底質毒性試験生物種としてのニホンドロソコエビ (Grandidierella japonica)

2017.12.04 MoTY Joint Meeting
底質毒性試験種としての
ニホンドロソコエビの特性
Life history characteristics of Grandidierella japonica as
a test species of sediment risk assessments
2017.12.04 (月)
MoTY Joint Meeting
20 min + 10 min

1. 背景
底質汚染の複雑さ
単一の化学物質によって底質汚染が進行することは稀
複数の物質が共存していることが多い
…
例：東京湾底質から検出された940個の有機物質 (Pan et al., 2014)
PAHs, PCBs, alkylphenols, sterols, pesticides and alkanes were contained.
…
化学物質の測定だけでは
有害性の評価は困難
（∵未測定の物質による影響, 物質同士の相互作用）
生物を汚染底質試料に
曝露させて有害性を評価する必要
（バイオアッセイ）
2

1. 背景
底質汚染のバイオアッセイ
汽水域・海域の底質汚染調査に使用される主な試験生物
3
分類生物種主な評価項目
端脚類
Ampelisca abdita
Corophium volutator
Leptocheirus plumulosus
Melita plumulosa
Rhepoxynius abronius
致死・成長阻害・
繁殖阻害
多毛類
Neanthes arenaceodentata
Polydora cornuta
致死・生物濃縮
貝類
Crassostrea gigas
Mytilus edulis
成長阻害・生物濃縮
棘皮動物
Dendraster Excentricus
Strongylocentrotus purpuratus
胚発生阻害
バクテリア Vibrio ficheri 発光阻害

1. 背景
端脚類を用いたバイオアッセイ
しかし試験法が確立している種は
日本国内に生息していない…
4
端脚類
 豊富な生物量
 多くは雑食性
 魚類や鳥類の餌
 汚染に対する高い感受性
ニホンドロソコエビ（Grandidierella japonica）
 日本国内に広く分布
 幅広い塩分・粒子径の底質環境に生息
⇒ 国内の汽水・海域における底質毒性試験種として使用できる？

2. 目的
試験生物種としての要件
2017.12.04 MoTY Joint Meeting 5
底質毒性試験種として望ましい条件 (USEPA, 1994; USEPA, 2007; Hansen et al., 2007をもとに整理)
1. 生態学的な重要性
2. 評価対象地域に生息
3. 化学物質に対する高い感受性
4. 飼育・試験が容易
5. 塩分・粒子径など化学物質以外の要因に対する高い耐性
ニホンドロソコエビの場合
1. 豊富な生物量(Aikins & Kikuchi, 2001など)・生態系での中間的な位置 (West et al., 2003; Aikins & Kikuchi, 2002)
2. 日本国内に広く分布
3. ？
4. ？本日の発表内容
5. ？

2. 目的
本日の発表内容
目的：日本国内の汽水・海域における底質毒性試験生物種としての要件を
ニホンドロソコエビが備えているかどうか明らかにする。
具体的には…
I) 化学物質に対する感受性 ⇒ 文献調査によって他種と比較
II) 飼育・試験の容易さ ⇒ 実験室での本種の生活史 (産仔数など) を取得し、
他種と比較
III) 塩分に対する耐性 ⇒ 5～35‰塩分下での生存・成長を評価
＋αとして…
IV) 環境底質の汚染評価への適用 ⇒ 東京湾底質を用いて10日間生存試験

3. 結果 I
化学物質に対する感受性
ニホンドロソコエビの感受性を
汽水・海域の底質毒性試験の
代表的な端脚類5種
＋同属のG. lignorumと比較
7
G.japonica
A.abdita
C.volutator
G.aequicauda
L.plumulosus
M.plumulosa
G.lignorum
110100100010000
96-hLC50(μg/L)
Cd
Zn
Cu
Fluoranthene
Un-ionized ammonia
方法
• 各種の96時間LC50*を文献から収集
• 対象物質はCd, Zn, Cu, フルオランテン,
アンモニア
• 実験条件（温度・塩分・生物の成長段階など）は
問わない
*LC50: Lethal concentration 50%の略。試験に供した集団の50%の個
体が死亡する濃度。
結果
Fig. Comparison of 96-h LC50 values among 7 amphipod species
感受性はC. Volutatorより高く
他の種と同程度？

文献ごとに温度が異なる
8
Temperature (°C)
96-hLC50(μg/L)
1010010000
10 15 20 25
Cd
Temperature (°C)
96-hLC50(μg/L)
1010010000
10 15 20 25
Zn
Temperature (°C)
96-hLC50(μg/L)
1010010000
10 15 20 25
Cu
Temperature (°C)
96-hLC50(μg/L)
1010010000
10 15 20 25
Un-ionized ammonia
Temperature (°C)
96-hLC50(μg/L)
1010010000
10 15 20 25
Fluoranthene
Temperature (°C)
96-hLC50(μg/L)
110100100010000
10 15 20 25
Chemical
Cd
Zn
Cu
Fluoranthene
Un-ionized ammonia
Species
G.japonica
A.abdita
C.volutator
G.aequicauda
L.plumulosus
M.plumulosa
G.lignorum
Fig. 96-h LC50 values as a function of test temperature
温度・生物種・化学物質を説明変数とする
線形回帰式を求め
係数β2(Fig.2切片)によって生物種ごとの感受性を比較
𝑙𝑜𝑔10 96ℎ 𝐿𝐶50) =
𝛽0 + 𝛽1 ∙ 𝑇𝑒𝑚𝑝 + 𝜷 𝟐,𝒊 ∙ 𝑆𝑝𝑒𝑐𝑖𝑒𝑠𝑖 + 𝛽3,𝑗 + 𝛽4,𝑗 ∙ 𝑇𝑒𝑚𝑝) ∙ 𝐶ℎ𝑒𝑚𝑖𝑐𝑎𝑙𝑗
* Species, Chemicalは0/1で表されるカテゴリ変数
ニホンドロソコエビの感受性は
A. abditaとG. aequicauda
より低く
C. volutatorより高い
他3種とは同程度
感受性低
Coefficientβ2
G.japonica
A.abdita
C.volutator
G.aequicauda
L.plumulosus
M.plumulosa
G.lignorum
-0.50.00.51.0
Error bars: SE
a a, b a, b
a, b
b
c
c
3. 結果 I

飼育・試験の容易さ
3. 結果 II
継代飼育しているニホンドロソコエビの産仔数・産仔までの日数・寿命を調べた
条件
• 16h 明, 8h 暗
• 25°C
• 24h 曝気
• 週3回餌投与
5日おきに
生存数（雄雌,幼体）
をカウント
• 約1 cm 河川底質
（小松川干潟, 強熱減量4.2%）
• 120 mL 人工海水 (塩分30‰)
10匹生後<1日

0 20 40 60 80
020406080100
Age (days)
Survivalrate,Femaleratio(%)
0 20 40 60 80
020406080100
飼育・試験の容易さ
生存率
10
0 20 40 60 80
01020304050
Age (days)
Numberofneonatesperfemale
3. 結果 II
雌比率
雌1匹当たりの
産仔数*
* 新しく生まれた幼体の数をビーカー内の雌個体数で割って算出した
 最大寿命：88日
 平均寿命：45日
 初回産仔：16～21日
 生涯産仔数：184±26
 1回あたりの産仔数：29

他種の端脚類と比べてニホンドロソコエビの
世代期間は短く産仔数は多い
11
Native area
Maximum life
span
寿命
Ages of the first
brood
初回産仔日齢
Initial brood
size
初回産仔数
Mean brood size
1回あたり産仔数
Test
condition
Source
ニホンドロソコエビ
Grandidierella japonica
Japan, China, Korea 86 days 16-21 days 17 (11-22) 29 (8-52)
25°C,
30‰
This study
Ampelisca abdita
Atlantic Coast of North
America > 60 days 31-36 days 10-20 (NA) NA 25°C, 30‰
Redmond et al.,
1994
Corophium volutator Europe > 112 days < 58 days NA 36 23°C, 30‰
Peters and Ahlf,
2005
Gammarus aequicauda Europe 145 days > 44 days NA 19 (4-53) 18°C, 36‰ Prato et al., 2006
Hyale barbicornis Japan 171 days 49 days NA 11 24°C, NA
Hiwatari and
Kajihara, 1988
Leptocheirus plumulosus
Atlantic Coast of North
America > 100 days 14-21 days 7 (1-13) 10 (1-32) 25°C, 20‰ DeWitt et al., 1992
Melita plumulosa Australia 12 months 7 weeks 1 5 22°C, 35‰ Hyne et al., 2005
Grandidierella lignorum South Africa > 60 days 21-28 days 5 (3-7) NA (3-45) 22°C, 35‰ Masikane, 2013
他端脚類との生活史の比較
3. 結果 II
飼育や繁殖阻害の試験が容易
（外来種としての成功にも関係？）

塩分への耐性
3. 結果 III
5~35‰の海水に10日間曝露させたニホンドロソコエビの生存率と体調を測定
条件
• 16h 明, 8h 暗
• 25°C
• 24h 曝気
• 餌投与なし
10日後に
生存率・体長
を測定
• 約1 cm 河川底質
（小松川干潟, 強熱減量4.2%）
• 120 mL 人工海水
（塩分5, 10, 20, 30, 35‰)
10匹亜成体
@30‰
試験塩分に
馴致
(5‰/day)

10日後の生存率・体長ともに
塩分間での統計的有意差なし(p =0.096 for mortality, p = 0.298 for body length)
13
5 10 20 30 35
050100
10-daymortality(%)
Salinity (‰)
-
-
-
- -
- Average
5 10 20 30 35
0246
Bodylength(mm)
Salinity (‰)
Before exposure
After exposure
3.36
4.74
3.60
5.01
3.57
4.81
3.04
4.75
3.30
4.82
塩分への耐性
3. 結果 III
幅広い塩分に対する耐性

実環境底質の汚染評価への適用
3. 結果 IV
S1
S3
S5
S2
S6
S4
東京湾湾奥部の6地点から底質表層を採取
S6：ニホンドロソコエビの生息地点 (大田区, 2012)
Sample Station
Sampling
date
Antecedent dry
weather period
S1 Onagigawa bridge 2015/06/15 75 h
S2 Shiosai bridge 2015/06/15 77 h
S3 Heisei bridge 2015/07/15 135 h
S4 Suehiro bridge 2015/07/12 65 h
S5 Daiba 2015/08/23 73 h
S6 Anamori bridge 2015/08/22 50 h
2-mmふるい ⇒ 4°C保存 (< 2weeks)
Van Veen grab sampler
(DIK-190A-A1)

3. 結果 IV
粒子径分布・粒子密度・強熱減量 (LOI; Loss on ignition)・
金属類濃度・PAHs (Polycyclic Aromatic Hydrocarbons) 濃度を測定した
S1 S2 S3 S4 S5 S6
Coarse (%) a 16 26 19 45 29 5
Middle (%) a 50 47 74 49 61 81
Fine (%) a 34 27 7 6 10 14
Density (g/cm3) 2.55 2.32 2.49 2.63 2.55 2.53
LOI (%) 17.3 19.4 12.6 5.5 12.2 5.2
Metals
(mg/kg
dry)
Cr 143 130 357 29 25.7 33.3
Ni 54.7 54.3 67.7 39.7 17 20.3
Cu 167 293 263 127 41.7 51.3
Zn 447 1067 703 407 187 153
Cd 1.27 2.90 2.13 1.10 0.20 0.28
Pb 99 167 140 58.7 18.3 33.7
Σ12 PAHs (mg/kg dry) 7.53 3.08 13.92 1.88 < 0.86 < 0.43
a) Coarse: 2,000 – 250 µm, Middle: 250 – 106 µm, Fine: below 106 µm.
Table. Physico-chemical characteristics of sediment samples.
Cd
Σ12PAHs
Ni
Pb
Cr
Cu
Zn
S5
S6
S1
S4
S2
S3
-1 0 1
Value
Color Key
化学物質による汚染度合は
S2・S3：高 S5・S6：低
*各物質ごとに、標準正規分布に従うように濃度を変換してWard法でクラスター解析した図

3. 結果 IV
体長増分*
S4=S5>S6>S1=S2=S3
環境底質を用いて10日間の曝
露試験をおこなった
10-d mortality
Body length
10 juveniles
 n = 5 (50 organisms)
 Wet sediment
 120 mL of artificial seawater (30‰)
 No additional food
 Continuous aeration
*曝露前の個体20匹の体長平均値と曝露後の体長との差
致死率
統計的有意差なし

3. 結果 IV
6 8 12 16
1.01.52.02.5
LOI (%)
Increment(mm)
60 70 80 90
1.01.52.02.5
Small particles (%)Increment(mm)
50 100 200
1.01.52.02.5
Cr (mg/kg)
Increment(mm)
20 30 40 60
1.01.52.02.5
Ni (mg/kg)
Increment(mm)
50 100 200
1.01.52.02.5
Cu (mg/kg)
Increment(mm)
200 400 800
1.01.52.02.5
Zn (mg/kg)
Increment(mm)
0.2 0.5 1.0 2.0
1.01.52.02.5
Cd (mg/kg)
Increment(mm)
20 50 100
1.01.52.02.5
Pb (mg/kg)
Increment(mm)
0.5 2.0 5.0
1.01.52.02.5
Σ12PAHs (mg/kg)
Increment(mm)
汚染の度合いが大きい底質ほど
体長増加が阻害される傾向が見られた
r = 0.90, p = 0.015
今後は
 繁殖阻害試験
 野外生物叢調査との比較
によって詳細に汚染影響を調べる必要
*Small particles: <250 µmの粒子の割合(%)
*
※今回の結果から「成長阻害の原因＝化学物質」とは
結論づけられない。例えば細粒子の割合も体長増分と
負の相関にあり、影響を否定できない (cf. Casado-Martinez t
al., 2016)。
今後、このような交絡因子の影響を調べる必要がある。

まとめ
底質毒性試験種として望ましい条件 (USEPA, 1994; USEPA, 2007; Hansen et al., 2007をもとに整理)
1. 生態学的な重要性
2. 評価対象地域に生息
3. 化学物質に対する高い感受性
4. 飼育・試験が容易
5. 塩分・粒子径など化学物質以外の要因に対する高い耐性
ニホンドロソコエビの場合
1. 豊富な生物量(Aikins & Kikuchi, 2001など)・生態系での中間的な位置 (West et al., 2003; Aikins & Kikuchi, 2002)
2. 日本国内に広く分布
3. 感受性は A. abditaとG. aequicaudaよりは低いが、底質毒性試験に用いられている他の
端脚類と同程度だった。
4. 底質毒性試験に用いられている他の端脚類と比べて、大きい個体群増加率を有するため、
飼育および繁殖試験は比較的容易と考えられる。
5. 塩分5~35‰の範囲で生存・体長は変化しない。粒子径に対する耐性は今後の調査必要。

• Aikins S, Kikuchi E, 2001, Studies on habitat selection by amphipods using artificial substrates within an estuarine environment. Hydrobiologia
457:77-86.
• Aikins S, Kikuchi E, 2002, Grazing pressure by amphipods on microalgae in Gamo Lagoon, Japan. Mar Ecol Prog Ser 245:171-179.
• Casado-Martinez MC, Burga-Pérez KF, Bebon R, Férard JF, Vermeirssen EL, Werner I, 2016, The sediment-contact test using the ostracod
Heterocypris incongruens: Effect of fine sediments and determination of toxicity thresholds. Chemosphere 151:220-224.
• Hansen PD, Blasco J, DelValls TA, Poulsen V, Van den Heuvel-Greve M, 2007, Biological analysis (bioassays, biomarkers, biosensors),
Sustainable Management of Sediment Resources, Ed: Barcelo D and Petrovic M, 1:131-161. Elsevier.
• Pan S, Kadokami K, Li X, Duong HT, Horiguchi T, 2014, Target and screening analysis of 940 micro-pollutants in sediments in Tokyo Bay, Japan.
Chemosphere 99:109-116.
• USEPA, 1994, Methods for assessing the toxicity of sediment-associated contaminants with estuarine and marine amphipods, Washington D.C.,
EPA600/R-94/025.
• USEPA, 2007, Sediment toxicity identification evaluation (TIE) phase I, II, III guidance document, Washington DC, EPA/600/R-07/080.
• West JM, Williams GD, Madon SP, Zedler JB, 2003, Integrating spatial and temporal variability into the analysis of fish food web linkages in Tijuana
Estuary. Environ Biol Fishes 67:297-309.
などなど
引用文献

 塩分とLC50との関係は
温度ほど明瞭ではなかった
 塩分と温度の負の相関 (r =-0.48)
⇒ 塩分は説明変数に加えなかった
（p.8）
3. 結果 I
Salinity (‰)
96-hLC50(μg/L)
110100100010000
5 10 15 20 25 30 35
Chemical
Cd
Zn
Cu
Fluoranthene
Un-ionized ammonia
Species
G.japonica
A.abdita
C.volutator
G.aequicauda
L.plumulosus
M.plumulosa
G.lignorum

ニホンドロソコエビ存在量と底質中DDT濃度
サンフランシスコ湾での野外調査の例
（Swartz et al., 1994）
他のヨコエビの存在量は
DDT濃度増加とともに減少しているが
ニホンドロソコエビは逆。
DDT濃度増加につれて増加している
侵入先で耐性を獲得している？
おまけ

底質毒性試験生物種としてのニホンドロソコエビ (Grandidierella japonica)

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