ADN pour
le rendre simple brin, puis placer immédiatement sur glace pour garder les deux brins
de renaturation à l'autre. (Si l'ADN est sur de la glace, l'ADN passe par la température
de recuit trop rapidement pour que l'ADN à rehybridize en ADN double brin).
Préhybridation
Pour prehybridize, ajouter ssADN non spécifique. ADN de sperme de saumon
Somicated est couramment utilisé. Ajouter 20X SSC, solution de Denhardt (de ficol et
PVP, qui sont de grosses molécules de prendre de l'espace et générer plus de contact;
et BSA, l'albumine de sérum bovin, une protéine non-spécifique), SDS
(dodécylsulfate de sodium) et formamide.
Modifiant les concentrations de formamide, SSC et SDS affecte "rigueur", ou de
spécificité. Si vous avez une plus grande rigueur vous devriez également avoir un
degré élevé de similitude entre la sonde et la séquence cible.
minisatellite =VNTR(variable numberof tandemrepeats) :motif de 10-30pb riche enGC et
répété entandemunnombre variable de foisselonlesindividus,localisationsurtoutpéri-
télomérique,révélationparSouthernblot
Les débuts des empreintes génétiques : le
polymorphisme des fragments de restriction
4. Image reproduite avec
l'aimable autorisationde Arno
Bachert / pixelio.de
La première méthode pour réaliser des empreintes génétiques a été inventée en 1984
par Alec Jeffreysw2, qui a utilisé des séquences d’ADN répétées appelées « nombre
variable de répétitions en tandem » (VNTR; c’est à dire séquence D1S80,
(AGGACCACCAGGAAGG)n). Ces séquences de 10 à 100 pb par répétition, peuvent
être étudiées en utilisant des enzymes de restriction, qui sont des ciseaux moléculaires
coupant l’ADN en des sites spécifiques (sites de restriction). Sur l’ensemble de notre
génome, une séquence représentant un site de restriction de 6 pb peut apparaitre
environ 730 000 fois.
Cela signifie que si l’on coupe le génome avec une enzyme de restriction particulière,
on peut obtenir environ 730 000 fragments de restriction de différentes longueurs.
C’est à ce point que les VNTR deviennent importantes : le nombre de répétitions dans
un groupe VNTR peut varier d’un individu à l’autre, ce qui signifie que la longueur
du fragment de restriction correspondant va varier d’un individu à l’autre (figure 1).
Ce phénomène est appelé polymorphisme de longueur des fragments de restriction
(RFLP).
