Desarrollo de péptidos bioactivos y probióticos para la tercera_Daniel Ramón

1. º
Desarrollo de péptidos bioactivos y probióticos para la tercera edad

2. Ingredientes funcionales para la tercera edad
1. El proyecto SENIFOOD
2. A la búsqueda de péptidos bioactivos
3. ES1: un probiótico contra la inflamación
4. Conclusiones

3. Ingredientes funcionales para la tercera edad
1. El proyecto SENIFOOD
2. A la búsqueda de péptidos bioactivos
3. ES1: un probiótico contra la inflamación
4. Conclusiones

4. Biopolis SL
• Empresa biotecnológica creada hace
diez años como una spin-off del CSIC
• De la búsqueda del producto a su
validación, de la idea original a la
comercialización (“tailor-made
biotechnology”)
• Trabajamos con la excelencia científica
como herramienta para comercializar
productos de alto valor añadido
• Nos dirigimos al sector de la
alimentación humana y al químico
farmacéutico
• Somos expertos en la búsqueda,
validación y producción de ingredientes
funcionales y en la revalorización de
residuos

5. Centro de I+D
• El Centro de I+D de Biopolis SL está situado en el Parc Cientific de la Universitat de
València; es un edificio con 1500 m2
• Está formado por once laboratorios y dos plantas de producción (una GMO y otra no-
GMO), así como toda una serie de instalaciones anejas
• Todas las instalaciones han sido autorizadas por la Comisión Nacional de Bioseguridad

6. Las plataformas de trabajo
Bioquímica
Microbiología
Biología molecular
Cultivos celulares
Organismos modelo
Escalado
Fermentación
Metabolómica
Modelos murinos
Genómica

7. La principal fortaleza
• En el grupo Biopolis trabajan 43 personas (36 en Biopolis SL y 7 en Lifesequencing
SL)
• La mayoría son doctores (18) o licenciados (15); el resto son FP de grado superior
(10)
• Nuestra plantilla incluye biólogos, biotecnólogos, farmacéuticos, informáticos,
ingenieros agrónomos e ingenieros químicos, químicos, tecnólogos de alimentos,
abogados y economistas

8. El proyecto SENIFOOD
Mejorar la calidad de vida de las personas mayores por medio de la alimentación
a través de la formulación de dietas equilibradas de acuerdo con carencias
nutricionales o patologías propias de las personas mayores o derivadas del
envejecimiento

9. Objetivos de Biopolis SL en SENIFOOD
Péptidos
InflamaciónProbióticos
Alzheimer

10. Ingredientes funcionales para la tercera edad
1. El proyecto SENIFOOD
2. A la búsqueda de péptidos bioactivos
3. ES1: un probiótico contra la inflamación
4. Conclusiones

11. La enfermedad de Alzheimer
Estrés oxidativo
Inflamación
Degeneración neuronal
Haces neurofibrilares
Inhibición de PEP
Efecto antioxidante in vivo
Efecto antiagregante in vivo

12. Escrutinio de residuos agroalimentarios
Z-gly-pro-ρNA ρNA
PEP
OD410
± producto
Estrés
oxidativo
(3mM H2O2)
5 horas
5 días
- CCX
+ CCX
Viables
C. elegans
Wild-type N2
1
2
3
Δt

13. El barquillo de cacao

14. Péptidos desde el barquillo de cacao
Hydrophobic Interaction chromatography (HIC)
HIDRÓLISIS PROTEÍCA
FRACCIONES HIC
FRACCIONES HIC POSITIVAS
Reverse Phase Chromatography (RPC)
FRACCIONES RPC
FRACCIONES RPC POSITIVAS
MALDI-TOF
“COCOA BARQUILLO”
IDENTIFICACIÓN DE LOS
PÉPTIDOS

15. Identificación del péptido
Theobroma cacao 21 kDa seed protein (221 aas)
FRACCIONES RPC POSITIVAS
IDENTIFICACIÓN MALDI-TOF
SECUENCIAS PEPTÍDICAS (17 péptidos)
mktatavvlllfaftsksyffgvanaanspvldtdgdelqtgvqyyvlssisgagggglalgratgqscpeivvqr
rsdldngtpvifsnadskddvvrvstdvniefvpirdrlcststvwrldnydnsagkwwvttdgvkgepgpnt
lcswfkiekagvlgykfrfcpsvcdscttlcsdigrhsdddgqirlalsdnewawmfkkasktikqvvnakh
B. Muguerza, H. Monzó, N. Alepuz, E. Bataller, S. Genovés, M. Enrique, P. Martorell, D. Ramón. (2010). Obtainment of cocoa extracts rich in
bioactive peptides with inhibiting activity of ACE and PEP enzymes. EP2322041A1
E. Bataller, S. Genovés, P. Martorell, D. Ramón, A. Ibañez, S. Llopis, N. González, H. Monzó, B. Muguerza. (2011). Obtainment of bioactive products
from cocoa having inhibitory activity against the PEP enzyme and antioxidant and/or anti-neurodegenerative activity. WO2011/076954A1

16. Resultados
0
10
20
30
40
50
60
70
80
NGM NGM+vitaminC 9L 11R 13L 13R
%WormSurvival(C.elegansN2)
AntioxidantActivity
24 41 43 45 47 49 51 53
0
25
50
75
100
125
NGM
ZPP
9L
11R
13L
13R
not induced
Time (h)
PercentageNotparalyzed
• Paralysis
assay
IC50 PEP 13-mer
(0.19 mg/ml)
[13-mer] mg/ml
0,0001 0,001 0,01 0,1 1
%Inhibition
-20
0
20
40
60
80
100
• El valor IC50 más bajo para la inhibición de PEP lo dió el péptido 13L-mer (0.19 mg/mL)
• Este péptido presentó la mayor actividad antioxidante in vivo
• También fue el más eficaz en la reducción de la parálisis
• Curiosamente, el péptido 13L-mer inhibe in vitro la enzima humana PLA2
• Hemos detectado trazas de este péptido en chocolates comerciales
Actividad antioxidante ParálisisInhibición PEP

17. Transcriptómica
PÉPTIDO 13L-mer
Regulación
Metabolismo del
piruvato
Regulación
Proteasoma
Regulación
Metabolismo del
triptófano
Acetil coA Turnover de proteínas Serotonina
Función sináptica Reducción del
agregado amiloide
Locomoción
Apetito
REDUCCIÓN DE LA
TOXICIDAD DE Aβ

18. Inhibición de la agregación de Aβ
25
112
30
61
13
Tubulina
Placebo 13L
Ratiodeagregación
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Martorell P, Bataller E, Llopis S, González N, Álvarez B, Montón F, Ortíz P, Ramón D, Genovés S. A cocoa peptide protects Caenorhabditis elegans
from oxidative stress and β-amyloid peptide toxicity. PLOS ONE 8: e63283

19. Ingredientes funcionales para la tercera edad
1. El proyecto SENIFOOD
2. A la búsqueda de péptidos bioactivos
3. ES1: un probiótico contra la inflamación
4. Conclusiones

20. Origen de la cepa
• La cepa ES1 fué aislada por el grupo de la Dra.
Yolanda Sanz en el Instituto de Agroquímica y
Tecnología de Alimentos del Consejo Superior de
Investigaciones Científicas en Valencia
• Se aisló a partir de las heces de un niño sano, menor
de tres meses y sometido a lactancia materna
• Mediante taxonomía molecular (secuenciación de la
región del gen que codifica el rRNA 16S) se ha
clasificado como un miembro de la especie
Bifidobacterium longum
• Dicha especie está incluida en los listados GRAS y
QPS de la Food and Drug Administration y la
European Food Safety Agency, respectivamente
• La cepa está protegida por una patente y depositada
en la Colección Española de Cultivos Tipo bajo el
código CECT 7347; esta patente fue licenciada en
exclusiva a Biopolis SL y está transferida a varios
países

21. Respuesta anti-inflamatoria en células PBMC
• Se ha realizado un estudio con heces coincubadas
con la cepa ES1 y se diseñaron controles negativos
sin la cepa; las muestras se usaron posteriormente
para estimular células mononucleares de sangre
periférica (PBMC) provenientes de individuos
adultos sano
• Las heces de los individuos con inflamación dieron
lugar a un incremento de la producción de TNFα y
la expresión de CD86 y a una disminución de la
producción de IL-10 y la expresión de CD4
• Las heces coincubadas con la cepa ES1 suprimieron
esta respuesta pro-inflamatoria e incrementaron la
producción de IL-10

22. • Se hicieron experimentos similares con
células Caco-2
• Se midieron los niveles de transcripción
de los genes que codifican el receptor
CXCR3, NFκβ y TNFα
• Por ELISA se analizaron los niveles de las
proteínas correspondientes y de IL-1β y
p50
• Los cultivos celulares coincubados con
la cepa ES1 tenían reducidos los niveles
de transcripción y, consecuentemente,
las concentraciones celulares de IL-1β,
NFκβ , p50 y TNFα
Respuesta anti-inflamatoria en células Caco-2

23. Respuesta anti-inflamatoria en células dendríticas
• Se investigó la interacción de la cepa ES1 con
células dendríticas derivadas de monocitos
(CDDM), en combinación con gliadinas y
células Caco-2
• Al contrario que algunas cepas
patógenas(Escherichia coli o Shigella CBD8),
la cepa ES1 indujo mínimos cambios
morfológicos en las células CDDM y activó
menos la adhesión, la propagación y la
producción de citoquinas inflamatorias
• Además, promovió una menor inducción de
la expresión de CD86 y CD40 y una
reducción en la producción inducida por
gliadinas de IFN-γ, y dio lugar a un
incremento en la secreción de IL-10

24. Estudio preclínico de efectividad en ratas
B. longum ES1
Placebo
• Se usó un modelo de enteropatía
inducida por gliadinas utilizando ratas
recién nacidas sensibilizadas con IFN-γ
que fueron alimentadas con la cepa ES1
frente a un grupo control alimentadas
con placebo
• Las ratas alimentadas con la cepa ES1
tenían importantes cambios en la
morfología del epitelio intestinal
• En concreto, era posible detectar en las
ratas de este grupo una restauración de
la altura de los enterocitos, una de las
características negativas de la
enfermedad celiaca

25. Respuesta anti-inflamatoria en animales
• Además, en los dos grupos se analizó la producción de componentes
del sistema inmunitario y se estudió la microbiota de las heces
• Los yeyunos de las ratas alimentadas con la cepa ES1 contenían menos
TNF-α y más IL-10

26. Estudios de seguridad alimentaria in vitro
• Se evaluó la seguridad alimentaria del probiótico ES1 siguiendo las
recomendaciones de FAO y OMS
• Se analizó la producción de metabolitos no deseados (aminas biogenas, ratio
D-láctico/L-láctico y sales biliares desconjugadas,) no detectándose valores
problemáticos
• Se determinaron los break-points de una veintena de antibióticos de uso
clínico y no se detectó resistencia significativa a alguno de ellos

27. Estudios de seguridad alimentaria in vivo
• En colaboración con el Instituto Pasteur de
Montevideo, se llevó a cabo un estudio de
ingesta aguda de la cepa ES1 (109 ufc/día)
en ratones BALB/c sanos o sometidos a
inmunodepresión por tratamiento con
ciclofosfamida
• No se detectó mortalidad ni patologías
asociadas a la ingesta de la cepa
• Tampoco se observó translocación de la
cepa, pudiéndose concluir la seguridad
alimentaria de la misma

28. Secuenciación del genoma de la cepa
• Se ha secuenciado el genoma de la cepa ES1
utilizando técnicas de pirosecuenciación
genómica masiva
• El genoma de la cepa ES1 tiene
aproximadamente 2.5 Mb
• En total se dispone de casi 75 Mb de
información (aproximadamente 30X de
secuencia del genoma)
• No se detectan genes de virulencia o
factores de patogenicidad
• No hay genes funcionales de resistencia a
antibióticos

29. Escalado de producción
• Se ha escalado la fermentación de la cepa ES1, desde el laboratorio a la planta piloto y
desde la planta piloto a la planta de producción
• El proceso de fermentación ya está optimizado
• También se ha escalado y optimizado el proceso de secado por liofilización

30. Ensayo clínico fase I
• Se llevó a cabo con 12 voluntarios humanos
(edad media 30.3 años, rango de 23 a 40
años); fue un ensayo doble ciego, aletaorio y
con control de placebo
• Los voluntarios ingirieron la cepa ES1 o el
placebo durante dos semanas (109 ufc/día),
posteriormente se realizó un período de
lavado de 2 semanas y luego se siguió la
ingesta cruzada durante otras 3 semanas
• La ingesta de la cepa ES1 no produjo efectos
adversos
• La microbiota de las heces de los individuos
control frente a los que habían ingerido la
cepa ES1 no presentó diferencias
significativas, si bien el 70-80% de las cepas
de bifidobacterias en los individuos
problema eran la cepa ES1

31. Ensayo clínico fase II (I)
• Se llevó a cabo un ensayo doble ciego,
aletaorio y con control de placebo sobre 40
niños celiacos voluntarios de edades
comprendidas entre los 2 y los 14 años
(Hospital Universitari Sant Joan de Reus y
Hospital Sant Joan de Déu de Barcelona)
• Uno de los grupos recibió la cepa ES1
durante 3 meses en una dosis diaria de 109
ufc y el otro recibió un placebo
• Al analizar sangre periférica se detectó una
disminución de la concentración de TNF-α y
de linfocitos CD3+
• Finalmente, los individuos del grupo que
había ingerido el probiótico presentaron una
mayor talla y peso (si bien en este último
caso la diferencia no fue estadísticamente
significativa)

32. Ensayo clínico fase II (II)
• El estudio de la microbiota de los dos grupos reveló datos muy interesantes
• Se detectó una disminución estadísticamente significativa de Bacteroides y
Clostridium en el grupo que recibió el probiótico ES1 frente al grupo que
recibe el placebo
• El grupo que recibió la cepa ES1 presentó mayores recuentos de
bifidobacterias, aunque los datos no fueron estadísticamente significativos

33. Dossier científico
• Izquierdo E, Medina M, Ennahar S, Marchioni E, Sanz . (2008). Resistance to simulated gastrointestinal
condtions and adhesions to mucus as probiotic criteria for Bifidobacterium longum strains. Current
Microbiology 56: 613-618
• Medina M, de Palma G, Ribes-Koninckx C, Calabuig M, Sanz Y. (2008). Bifidobacterium strains suppress in vitro
the pro-inflammatory milieu triggered by the large intestinal microbiota of coeliac patients. Journal of
Inflammation 3: 5-19
• Laparra JM, Sanz Y. (2010). Bifidobacteria inhibit the inflammatory response induced by gliadins in intestinal
epithelial cells via modifications of toxic peptide generation during digestion. Journal of Cell Biochemistry 109:
801-807
• Olivares M, Laparra M, Sanz Y. (2011). Influence of Bifidobacterium longum CECT 7347 and gliadin peptides on
intestinal epithelial cell proteome. Journal of Agricultural and Food Chemistry 59: 7666-7671
• Laparra JM, Olivares M, Gallina O, Sanz Y. (2012). Bifidobacterium longum CECT7347 modulates immune
responses in a gliadin-induced enteropathy animal model. PLoS ONE 7: e30744
• de Palma G, Kamanova J, Cinova J, Olivares M, Drasarova H, Tuckova L, Sanz Y. (2012). Modulation of
phenotypic and functional maturation of dendritic cells by intestinal bacteria and gliadin: relevance for celiac
disease. Journal of Leukocyte Biology 92: 1043-1054
• Olivares M, Laparra M, Sanz Y. (2012). Oral administration of Bifidobacterium longum CECT 7347 modulates
jejunal proteome in an in vivo gliadin-induced enteropathy animal model. Journal of Proteomics 77: 310-320
• Chenoll E, Codoñer FM, Silva A. Ibañez, Martínez-Blanch JF, Bollati-Fogolin M, Sanz Y, Ramón D, Genovés S.
(2013). Genomic sequence and pre-clinical safety assessment of Bifidobacterium longum CECT7347, a probiotic
able to reduce the toxicity and inflammatory potential of gliadin-derived peptides. Journal of Probiotics and
Health 1: 106 doi:10.4172/jph.1000106
• Laparra JM, Olivares M, Sanz Y. (2013). Oral administration of Bifidobacterium longum CECT 7347 ameliorates
gliadin-induced alterations in liver iron mobilization. British Journal of Nutrition 110: 1828-1836
• Olivares M, Castillejo G, Varea V, Sanz Y. (2013). Double-blind, randomized, placebo-controlled intervention trial
to evaluate the effects of Bifidobacterium longum CECT 7347 on children with newly diagnosed celiac disease.
Aceptado en British Journal of Nutrition

34. El producto Proceliac

35. Ingredientes funcionales para la tercera edad
1. El proyecto SENIFOOD
2. A la búsqueda de péptidos bioactivos
3. ES1: un probiótico contra la inflamación
4. Conclusiones

36. Biología de sistemas: clave de futuro
• Nuestra experiencia de I+D con clientes
nos ha enseñado que un abordaje
genómico/metabolómico es clave para
entender el fondo real de los problemas
industriales
• Estamos empezando a entender la
biología de sistemas a través de nuestros
proyectos internos de I+D
• No nos creemos el binomio ciencia básica
versus ciencia aplicada
• Nos gusta el modelo de interacción con lo
público que siguen algunos de nuestros
clientes en Holanda, Suiza y países
nórdicos

37. El ejemplo de los líderes

38. Daniel Ramón Vidal (daniel.ramon@biopolis.es)
http://www.linkedin.com/profile/view?id=64921252&trk=tab_pro
Biopolis SL
Parc Cientific Universitat de València
C/ Catedrático Agustín Escardino Benlloch 9; Edificio B; 469809-Paterna; Valencia