Técnicas histológicas – biologia celular

1. Técnicas Histológicas – Biologia
Celular

2. Técnicas Histológicas
A técnica histológica visa a preparação dos tecidos
destinados ao estudado à microscopia de luz. O
exame ao microscópio é feito geralmente por luz
transmitida, o que significa que a luz deve
atravessar o objeto a ser examinado. Assim, é
necessária a obtenção de fragmentos dos tecidos
que serão coletados em lâminas muito finas e
transparentes.

4. Visão Geral do Processamento de
Tecidos
Os tecidos a serem processados para estudo ao
microscópio devem ser preparados de modo a
preservar sua estrutura original ao máximo
possível. Entretanto, isso não é possível e todos os
preparados apresentam artefatos, que são
alterações produzidas nas células pelas técnicas
utilizadas. Podemos resumir os passos das técnicas
histológicas com a seguinte seqüência: fixação dos
tecidos, desidratação, inclusão, microtomia (corte
em fatias finas), coloração e montagem de lâminas.
Essas etapas serão descritas adiante.

6. OBTENÇÃO DO MATERIAL E FIXAÇÃO
Uma boa preparação histológica se inicia com o
uso correto das técnicas de obtenção do
material. Os cuidados devem ser observados já
no sacrifício dos animais de laboratório para o
estudo histológico de seus tecidos. Em se
tratando de animais de laboratório o sacrifício
pode ser obtido através de técnicas como,
traumatismo brusco, intoxicação (overdose de
anestésico) e perfusão/imersão.

8. Objetivos da fixação
Utiliza-se formol a 10%. Esta substância tem
como característica evitar o processo de autólise
da célula, impedir a destruição do tecido por
procariontes, endurecer o material para melhor
tratamento posterior e aumentar a capacidade
de coloração do material. O tempo de fixação
pode variar entre 12 e 24 horas, dependendo do
material a ser processado e a sua finalidade
posterior.

9. Material cortado e colocado no cassete para o
processamento.

10. Material em cassetes plásticos e mergulhados
no frasco contendo formol a 10%.

11. DESIDRATAÇÃO , INCLUSÃO E
MICROTOMIA
Objetivos
Para a observação ao microscópio de luz a
espessura da secção do tecido presente em uma
lâmina deve ser delgada o suficiente para que
possa ser atravessado por um raio de luz. Para
tal os tecidos devem ser criteriosamente
preparados para receber um meio endurecedor,
ou seja meio de inclusão. Desta forma será
possível a obtenção de cortes delgados, obtidos
no processo de microtomia.

12. • Após a fixação com as soluções aquosas de
glutaraldeído ou formalina, os tecidos devem ser
desidratados, uma vez que a água presente nos tecidos
não é miscível em substancias apolares como a
parafina e as resinas de inclusão. A desidratação será
feita através de imersão numa bateria de soluções
alcoólicas em concentrações graduais e crescentes. A
graduação pode ser iniciada, se necessário, a partir de
50% e terminando finalmente em álcool absoluto. A
graduação nas concentrações é imprescindível para
que ocorra a desidratação homogênia dos tecidos,
evitando que ocorram danos na estrutura tecidual.

13. DESIDRATAÇÃO – O material é mergulhado em frascos contendo álcool de
concentrações crescentes de álcool a 85%; 95%. Absoluto I, Absoluto II, Absoluto III.
O álcool absoluto correponde a 99% de pureza.
Bateria de álcool para desidratação. O frasco 1 corresponde a maior proporção
água/álcool e o frasco 5 e menor proporção (absoluto).

14. DIAFANIZAÇÃO OU CLAREAMENTO – Utiliza-se Xilol para permitir
melhor a penetração de parafina na peça, num total de 3 banhos de
xilol.
Bateria de frascos com xilol.

15. Após a diafanização, a amostra é colocada em
parafina (microscopia de luz) ou em resina
(microscopia de luz e eletrônica) a fim de torná-la
rígida e, dessa forma, permitir o corte em lâminas
finas no micrótomo. Ao ser imersa em parafina
fundida e colocada em uma estufa a 58-60°C, o
calor promove a evaporação do xilol e a ocupação
dos espaços teciduais por parafina. O tecido
embebido por parafina se torna rígido após ser
retirado da estufa. Uma das vantagens da resina em
relação à parafina é que aquela produz menos
artefatos, gerados pela alta temperatura da estufa.

16. Inclusão

17. Peças dentro de fracos de vidro contendo parafina no interior da
estufa a 60º C dentro

18. Material já incluído na parafina. O bloco da direita foi
processado para ser cortado no micrótomo

19. MICROTOMIA: Os blocos de parafina são cortados para a obtenção de cortes da
material, utilizando-se para isso o aparelho denominado micrótomo. Os cortes tem a
espessura de 5 a 6 micrômetros.

21. BANHO-MARIA”: Os cortes são distendidos em água aquecida a 56º C
em aparelho aquecedor com termostato para evitar microdobras no
material.

22. Cortes sobre a água aquecida em "Banho Maria"

23. PESCAGEM: Consiste em mergulhar a lâmina na água e coletar o material esticado
sobre a lâmina. Em seguida a lâmina é colocada sobre uma platina aquecedora
para que seja feita a secagem, a fusão da parafina impregnada no tecido e evitar o
aparecimento de microdobras

24. Lâminas de vidro com os cortes já distendidos sobre a
platina aquecedora

25. Coloração com Hematoxilina e Eosina
(HE)
Objetivo da coloração
Os cortes de tecidos apresentam-se incolores após
a microtomia. A coloração visa contrastar as
estruturas teciduais. A ação da maioria dos
corantes se baseia na interação entre os radicais
ácidos ou básicos dos elementos químicos dos
mesmos com os dos tecidos. No entanto existem
outros tipos de corantes, como será descrito
adiante.

26. Corantes Ácidos e Básicos
Eosina e Hematoxilina: A hematoxilina é um corante básico que
carrega uma carga positiva na porção da molécula que irá conferir cor
ao tecido. Corantes básicos reagem com componente aniônicos das
células e tecidos, os quais incluem grupos fosfatos, ácidos nucléicos,
grupos sulfatos de glicosaminoglicanas e grupos carboxila das
proteínas. A habilidade de grupos aniônicos reagirem com corantes
básicos é chamada basofilia, estruturas celulares que se coram com
corantes básicos são denominadas basófilas. Estruturas celulares que
podem ser coradas com corantes básicos incluem heterocromatina,
nucléolo, RNA ribossômico, matriz extracelular da cartilagem. A
hematoxilina cora geralmente as estruturas em azul.
Corantes ácidos reagem com componentes catiônicos das células e
tecidos. Quando usados juntamente com corantes básicos como a
hematoxilina, coram o citoplasma, filamentos citoplasmáticos e fibras
extracelulares. A eosina geralmente cora as estruturas em vermelho
ou rosa.

27. • Outros exemplos:corantes ácidos: fucsina ácida, azul de anilina e
orange G; básicos: azul de metileno, verde metil e azul de toluidina.
• Outras técnicas de coloração
• Hematoxilina e eosina são corantes adequados para evidenciar
características estruturais, mas eles não são capazes de revelar
todos componentes celulares. Outras técnicas de coloração são
disponíveis para evidenciar diferentes componentes.
• Coloração pela prata – Algumas substâncias intra e extracelulares
promovem a redução do nitrato de prata que formam precipitados
negros em estruturas como fibras reticulares dos linfonodos, por
exemplo.
• Associação de corantes - É a somatória de corantes diferentes,
como o Tricrômico de Gomori, que usa verde luz, cromotropo 2R e
hematoxilina
• Após a coloração as lâminas são montadas ou seja, os fragmentos
são protegidos pela cobertura com lamínulas de vidro. Esta é colada
na lâmina através de substâncias selantes como por exemplo o
Entellan. Após a secagem, as lâminas podem ser observadas ao
microscópio de luz.

28. • http://www.anatomohistologia.uns.edu.ar/plantil
la.asp?zona=modtecni
• http://histologiavet.blogspot.com.br/2007/02/et
apas-na-preparao-dos-tecidos-ou-rgos.html
• http://bioceletecidual.blogspot.com.br/2014/11/
preparacao-de-laminas-histologicas.html
• http://compartilhandoamedicina.blogspot.com.b
r/2013/12/histologia-tecnicas-de-preparacao-
de.html
• http://depto.icb.ufmg.br/dmor/pad-
morf/histologicabasica.htm