Mikrobiológiai módszerek áttekintése és összehasonlítása, a redox-potenciál alapú technológia bemutatása. Az új módszer előnyei: * Egyszerű mérési technika. * Nem igényel szigorú hőmérséklet-szabályozást. * Gyors módszer, különösen nagy mikroba-számú fertőzések esetében. * Bármely tápleves alkalmazható (impedimetriás mérések kis vezetőképességű, speciális tápleveseket igényelnek). * Különösen alkalmas membrán-szűréses módszer kiértékelésére. * Gazdaságos, hatékony és egyszerű módszer pusztulás-kinetikai mérések kiértékelésére. * Nagyon hatékony módszer táptalaj-optimalizálási kísérletekhez. * A vizsgálatok költsége kisebb a klasszikus módszerekhez viszonyítva, különösen null-toleráns mikrobák (coliforms, Enterococcus, Pseudomonas, etc.) meghatározásánál.

1. REDOX-POTENCIÁL MÉRÉSEN
ALAPULÓ GYORS MIKROBIOLÓGIAI
MÓDSZER
Reichart Olivér
Szakmár Katalin

2. Mikrobiológiai minőség-ellenőrzés
problémái 1.
Klasszikus (tenyésztéses) módszerek
 Hosszú inkubációs idő (1-4 nap)
 A módszerek alkalmazhatósága, megbíz-
hatósága és költsége tartományfüggő
Nagy koncentrációknál:
Hígítás és telepszámlálás a
30-300 cfu/ml tartományban
Alacsony koncentrációknál:
MPN módszer
Membrán szűrés

3. Mikrobiológiai minőség-ellenőrzés
problémái 2.
Gyors mérési módszerek 1.
(sejtszámlálás alapján)
 Direkt számlálás
 Számlálókamra
 Flow cytometer
Csak tiszta folyadékban alkalmazható
 Turbiditásmérés
Csak tiszta folyadékban alkalmazható

4. Mikrobiológiai minőség-ellenőrzés
problémái 2
Gyors mérési módszerek 2.
(Anyagcseretermék detektálása alapján)
 ATP mérés
Csak 105 sejt felett alkalmazható
 Impedancia mérésen alapuló módszerek
 Malthus
 Rabit
 Bactrac

5. Mikrobiológiai minőség-ellenőrzés
problémái 3.
Impedimetriás gyors módszerek
 Nagy pontosságú termosztát-igény miatt nagyon
drága berendezés.
 Speciális, kis vezetőképességű szubsztrátot
igényel.
 Probléma a szelektív szubsztrátokkal.
 A mérő cellák geometriája és térfogata adott.
 Kis koncentrációknál megbízhatatlan.

6. Redoxpotenciál mérésen alapuló
módszer elvi alapjai
Kémiai reakció általános formában:
a A + b B c C + d D
[C]c [D]d
Q = ------------
[A]a [B]b

7. Szabad energia és elektromos
munka
DG = DG° + R T ln Q
DG = - n FDE.
-n F DE = - n F DE° + R T ln Q

8. Elektromotoros erő
R T [C]c [D]d
DE = DE° - ------- ln ---------
n F [A]a [B]b

9. Biológiai rendszerekben
 Energiaforrás a biológiai oxidáció, ami a
környezetben redukciót eredményez.
 A környezet redukciójának okai lehetnek:
Oxigén elfogyasztása
Redukált komponensek feldúsulása
 Tipikus oxidációs-redukciós reakciók biológiai
rendszerekben:
[Oxidant] + [H+] + n e- [Reductant]

10. Nernst egyenlet:
RT [reductant]
Eh = E0 - ---- ln -------------------
nF [oxidant] [H+]
RT [oxidant] [H+]
Eh = E0 + ----- ln -------------------
nF [reductant]
Eh : a normál hidrogén elektródra vonatkoztatott
redoxpotenciál (V)
E0 : A rendszer normál redoxpotenciálja (V)
R: Gáz-állandó R = 8.314 J/mol K
F: Faraday állandó F = 9.648˙104 C/mol (J/V mol)
n: elektronok száma a redox-reakcióban (n=1)

11. Mikroba-szaporodás redox-görbéje
E. coli szaporodás 1/2 TSB-ben
-400
-300
-200
-100
0
100
200
300
400
0 60 120 180 240 300
t (min)
Eh(mV)
4.5
5
5.5
6
6.5
7
7.5
8
8.5
lgN(N=cfu/ml)
Eh mV lgN

12. Különböző baktériumok redox-görbéi
Redox görbék TSB-ben
-400
-200
0
200
400
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00
t (h)
Eh(mV)
steril Ps.aer. E.coli St. aur. Ent. faec. B.subt.

13. A kezdeti sejtszám hatása a redox-görbére
E. coli in TSB
-400
-300
-200
-100
0
100
200
300
400
0 120 240 360 480 600 720 840 960
t (min)
Eh(mV)
Steril steril lgN=0,09 lgN=2,38
lgN=3,39 lgN=4,25 lgN=4,80

14. Detektációs kritériumok
Impedimetriás módszerek
RABIT: admittancia változás > 5 S/6min
BACTRAC: impedancia változás > 5%
Redox-potenciál mérés:
|DE/D t|>1mV/min
Detektációs idő (TTD):
A detektációs kritérium eléréséhez
szükséges idő

15. A kezdeti sejtszám hatása a
detektációs időre
E. coli in TSB
0
1
2
3
4
5
6
2 3 4 5 6
lgNo (CFU/ml)
TTD(h)

16. Mérőcella redoxpotenciál méréshez
1.

17. Mérőcella redox-potenciál méréshez
2.

18. Indirekt mérőcella

19. Mérőcella hatása a redox-görbére
Enterococcus kémcső, mérőcella
0
100
200
300
400
500
600
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00
t (h)
Eh(mV)
Kémcsőben Mérőcellában

20. Enterococcus faecalis különböző
cellákban mérve
Enteroc. faecalis 1/2 TSB-ben y = -1.0833x + 9.857
0
1
2
3
4
5
6
7
2 3 4 5 6 7 8
lgN (cfu/cella ml)
TTD(h)
üveg aerob üveg anaerob kémcső

21. 12 csatornás mérő-rendszer
Vízfürdő
Mérőcellák
Adatgyűjtő
Computer
Monitor
Software for Windows

22. Termékben való közvetlen mérés

23. 16 csatornás mérési elrendezés

24. 32 csatornás mérési elrendezés

25. 2 csatornás mérési elrendezés

26. Mozaik elrendezésű képernyő

27. Csoportosított gráfok

28. Mérési eredmények megjelenítése

29. Mérési eredmények megjelenítése

30. Mérési módszer validálása

31. Teszt-mikrobák és táptalajok 1.
Microorganisms Redox
potential
Plate
counting
Escherichia coli BBL, TSB TSA, Tergitol
Enterobacter
aerogenes
BBL, TSB TSA, Tergitol
Citrobacter freundii BBL, TSB TSA, Tergitol
Klebsiella oxytoca BBL, TSB TSA, Tergitol
Acinetobacter lwoffii BBL, TSB TSA, Tergitol
Pantoea
agglomerans
BBL, TSB TSA, Tergitol

32. Teszt-mikrobák és táptalajok 2.
Microorganisms Redox
potential
Plate
counting
Pseudomonas
aeruginosa
Cetrimide,
TSB
TSA,
Cetrimide
Pseudomonas
fluorescens
Cetrimide,
TSB
TSA,
Cetrimide
Enterococcus
faecalis
Azide, TSB TSA, Slanetz-
Bartley
Total count TSB TSA

33. A módszer validációs jellemzői 1.
 Szelektivitás
A szelektív médium által adott.
 Linearitás
1-től 107 cfu/mérőcella.

34. Enterococcus szelektív kimutatása azid levesben
Enterobaktériumok, B. subtilis és Enterococcus
faecalis azid levesben, kémcsőben
0
100
200
300
400
500
600
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00
t (h)
Eh(mV)

35. Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens,
E. coli és Enterococcus faecalis Cetrimid-levesben
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
0 120 240 360 480 600 720 840 960 1080 1200 1320 1440
t (min)
Eh(mV)
Ps. aerug. Ps. fluoresc. E. coli Enterococcus

36. Enterococcus faecalis meghatározás linearitása
Entroc. faecalis Azid y = -2.0214x + 18.192
R2
= 0.9983
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
2 3 4 5 6 7 8
lgN (cfu/cella ml)
TTD(h)

37. Pseudomonas aeruginosa meghatározás linearitása
Pseudomonas aeruginosa in Cetrimide
y = -154,75x + 1440,6
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
0 1 2 3 4 5 6 7 8
lgN
TTD(min)

38. E. coli linearitása lemezöntéssel és membránszűréssel
TTD (min)
y = -56,429x + 566,38
R2
= 0,9995
y = -64,951x + 625,54
R
2
= 0,9593
0
100
200
300
400
500
600
700
0 1 2 3 4
lg N (cfu/flask)
TTD(min)
TTD (min)s TTD (min)m

39. Impedimetriás és redox-módszer
összehasonlítása
E. coli
0
2
4
6
8
10
12
0 2 4 6 8 10
lgN (CFU/ml)
TTD(h)
Rabit Bactrac Malthus redox

40. A módszer validációs jellemzői 2.
 Érzékenység
 Kimutatási határ (Detectation limit)
1 cell/test flask.
 Meghatározási határ (Quantitation limit)
Elméleti meghatározási határ 10 sejt/inoculum
(1 log egység), ami megegyezik a kapott
kalibrációs görbékkel.
min13060
Nlg
TTD




41. A módszerek érzékenysége
E. coli
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
Redox Bactrac Malthus Rabit
Methods
-DTTD/DlgN

42. A módszer validációs jellemzői 3.
 Tartomány
A kalibrációs görbék alpján 1-7 nagyságrend.
10 sejt alatt a Poisson eloszlás okoz
problémát, 107 sejt felett a TTD túl rövid a
tranziens folyamatokhoz képest (hőmérséklet-,
redox-egyensúly, lag-periódus).
 Ismételhetőség
A kalibrációs görbékből számítva:
SDlgN = 0.092
SDN = 100.092 = 1.24 = 24%

43. A módszer validációs jellemzői 4.
 Zavartűrés (Robustness)
Legfontosabb paraméter a hőmérséklet, amely
két módon befolyásolja az eredményeket:
 szaporodási sebesség hőmérséklet-függése
 redox-potenciál hőmérséklet-függése
A mikroba szaporodási optimumán mérve, a
szaporodási sebesség ±0.5 °C intervallumon
belül nem változik.
A hőmérséklet-ingadozás redoxpotenciálra
kifejtett hatása kísérleti eredményeink szerint
elhanyagolható.

44. Hőmérséklet hatása a redox-potenciálra
300
320
340
360
380
400
420
440
460
480
25 30 35 40 45 50
T (°C)
Eh(mV)
phyz. Salt Azid BBL Z-broth RCM

45. A hőmérséklet hatása a mérési
módszerekre
 Impedimetriás módszerek:
 A mért impedancia erősen hőmérséklet-függő.
 A detektációs kritériumok (5µS RABIT-nál, vagy 5%
növekedés BACTRAC esetében) már 0.025°C
hőmérséklet-változással elérhetőek (RABIT Manual).
 Ez az oka a szigorú hőmérséklet-szabályozási
követelménynek (DT=±0.002°C).
 Redox-potenciál mérés:
 A mért redox-potenciált döntően csak a mikroba-
szaporodás határozza meg.
 A hőmérséklet-ingadozás hatása elhanyagolható.

46. Impedimetriás és redox mérési módszerek
hőmérséklet-érzékenysége
Impedimetric
method
Redox-
potential
1°C változás hatása
(Szubsztrát-függő)
20-200S 0.4-1.4mV
Hamis pozitív
eredményt adó
hőmérséklet-változás
0.004°C/min
0.7-2.5
°C/min
Szokásos méréshez
tartozó kritikus
hőfok-csúszás
0.025°C/6min
7-25
°C/10min

47. A redox-módszer alkalmazása
1. Víz mikrobiológiai ellenőrzése
 Össz-mikrobaszám
 Coliform, E. coli
 Pseudomonas aeruginosa
 Enterococcus faecalis
2. Nyers tej mikrobiológiai minősítése
 Össz-mikrobaszám
 Enterobacteriaceae
3. Hús mikrobiológiai ellenőrzése
 Össz-mikrobaszám
 Enterobacteriaceae
4. Felületek mikrobiológiai ellenőrzése
 Össz-mikrobaszám
 Enterobacteriaceae
5. Penész- és élesztőgombák számának meghatározása

48. Víz mikrobiológiai vizsgálatok
Összcsíra
Water in TSB
y = -60,807x + 525,03
R2
= 0,9973
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
0 1 2 3 4 5 6 7 8
lgN/100ml
TTD(min)

49. Víz mikrobiológiai vizsgálatok
Coliformok
Coliforms in BBL
y = -67,611x + 596,28
R
2
= 0,9865
y = -81,034x + 773,78
R
2
= 0,9941
y = -101,94x + 1020,2
R
2
= 0,9958
y = -132,3x + 1190
R
2
= 0,9621
y = -88,257x + 855,63
R
2
= 0,9714
0
200
400
600
800
1000
1200
0 1 2 3 4 5 6 7
lgN
TTD(min)
Citrobacter aerob Citrobacter anaerob Klebsiella anaerob Enterobacter aerob E. coli

50. Víz mikrobiológiai vizsgálatok
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas Cetrimid y = -153,21x + 1422,5
R2
= 0,9882
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
0 1 2 3 4 5 6 7 8
lgN/100ml
TTD(min)

51. Víz mikrobiológiai vizsgálatok
Enterococcus faecalis
Enterococcus AZID
y = -95,238x + 793,33
R2
= 0,9859
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 1 2 3 4 5 6 7 8
lgN/100ml
TTD(min)

52. Ipari validálási eredmények 1.
72 palack vizsgálata Coliform mikrobákra
Laboratóriumi vizsgálati módszer
 Membrán szűrés: 3x250 ml ásványvíz 1 szűrőlapra.
Tenyésztés Tergitol agaron (37 °C, 48 h). 1 Petri
csészén 3 palack egyesített eredménye. Eredmény:
48 óra.
Redox-potenciál mérési módszer
 Membrán szűrés: 3x250 ml ásványvíz 1 szűrőlapra.
4 membrán behelyezve 1 mérőcellába, BBL levesbe.
Mérés: 37 °C. 1 cella 12 palack egyesített eredményét
tartalmazza. Eredmény: 12 óra
 Kontroll: 1 ml Citrobacter freundii szuszpensio
(lgN = 3.66)

53. Ipari mérések eredménye 1.
72 bottles in BBL
-300,0
-200,0
-100,0
0,0
100,0
200,0
300,0
400,0
500,0
0 200 400 600 800 1000 1200
t (min)
Eh(mV)
1.-12. 13.-24. 25.-36. 37.-48. 49.-60. 61.-72. Citrobacter

54. Ipari mérések eredménye 1.
Minták 1.-12. 13.-24. 25.-36. 37.-48. 49.-60. 61.-72.
Laboratory negative negative negative negative negative negative
Redox negative negative negative negative negative negative
72 palack vizsgálata coliform mikrobákra

55. Ipari validálási eredmények 2.
66 palack vizsgálata Coliform mikrobákra
Laboratóriumi vizsgálati módszer
 Membrán szűrés: 3x250 ml ásványvíz 1 szűrőlapra.
Tenyésztés Tergitol agaron (37 °C, 48 h). 1 Petri
csészén 3 palack egyesített eredménye. Eredmény:
48 óra
Redox-potenciál mérési módszer
 Membran szűrés: 3x250 ml ásványvíz 1 szűrőlapra.
3 membran behelyezve 1 mérőcellába, BBL levesbe.
Mérés: 37 °C. 1 cella 9 palack egyesített eredményét
tartalmazza. Eredmény: 12 óra.
 Kontroll: 1 ml Citrobacter freundii szuszpenzió
(lgN = 6.66)

56. Ipari mérések eredménye 2.
66 bottles
-400,0
-300,0
-200,0
-100,0
0,0
100,0
200,0
300,0
400,0
500,0
0 200 400 600 800 1000 1200
t (min)
Eh(mV)
1.-9. 10.-18. 19.-27. 28.-36. 37.-45. 46.-54. 55.-63.
64.-66. Water1 Water2 E.coli (+) Negative

57. Ipari mérések eredménye 2.
Minták 1.-66. Bottles Water sample 1. Water sample 2.
Laboratory results negative negative negative
Redox method negative negative negative
66 palack vizsgálata coliform mikrobákra

58. Nyers tej össz-mikroba száma
Nyerstej 0,1/100ml y = -1.3345x + 12.981
R2
= 0.9634
0
2
4
6
8
10
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00
lgN (cfu/test cell)
TTD(h)

59. Enterobaktériumok tejben
Enterobacteriaceae in EE broth
y = -0.935x + 8.2116
R2
= 0.9924
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 1 2 3 4 5 6 7
lg cfu/ test cell
TTD(h)
E. coli Enterobacter cloacae Citrobacter freundii
Salmonella abony Klebsiella oxytoca

60. Nyers hús össz-mikroba száma
Meat in TSBy = -2.6833x + 20.498
R2
= 0.9633
y = -3.15x + 19.456
R2
= 0.965
y = -2.3979x + 18.226
R2
= 0.9302
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
0 1 2 3 4 5 6 7
lgN (cfu/test cell)
TTD(h)
Chicken Pork Beef

61. Enterobacteriaceae húsban
Meat in EE broth y = -0.92x + 12.653
R2
= 0.9975
10.50
11.00
11.50
12.00
12.50
13.00
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50
lgN (cfu/test cell)
TTD(h)

62. Felületi tamponos vizsgálatok
E.coli, tampon y = -1.0860x + 8.8565
R
2
= 0.9900
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00
lgN/Petri
TTD(h)

63. Redox-potenciál változás gombák
szaporodása során (indirekt mérés)
Saccharomyces cerevisiae
200
250
300
350
400
450
500
550
600
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00
t (h)
Eh(mV)
ch1 ch2 ch3 ch4 ch5 ch6

64. Saccharomyces cerevisiae kalibrációs
görbe
Saccharomyces cerevisiae
y = -6.9146x + 39.37
R
2
= 0.996
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 1 2 3 4 5
lgN (cfu/test cell)
TTD(h)

65. Aspergillus niger kalibrációs görbe
Aspergillus niger y = -6.1936x + 55.984
R2
= 0.9858
20
30
40
50
60
0 1 2 3 4 5
lgN (cfu/test cell)
TTD(h)

66. A redox mérési módszer előnyei 1.
 Egyszerű mérési technika.
 Nem igényel szigorú hőmérséklet-szabályozást.
 Gyors módszer, különösen nagy mikroba-számú
fertőzések esetében.
 Bármely tápleves alkalmazható (impedimetriás
mérések kis vezetőképességű, speciális
tápleveseket igényelnek).
 Különösen alkalmas membrán-szűréses
módszer kiértékelésére.

67. A redox mérési módszer előnyei 2.
 Gazdaságos, hatékony és egyszerű módszer
pusztulás-kinetikai mérések kiértékelésére.
 Nagyon hatékony módszer táptalaj-
optimalizálási kísérletekhez.
 A vizsgálatok költsége kisebb a klasszikus
módszerekhez viszonyítva, különösen null-
toleráns mikrobák (coliforms, Enterococcus,
Pseudomonas, etc.) meghatározásánál