А.Солдатов

1. А.Солдатов, MPI for Molecular Genetics, Berlin
проф. Ханс Лерах – руководитель лаборатории
Татьяна Бородина, кбн – «мокрая» биология
Алексей Давыдов, аспирант – «мокрая» биология
Дмитрий Пархомчук, кбн – биоинформатика
Области интересов: анализ экспрессии генов и гаплотипирование.
Группа была вовлечена в NGS-сиквенирование с первых моделей
машин. Принимала участие в нескольких интернациональных
проектах.
Применение технологий секвенирования
ILLUMINA для исследований человека
революция в
биомедицине
•
биология
•
медицина
•
человеческая
история
•
текущий момент
•
перспективы
Применение технологий секвенирования ILLUMINA для исследований человека // А.Солдатов, MPI for Molecular Genetics, Berlin

2. Общеинтересный слой
• в настоящее время в биомедицине происходит компьютерная
революция
• эта революция сильно изменит биологию, медицину и ощутимо
поменяет повседневную жизнь
В двух словах о всѐм выступлении
революция в
биомедицине
•
биология
•
медицина
•
человеческая
история
•
текущий момент
•
перспективы
Применение технологий секвенирования ILLUMINA для исследований человека // А.Солдатов, MPI for Molecular Genetics, Berlin

3. Профессиональный слой
• двигателем революции является внедрение
высокопроизводительных методов сиквенса ДНК в исследовательскую
и медицинскую практику
• NGS-методы очень востребованы. Многие области биомедицины
выиграли/выиграют от их внедрения
• необычно и странно, что уже несколько лет общий прогресс
определяется главным образом аномально высокой скоростью
улучшения сиквенса. Из-за этого тот, кто хочет преуспеть в ближней
перспективе, должен (кроме всего прочего) ответственно отнестись к
выбору сиквенсовой платформы
• в дальней перспективе важно сознавать, что мы участвуем в
компьютерной революции, а не в конкурсе на лучший сиквенсовый
прибор.
В двух словах о всѐм выступлении
революция в
биомедицине
•
биология
•
медицина
•
человеческая
история
•
текущий момент
•
перспективы
Применение технологий секвенирования ILLUMINA для исследований человека // А.Солдатов, MPI for Molecular Genetics, Berlin

4. • сложные задачи можно решать сложным способом,
совершенствуя подходы и алгоритмы коллективными усилиями
• можно быстро обработать большие объѐмы данных
• алгоритмы легко адаптируются к подобным задачам
Компьютерная революция
революция в
биомедицине
•
биология
•
медицина
•
человеческая
история
•
текущий момент
•
перспективы
Применение технологий секвенирования ILLUMINA для исследований человека // А.Солдатов, MPI for Molecular Genetics, Berlin

5. • цифровые данные: однажды полученный результат не меняется
• ожидаемое будущее: все уже давно ждут, когда «понятный
геном» и «понятный транскриптом» изменят нашу жизнь к лучшему
• разнообразные области применения - этому будет посвящена
существенная часть слайдов
• высокая чувствительность: возможность работать с биопсиями,
парафиновыми срезами, на уровне отдельных клеток
• быстрое развитие технологии: опережение закона Мура
Двигатель революции: сиквенс ДНК
революция в
биомедицине
•
биология
•
медицина
•
человеческая
история
•
текущий момент
•
перспективы
Применение технологий секвенирования ILLUMINA для исследований человека // А.Солдатов, MPI for Molecular Genetics, Berlin

6. Карта распределения по планете сиквенаторов следующих поколений
http://pathogenomics.bham.ac.uk/hts/

7. Масштабные сиквенсовые проекты
Применение технологий секвенирования ILLUMINA для исследований человека // А.Солдатов, MPI for Molecular Genetics, Berlin
революция в
биомедицине
•
биология
•
медицина
•
человеческая
история
•
текущий момент
•
перспективы

8. Масштабные сиквенсовые проекты
Применение технологий секвенирования ILLUMINA для исследований человека // А.Солдатов, MPI for Molecular Genetics, Berlin
революция в
биомедицине
•
биология
•
медицина
•
человеческая
история
•
текущий момент
•
перспективы
• 1000 Genomes Project: поиск геномных вариаций в ~20 популяциях
• PGP: personal genome project: изучение вклада наследственности и среды в
проявление различных признаков; секвенирование геномов добровольцев,
согласных предоставить личную информацию
• GEUVADIS Genetic European Variation in Disease: медицинскя интерпретация
сиквенсовых данных для разных моно- и полигенных заболеваний; на основе
RNA-Seq и ExonSeq
• ESGI: European Sequencing and Genotyping Infrastructure: организация NGS
инфраструктуры для европейского научного сообщества
• IHEC: International Human Epigenome Consortium: характеристика эпигенома
человека, ~1000 образцов
Раковые программы
выявление диагностичеких маркеров, анализ и выбор лечения
• ICGC: International Cancer Genome Consortium: подпрограммы по разным
видам рака (напрмер, рак простаты, детские опухоли мозга)
• Treat 1000: разные виды рака
• OncoTrack: рак прямой кишки
• CAGEKID: рак почки
• Treat 20: меланома

10. Анализ генома
Применение технологий секвенирования ILLUMINA для исследований человека // А.Солдатов, MPI for Molecular Genetics, Berlin
Сиквенс и ресиквенс
• микроорганизмы / малые геномы: самый эффективный подход
• большие геномы: ресиквенс с анализом небольших перестроек был хорош
всегда, сиквенс de novo и анализ больших перестроек совершенствуются на
глазах
• классификация организмов по молекулярным признакам
• сиквенс определенных областей генома: обогащение
Геномная архитектура
• позиция нуклеосом
• трѐхмерная структура генома: 3C (hypothesis-free) и 5C
(высокопроизводительный анализ)
Эпигенетика
• метилирование: сиквенс после бисульфидной обработки или ChIP-Seq
• возможно, машины третьего поколения смогут определять модификации
напрямую
Взаимодействие нуклеиновых кислот с белками
• ChIP-Seq
• полногеномный неселективный анализ мест посадки белков
• гиперчувствительность к нуклеазам, FAIRE-Seq
• анализ специфичности взаимодействия, поиск консенсусных
последовательностей
революция в
биомедицине
•
биология
•
медицина
•
человеческая
история
•
текущий момент
•
перспективы

11. Полнота анализа
• все типы РНК: кодирующие последовательности, малые некодирующие РНК,
антисенс-транскрипция и т.д.
• чувствительность: при адекватной организации эксперимента можно быть
уверенным, что замечены все действующие РНК
• структура транскриптов: очень хорошо с аллельной экспрессией и РНК-
редактированием, есть прогресс по анализу сплайс-вариантов
RNA-Seq позволяет
• определять как отностительный, так и абсолютный уровни экспрессии
• аннотировать новые и уточнять аннотацию известных генов
•смотреть отдельно ядерную, цитоплазматическую, ассоциированную с
рибосомами (в цитоплазме и на мембранах) и т.п. РНК
• выявлять присутствие в образце микроорганизмов и вирусов
Чувствительность
пропорциональна цене, можно грубо оценить как ~$150 за уровень 1 копия на
клетку
Транскрипция: RNA-Seq
Применение технологий секвенирования ILLUMINA для исследований человека // А.Солдатов, MPI for Molecular Genetics, Berlin
революция в
биомедицине
•
биология
•
медицина
•
человеческая
история
•
текущий момент
•
перспективы

12. Сравнительный функциональный анализ
Применение технологий секвенирования ILLUMINA для исследований человека // А.Солдатов, MPI for Molecular Genetics, Berlin
Сравнение геномов разных видов позволяет
• выявить функциональные элементы генома
• связать эволюционные нововведения с появлением в геноме
новых функциональных участков, типа проект «Origins of
Multicellularity»
• выявить механизмы и движущие факторы эволюции для
разных эпох
• разобраться, что отличает нас от ближайших и дальних
родичей
Внутривидовое сравнение геномов
• причина тонких различий в реакции на факторы окружающей
среды (болезни) и поведении
• факторы, определяющие сложные полигенные признаки (рост,
вес, предрасположенность к распространенным болезням)
• факторы отбора в «историческое» время
• механизмы рекомбинации
революция в
биомедицине
•
биология
•
медицина
•
человеческая
история
•
текущий момент
•
перспективы

13. • анализ всех видов вариаций: замены, малые делеции/инсерции,
CNV (психические расстройства), большие хромосомные
перестройки
• гаплотип: пока довольно сложно, но по-любому сиквенсом
• GWAS – сейчас на чипах. Снижение цены приведѐт к
переключению на сиквенс. При этом качество и охват повысятся.
Будет окончательный результат, а не QTL. Преодоление кризиса
«потерянной наследственности»
Вариации
Применение технологий секвенирования ILLUMINA для исследований человека // А.Солдатов, MPI for Molecular Genetics, Berlin
революция в
биомедицине
•
биология
•
медицина
•
человеческая
история
•
текущий момент
•
перспективы

14. Предрасположенность к болезни → генотип
• GWAS, вовлеченные гены
• редкие болезни, семейный анализ: «быстрый» тест сиквенсом
кодирующих последовательностей
• молекулярные причины болезни, выбор мишени
• выявление патогена: холера на Гаваях, токсичная E.coli в Германии
• неинвазивная и пренатальная диагностика по ДНК в крови
Болезнь → профиль экспрессии
• классификация опухолей, тонкий и/или ранний диагноз
Медицинская биология
Применение технологий секвенирования ILLUMINA для исследований человека // А.Солдатов, MPI for Molecular Genetics, Berlin
революция в
биомедицине
•
биология
•
медицина
•
человеческая
история
•
текущий момент
•
перспективы

15. Проекты по сиквенсу разных типов опухолей
• спектр мутагенеза, «завершить» список онкогенов
• тестирование лекарств на клеточных линиях и ксенографах
• тонкая диагностика и «стандартные» способы лечения
• неинвазивная диагностика (посттреатмент): ДНК и опухолевые
клетки в крови
Онкология
Применение технологий секвенирования ILLUMINA для исследований человека // А.Солдатов, MPI for Molecular Genetics, Berlin
революция в
биомедицине
•
биология
•
медицина
•
человеческая
история
•
текущий момент
•
перспективы

16. Превентивная медицина неизбежна
• 4 миллиона американцев страдают болезнью Альцгеймера. Это
обходится национальной системе здравоохранения в $500
миллионов в год. В связи с увеличением продолжительности жизни
ожидается, что сумма возрастѐт до $1-2 миллиардов (5-10% ВВП)
в ближайшие десятилетия.
• ежегодно тратится ~$132 миллиона на лечение диабета второго
типа. Ранний диагноз и умеренное изменение стиля жизни
способны существенно снизить расходы
• 60% страховых выплат приходится на последние два года жизни
Персональная и превентивная медицина
Применение технологий секвенирования ILLUMINA для исследований человека // А.Солдатов, MPI for Molecular Genetics, Berlin
революция в
биомедицине
•
биология
•
медицина
•
человеческая
история
•
текущий момент
•
перспективы

17. Персональная медицина
• лекарство для черных (сосуды) BiDil
• Vioxx scandal, популярное лекарство было отозвано из-за
побочных эффектов
• практически все противораковые лекарства очень вредны
– очень востребован персональный подбор
Виртуальный пациент / доктор
• инициатива http://www.itfom.eu/ сиквенс, масс-спек и
другие объективные анализы
Персональная и превентивная медицина
Применение технологий секвенирования ILLUMINA для исследований человека // А.Солдатов, MPI for Molecular Genetics, Berlin
революция в
биомедицине
•
биология
•
медицина
•
человеческая
история
•
текущий момент
•
перспективы

18. DTC (direct-to-consumer) тестирование:
компании-участники
Применение технологий секвенирования ILLUMINA для исследований человека // А.Солдатов, MPI for Molecular Genetics, Berlin
революция в
биомедицине
•
биология
•
медицина
•
человеческая
история
•
текущий момент
•
перспективы
Весной 2010 года более 30 DTC-компаний предлагали более 400 тестов, связанных со
здоровьем.
Пока – либо цирк (практ. польза – выбор супруга для малых замкнутых популяций), зато
дешевый, либо всерьез, но дорого, а толку мало (как резюме – плохое покрытие
страховыми взносами, превентивный сиквенс точно не оплатят, разве что постфактум).
Проблема серьѐзного подхода – отсутствие фазы.
Практически все компании позиционируют свои тесты как "для образовательных и
информационных целях", но не медицинские. Видимо, в первую очередь это связано с
лицензированием медицинской деятельности. Реальная польза очень ограничена и
сложно получить лицензию на такую работу в области здравоохранения.
Большие корпорации. Погнозы усредняются и становятся надежнее. Выигрыш за счет
экономии на лечении.

19. • происхождение человека (Европа, Азия, Африка, Южная и Северная Америка и т.п.),
колличественно (в процентах). Актуально для Американцев
материнская линия -- по митохлндриальной ДНК
отцовская -- по Y-хромосоме
• SNP связанные с разными забавными признаками, совершенно не не влияющими на
жизнеспособность, типа чувствительность к запаху мочи после спаржи, умение сворачивать
язык в трубочку, цвет глаз, консистенция ушной серы, склонность к облысению, способность
вкус горечи брюссельской капусты, способность потреблять молоко, чихание на ярком
солнце
• SNP, связанные с признаками, которые могут быть полезны сейчас, но не могли
подвергаться отбору ранее:
-- скорость метаболизма кофеина
-- генетическая предрасположенность к героиновой зависимости
-- воспреимчивость к лекарствам может быть сильно сцеплена с SNP
• не рекламируется, но очевидно может использоваться для установления родственных
связей (в том числе -- отцовства и материнства)
• редкие наследственные заболевания -- высокий риск заболеть, но заболевания
действительно редкие -- подавляющее большинство пациентов ничего подобного не
обнаружат
• "сильный прогноз" на распространенные заболевания -- единственный пример
apolipoprotein E (APOE): 2% населения гомозиготы, 15-кратно выше риск заболеть
-- забавно, что о нем Уотсон и не хотел узнавать.
* "слабые прогнозы" на распространенные заболевания -- довольно много, но с очень
слабой предсказательной ценностью
DTC тестирование: типичный пакет
Применение технологий секвенирования ILLUMINA для исследований человека // А.Солдатов, MPI for Molecular Genetics, Berlin
революция в
биомедицине
•
биология
•
медицина
•
человеческая
история
•
текущий момент
•
перспективы

20. https://www.23andme.com/
Silicon Valley; California, ноябрь 2007
основатели Anne Wojcicki (еѐ муж --
Sergey Brin -- один из владельцев
Google) и Linda Avey
Вначале -- $999 -- 600,000 SNP на ките от
Illumina
С сентября 2008 -- $399,
На сегодня – лидер области. Собственно анализ
проводит посторонняя лаборатория. Фирма
проводит web-представление результатов,
прогнозы, хранение, предоставление новой
информации по мере исследований.
Sergey Brin обнаружил, что он носитель G2109S
мутации, приводящей к 60% риску болезни Паркинсона.
Написал в блоге, что это дало ему возможность
готивится к возможной проблеме много лет:
поддерживать и проводить исследования в этой
области, выполнять профилактические упражнения.

21. http://www.decode.com/
CEO Kari Stefansson
Исландская биотехнологическая компания, предложила в ноябре
2007 web-сервис deCODEme для непосредственной работы с
потребителями. Сами являются первооткрывателями многих
ассоциаций сами проводили генотипирование.
Пожалуй, наиболее академически-сильная компания.
600,000 SNP на ките от Illumina
Исландия -- население: ~300,000, ~95% - местные. deCODE
Genetics имеет материал на ~140,000, из них 40,000 полностью
генотипированы
Компания обанкротились. В 2010 повысила цену на deCODEme
до нереальных $2000 и, фактически, вышла из игры

22. http://www.navigenics.com/
New York, весна 2008
основатель - онколог David Agus "Doc Hollywood"
-- родословная в фоне только для уточнения вероятности прогноза
-- не интересуются "развлекательными" количественными признаками; то же
для неизлечимых (без профилактических упражнений) болезней
«I just hope in my heart we didn't do this too early»
абстрактная оценка от Navigenics: среди знакомых и родственников, прошедших тест, примерно половина
предприняла какие-то позитивные действия: сходили к врачу или записались в тренажорный зал.

23. DTC-тестирование: регуляция деятельности

24. Сиквенс перс. Геномов
Например: Медицинская инициатива
http://www.itfom.eu/
Сравнение с шахматными программами
Сравнение с участковым и др. Хаусом
предросположенности к раку д.б. явными
• индивидуальный подбор лекарств (
• -- РАКОВЫЕ – все очень вредные – перс. Подбор очен
• лек
Виртуальный пациент / доктор
Применение технологий секвенирования ILLUMINA для исследований человека // А.Солдатов, MPI for Molecular Genetics, Berlin
революция в
биомедицине
•
биология
•
медицина
•
человеческая
история
•
текущий момент
•
перспективы

25. • история расселения, связь с жизнедеятельностью
(сельское хозяйство)
• факторы отбора в разное историческое время:
экспрессия лактазы во взрослом состоянии, цвет кожи
• (история с обр. стороны) персональная история –
откуда предки (компании кот анализ. Перс. геном)
История человечества: прошлое
Применение технологий секвенирования ILLUMINA для исследований человека // А.Солдатов, MPI for Molecular Genetics, Berlin
революция в
биомедицине
•
биология
•
медицина
•
человеческая
история
•
текущий момент
•
перспективы

26. несмотря на мрачные картины GATTACA серьѐзных
этических проблем не ожидается
• выбор эмбриона перед имплантацией (разрешено в Европе) – б.м.
очевидно распространяется на рисковые ситуации
• выбор супруга (опять же, без Шекспировских альтернатив)
• внебрачн детей типа «папа не знал» – не будет вообще
• спортсмены – уже проводятся генетические тесты. Но не как в
Гаттаке, а выбор среди равных
• страховки – если шансы на заболеть разные, то справедливо, если
разная оплата
• не только диагнозы, но и текущее состояние проблемы
История человечества: будущее
Применение технологий секвенирования ILLUMINA для исследований человека // А.Солдатов, MPI for Molecular Genetics, Berlin
революция в
биомедицине
•
биология
•
медицина
•
человеческая
история
•
текущий момент
•
перспективы

27. Выбор платформы: третье поколение
Применение технологий секвенирования ILLUMINA для исследований человека // А.Солдатов, MPI for Molecular Genetics, Berlin
революция в
биомедицине
•
биология
•
медицина
•
человеческая
история
•
текущий момент
•
перспективы

28. http://www.my454.com/
454 Life Sciences организована в 2000
Roche приобрела 454 за $150 million
В августе 2005 Rothberg опубликовал статью
описывающую 454-технологию в Nature. 26
25 million bases за четыре часа.
Май 2010 - геном Неандертальца

29. http://www.illumina.com/
Solexa,
Professor Shankar Balasubramanian
Illumina приобрела Solexa за $600 million
Летом 2006 Solexa отправила первые
инструменты в геномные центры
GA II – весна 2008
HiSeq2000 – начало 2010
MiSeq – конец 2011

30. http://www.appliedbiosystems.com/
$120 million Agencourt Personal
Genomics
Ion Torrent for $375 million

33. Выбор
платформы
параметр HiSeq2000 SOLiD 5500xl
oбласти применения,
приготовление библиотек,
типы ранов (SR, PE, barcoding),
параллелизация
≈
каналов во flowcell: HiSeq - 8, SOLiD - 6
качество
• одинаковое если проводится выравнивание
относительно референсного генома
• для de novo сборки качество выше у Illumina
цена машины SOLiD можно купить примерно в два раза дешевле
независимость каналов
-Illumina: 2 независимых flowcell
-SOLiD: 12 независимых каналов
производительность ~49Gb/день ~11Gb/день
цена (реактивы) ~€36/Gb ~€50/Gb
цена сиквенса генома человека ~€3330, три недели ~€4765, четыре недели
длина сиквенса
SR: до 100nt
PE: до 100 и 100nt
SR: до 75nt
PE: до 75 и 35nt
размер вставки <600bp <300bp
время приготовления flowcell 5 hours
1,5 days
максимум 4 библиотеки
в день (на одной EZ
Bead System)
удобство и стабильность
Illumina лучше SOLiDa:
-гораздо реже требует ремонта
-производительность соответствует или больше
заявленной
-немного удобнее и заметно безопаснее в смысле
загрязнения старой библиотекой
оптимизация сиквенса и
использование нестандартных
библиотек
Illumina существенно удобнее: легкое
перепрограммирование машины, простой переход на
новые сиквенсовые праймеры
революция в
биомедицине
•
биология
•
медицина
•
человеческая
история
•
текущий момент
•
перспективы

34. Выбор платформы: малые машины
Применение технологий секвенирования ILLUMINA для исследований человека // А.Солдатов, MPI for Molecular Genetics, Berlin
• существенно слабее и «дороже», чем большие братья. Цена за
нуклеотид Выход MiSeq: ~1/50 одной дорожки HiSeq2000, а цена -
~1/2 одной дорожки.
• «быстрые» сиквенсы (часы вместо дней) – важно для разработки
новых методов и клинической диагностики
• IonTorrent, MiSeq – выбор в пользу MiSeq. Основные причины:
-- полная совместимость с большим братом
-- большая гибкость за счѐт возможности читать обе цепи
революция в
биомедицине
•
биология
•
медицина
•
человеческая
история
•
текущий момент
•
перспективы

35. Выбор платформы: малые машины
Применение технологий секвенирования ILLUMINA для исследований человека // А.Солдатов, MPI for Molecular Genetics, Berlin
революция в
биомедицине
•
биология
•
медицина
•
человеческая
история
•
текущий момент
•
перспективы
Ion Torrent MiSeq
цена машины
~€96k (incl sequencer, server, Ion
OneTouch system and MwSt)
€125k (incl MwSt)
дополнительное
оборудование
none server (~15k)
тип сиквенса single read single read, PE
длина рида
max 100nt, in Oct. - 200nt; expected up
to 400nt in 2012
max 2x150nt
размер вставки ~600bp
цена сиквенса ~€ 400 (314) - €750 (316 or 318) €330 (1x50bp) - €630 (2x150bp)
число ридов 0.1-10 M (depending on the chip) ~3.4 M (~6.8 M for PE)
выход с одного
прогона
chip
type
wells bases
0.2 Gb (1x50bp) - >1 Gb (2x150bp)314 1,2 M >10 Mb
316 6,2 M >0,1 Gb
318 11,1 M >1 Gb
приготовление
библиотек
~10 hours
~3 hours with OneTouch system
as for Illumina
~1,5 hours (Nextera)
время одного
сиквенса
~3 hours
4 hours for 1 x 35bp
27 hours for 2x150bp reads

36. Быстрое развитие области
Применение технологий секвенирования ILLUMINA для исследований человека // А.Солдатов, MPI for Molecular Genetics, Berlin
• не стоит терять время на оптимизацию или
примитивно экономить: улучшаются параметры ридов
(длина, качество), цена падает
• важно учитывать быстрое развитие, чтобы не целится
в то, что уже минуло
• цена смещается в сторону вычислений
• делать то, что можно проанализировать сейчас –
иначе переплата
• неправильно брать параметры с запасом
• был слишком резкий скачек, не стоит строить иллюзии
о простоте анализа – все устаканется и без бутылки не
разберешься
революция в
биомедицине
•
биология
•
медицина
•
человеческая
история
•
текущий момент
•
перспективы

37. NB! один и тот же термин «сиквенирование» для классической и
новой технологии
• соотношение затрат на «мокрую» биологию и биоинформатику
падает... и будет только хуже
• вырабатываются стандарты
• cloud computing и возможность делать на стороне
Медикобиологические базы знаний
• модельные организмы, модельные ткани: dbSNP и геномных
перестроек, экспрессия: анотация экспрессирующихся участков,
базы сплайс-вариантов, уровень и вариабельность экспрессии
• каталог внутриклеточных процессов
• клинические диагностические базы знаний
Биоинформатика
Применение технологий секвенирования ILLUMINA для исследований человека // А.Солдатов, MPI for Molecular Genetics, Berlin
революция в
биомедицине
•
биология
•
медицина
•
человеческая
история
•
текущий момент
•
перспективы

38. Найти своѐ место
Применение технологий секвенирования ILLUMINA для исследований человека // А.Солдатов, MPI for Molecular Genetics, Berlin
• случится резкое изменение «востребованности» NGS, по
видимому, скачек вызовет клиника. Но двигателем будет академия.
аналогия с телефонией
• всех коснется через медицину, которой понадобятся объективные
данные
Аналогия с другими технологическими
революциями: повсеместное внедрение персональных
компьютеров, интернет, мобильная телефония, спутниковая связь и
навигация
• если биолог - надо разбираться в биоинформатике
• если медик – в прогностической медицине
революция в
биомедицине
•
биология
•
медицина
•
человеческая
история
•
текущий момент
•
перспективы