Présentation effectuée par le Dr. Félix Meutchieye dans le cadre de sa soutenance publique de thèse de Doctorat/Ph.D en Biotechnologies et Productions Animales qui a eu lieu le 26 février 2016 dans la salle des spectacles et des conférences de l'Université de Dschang.
A l'issue de cette soutenance, le candidat a obtenu la mention très honorable à l'unanimité des membres du jury.
Biodiversité moléculaire des écotypes de chèvres (Capra hircus) du Cameroun
1.
2. Bienvenue à Soutenance publique
de thèse de Doctorat/PhD
Biotechnologies et Productions Animales
Option: Amelioration Génétique et Systèmes de Production
Félix Meutchieye
Ing. Agro., MSc
République du Cameroun
Republic of Cameroon
Peace – Work - Fatherland
Université de Dschang
University of Dschang
Scholae Thesaurus Dschangensis Ibi Cordum
Faculté d’Agronomie et des Sciences
Agricoles
Faculty of Agronomy and Agricultural
Sciences
Département des Productions Animales
Department of Animal Production
2
4. Plan de l’exposé
• Introduction
• Matériels et Méthodes
• Résultats et discussions
• Conclusions et perspectives
4
5. 5
Biodiversité = la variabilité des organismes vivants de
toute origine (Nations Unies, 1992) => Capital vital global
Figure 2: Différentes échelles de la biodiversité
Introduction
6. Introduction
6
Enjeu mondial: effets néfastes des changements climatiques :
la biodiversité
la sécurité alimentaire (FAO, 2010).
Les animaux domestiques sont un maillon clé dans la
recherche des réponses durables (FAO, 2008).
Figure 1: Illustration d’une scene de vie dans un environnement semi- aride
Declaration de Malabo
% role élevage (AU,
2014) :
- Resilience de + 70%
des petits producteurs
-Accroissement de +
30% de l’investissement
7. 7
Marqueurs génétiques:
Phénotypiques: couleur, resistance... hérédité simple
Biochimiques: isoenzymes/isozymes
Moléculaires (ADN): RFLP, RAPD, AFLP, SSR, ADNmt
Figure 3: Polymorphisme de l’ADN avec des marqueurs microsatellites
Introduction
Etude de diversité
Marqueurs
moléculaires
neutres
8. Introduction
8
Problème global : Erosion des RGAn dans le monde
Solution globale: Déclaration d’Interlaken (FAO, 2007)
Situation régionale : Variable et pauvre en Afrique
Figure 4: Statut des stratégies et plans d’action de gestion des ressources
génétiques animales par région (Source: FAO, 2015)
9. Figure 5 : Risques d’érosion génétique chez les animaux domestiques (FAO, 2015)
9
Introduction
Croissance
numerique
importante
30% du cheptel
mondial en
Afrique
Interet
specifique en
raison de sa
riche diversite
biologique
11. Introduction
11
Descriptions majoritairement morpho-physiques
(Doutresoulle, 1947; Epstein, 1951 et 1962 ; Devendra et Burns,
1982 ; Lauvergne et al., 1993; Meutchieye, 2008).
Appellations => la variabilité (Epstein, 1962; Wangtchibing,
1990; Le Gal et Planchenault, 1993 ; Devendra et Burns, 2001),
Aucune évaluation biomoléculaire (FAO et al., 2003 ; RC, 2012) .
Part de la variabilité moléculaire dans le polymorphisme
phénotypique des écotypes de chèvres du Cameroun?
Hypothèse de travail : La diversité caprine au Cameroun est le
fait de la variabilité agro-écologique
12. Introduction
12
Objectif général: Contribuer à une meilleure connaissance
de la chèvre locale du Cameroun
Objectifs spécifiques : déterminer les caractéristiques
majeures du polymorphisme de
• 8 écotypes caprins du Cameroun à partir de 12 et 17
marqueurs microsatellites hétérologues et homologues;
• l’ADN mitochondrial des 8 écotypes caprins;
13. Introduction
13
Objectifs spécifiques (suite):
• En déduire la structure et les relations phylogénétiques
des 8 écotypes, et enfin,
• Evaluer l’efficacité relative des approches utilisées dans la
caractérisation de la diversité moléculaire.
En vue de leur amélioration génétique et de leur
préservation
14. 14
Matériels & Méthodes
Figure 7 : Carte des zones agro-écologiques du Cameroun
(Source : IRAD, 2008)
Zones d’étude
Cinq (05) zones agro-
écologiques du Cameroun:
Soudano-sahélienne
Hautes savanes guinéennes
Hautes terres de l’Ouest
Forestière humide à régime
pluviométrique monomodal
Forestière humide à régime
pluviométrique bimodal
15. 15
Matériels & Méthodes
Ecotypes Types morphologiques Mensurations Robe Objectifs
Sahelienne (CHSHL) Longipes HG ≥65cm;PV =20-45kg Plus blanche Viande, peau, lait
Kirdi (CHKRD) Longipes-Mediopes HG≈ 60cm; PV=20-35kg Variable Viande, peau, lait
Djallonke SG (DJHSG) Longipes-Mediopes HG≤ 60cm; PV=15-40kg Variable Viande, peau (lait)
Djallonke OU (DJHTOU) Longipes-Brevipes HG≤ 60cm; PV=15-30kg Variable Viande et petits
Djallonke NW (DJHTNW) Longipes-Brevipes HG≤ 60cm; PV=15-30kg Variable Viande
Djallonke FC (DJFOC) Brevipes HG≤ 55cm; PV=15-25kg Variable Viande
Djallonke FE (DJFOE) Brevipes HG≤ 55cm; PV=15-25kg Variable Viande
Djallonke Cotes (DJCOT) Brevipes HG≤ 55cm; PV=15-25kg Variable Viande
Sources: Douffissa (1983 et 1986), Yaya (1988), Lauvergne et al. (1993), Ngo Tama et al.
(1996), Planchenault et Boutonnet (1997) ; Meutchieye et al. (2008) et Choupamom
(2009)
Tableau 1 : Principales caractéristiques des écotypes caprins du Cameroun
17. 17
Matériels & Méthodes
Echantillonnage et collecte des tissus
Des poils et sang des chèvres adultes (males et femelles), non
apparentées étaient choisis au hasard dans des exploitations
Tableau 2 : Répartition des échantillons par période et écotypes
De l’ADN obtenu du sang de 21 chèvres locales (petite chèvre orientale
africaine = East African Small Goat)
19. 19
Matériels & Méthodes
Extraction de l’ADN génomique
Figure 10 : Schéma du protocole d’extraction de l’ADNg du sang séché de chèvre
(Sambrook et al., 1989)
20. 20
Matériels & Méthodes
Vérification de la qualité et normalisation l’ADN génomique
Figure 11 : Profil de teneur d’ADNg d’un extrait de sang de chèvre
OD260/OD280
21. 21
Matériels & Méthodes
Tab. 7 : Caractéristiques des microsatellites hétérologues utilisés (FAO, 2004b)
Choix des microsatellites hétérologues et homologues
25. 25
Matériels & Méthodes
Tableau 11 : Profil thermique d’amplification par PCR des échantillons
Figure 12 : Fragments amplifiés sur gel d’agarose 2%
26. 26
Matériels & Méthodes
Génotypage et analyses des fragments
Figure 13 : Electrophérogrammes mono et polymorphe du microsatellite INRA063
27. 27
Matériels & Méthodes
Choix de la séquence de la boucle D de l’ADNmt
Tableau 12: Caractéristiques des amorces de l’ADNmt (position 15711 à 16489)
Source: Sardina et al., (2006).
28. 28
Matériels & Méthodes
Tableau 13 : Composition du ready mix pour amplification de la séquence de boucle D de
l’ADNmt
Tableau 14 : Profil thermique de la PCR pour la boucle D de l’ADNmt
30. 30
Matériels & Méthodes
Figure 15 : Profil des fragments amplifiés sur gel d’agarose 1%
Génotypage et analyses des fragments
Et 83 accessions pour l’identification de la sequence consensus
Un total de 28 séquences caprines d’alignement disponibles de GenBank a été
considéré: 06 d’Afrique de l’est (Tanzanie) ; 06 d’Europe occidentale (Espagne, France,
Suisse et Italie) ;06 du Moyen Orient (Egypte, Iran et Turquie) ; 06 du sud-est asiatique
(Chine et Inde) ; 03 d’Asie centrale (Azerbaïdjan, Laos et Mongolie) ; 01 du Pacifique
(Australie).
31. 31
Matériels & Méthodes
Evaluation des indicateurs de diversité génétique
Diversité génétique intra population
Protocole de Peakall et Smouse (2009) sous GenAlex 6.0. Les paramètres
considérés ont été les suivants :
- Nombre moyen d’allèles par locus
-Fréquence allélique: estimée selon (Nei, 1968).
- Déviation à l’Equilibre de Hardy Weinberg : estimée au seuil de 5%.
-Hétérozygotie et diversité de gène : estimations de Ho et de He
calculées selon Nei (1978).
-Taux de polymorphisme : directement estimé dans l’échantillon étudié.
- Coefficient de consanguinité FIS: mesure de l’écart des individus à l’état
hétérozygote dans la population.
32. 32
Matériels & Méthodes
Diversité génétique interpopulation
Protocole de Peakall et Smouse (2012) sous GenAlex 6.5.
- Nombre d’allèles privés : mesure de la richesse allélique spécifique ;
- F statistiques de Wright : indices de fixation (FIS), de différenciation (FST)
et de consanguinité globale (FIT).
- Corrélations croisées des FST : estiment l’identité et la divergence des
écotypes ont été calculées sous Arlequin et sous GenAlex 6.5
- Flux de genes (Nm) : mesure la différenciation génétique au sein de la
population globale sous l’effet des migrants effectifs par génération.
- Index de Shannon (sHa): mesure de la richesse globale de la population.
- Contenu de l’Information Polymorphique (PIC): estimé des fréquences
alléliques des sujets distants de chaque écotype.
- Distances génétiques et relations: construction du dendrogramme
Neighbour Joining (NJ) a été faite sous PowerMarker V.3.25 selon Liu et
Mouse (2005) pour estimer les distances génétiques Ds de Nei entre des
paires d’écotypes de chèvres sur la base des marqueurs microsatellites.
33. 33
Diversité génétique interpopulation (suite)
- Analyse par Composantes Principales (ACP): Composantes Principales
estimées obtenues avec les programmes PowerMarker V.3.25 et Darwin
3.0.
- Edition et la correction du brin inverse des fragments amplifiés de
l’ADNmt : faites sous Chromas Lite. Alignement et estimation des
Mutations effectués sous Clustal X.2 et ATGC PhySic Online.
- Séquence consensus : mise en évidence sous DNAsp et MEGA5 sur la
base des séquences tirées du GenBank.
- Haplogroupes et Haplotypes : déterminés ainsi que leur paramètres
associés (nombre, diversité et clades) sous les programmes MEGA5,
DNAsp, NetWork 4.6.0.0 sur la base des séquences de référence boucle D
de l’ADNmt de chèvres dans la base GenBank selon la procédure de Naderi
et al. (2007) et Vacca et al. (2010).
- Arborescence phylogénétique (variabilité des clades) : construite sous les
programmes MEGA5, FigTree et SplisTree).
34. 34
Analyses statistiques
Les différents indices ont été calculés sous le logiciel Arlequin 3.5.1.3 pour
des niveaux de signification obtenus à 10.000 permutations (Schneider et
al., 1997).
Le test de sphéricité de Barlett a été utilisé pour évaluer la nullité de
l’hypothèse des corrélations croisées entre indices (Tanagra, 2012).
Le modèle statistique du PIC est le suivant:
L’Analyse de la Variance Moléculaire (AMOVA) estimée en utilisant les
procédures décrites par Weir et Cockerham (1984), Excoffier et al. (1992)
et Weir (1996) sous GenAlex 6.0 et Arlequin 3.5.1.3.
L’estimation du niveau dilution (admixture) de la population caprine a été
faite selon l’approche Pritchard et al. (2000), et Falush et al. (2003 et
2007). L’algorithme utilisé était Bayesien.
Matériels & Méthodes
35. 35
Analyses statistiques
Les différents indices ont été calculés sous le logiciel Arlequin 3.5.1.3 pour
des niveaux de signification obtenus à 10.000 permutations (Schneider et
al., 1997).
Le test de sphéricité de Barlett a été utilisé pour évaluer la nullité de
l’hypothèse des corrélations croisées entre indices (Tanagra, 2012).
Le modèle statistique du PIC est le suivant:
L’Analyse de la Variance Moléculaire (AMOVA) estimée en utilisant les
procédures décrites par Weir et Cockerham (1984), Excoffier et al. (1992)
et Weir (1996) sous GenAlex 6.0 et Arlequin 3.5.1.3.
L’estimation du niveau dilution (admixture) de la population caprine a été
faite selon l’approche Pritchard et al. (2000), et Falush et al. (2003 et
2007). L’algorithme utilisé était Bayesien.
Matériels & Méthodes
36. 36
Résultats & Discussions
R1: Biodiversité génétique des écotypes caprins à partir des
microsatellites hétérologues
• Nombre d’allèles: 0 à 6 pour l’ensemble des écotypes avec une de 2 (1,833
pour l’écotype DJCOT à 2,833 pour l’écotype CHKRD). L’écotype DJFOE est le plus
monomorphique.
• Taux d’hétérozygoties : Ho et He plus élevés pour l’écotype DJHSG (0,825) =>
taux de consanguinité plus faible, donc un système de reproduction plus contrôlé.
• Index de fixation (F) : DJFOE présente un excès d’homozygotie = forte
situation de consanguinité par rapport à une population panmictique alors que les
autres écotypes présentent plutôt un excès d’heterozygotie
De manière générale, une riche biodiversité génétique caractérise la très
grande majorité des écotypes considérés (82,5%).
40. 40
Résultats & Discussions
Tableau 18 : Fréquence des allèles privés en fonction des écotypes
7 marqueurs pour 10 alleles privés dont 3 pour DJHTNW
41. 41
Résultats & Discussions
DJHSG
DJFOE
DJHTO
CHSHL
DJHTNW
CHKRD
DJCOT
DJFOC
Coord.2
Coord. 1
CHSHL = Chèvre Sahélienne ; CHKRD= Chèvre Kirdi ; DJHSG= Chèvre Djallonké des Hautes savanes guinéennes;
DJHTOU= Chèvre Djallonké des Hautes terres de l’Ouest ; DJHTNW= Chèvre Djallonké des Hautes terres du Nord-
Ouest; DJFOC= Chèvre Djallonké de la Forêt-Centre ; DJFOE= Chèvre Djallonké Forêt-Est ; DJCOT = Chèvre
Djallonké de la région côtière
Figure 16 : Analyse par Coordonnées Principales des écotypes caprins du Cameroun
42. 42
Résultats & Discussions
CHSHL = Chèvre Sahélienne ; CHKRD= Chèvre Kirdi ; DJHSG= Chèvre Djallonké des Hautes savanes guinéennes;
DJHTOU= Chèvre Djallonké des Hautes terres de l’Ouest ; DJHTNW= Chèvre Djallonké des Hautes terres du Nord-
Ouest; DJFOC= Chèvre Djallonké de la Forêt-Centre ; DJFOE= Chèvre Djallonké Forêt-Est ; DJCOT = Chèvre
Djallonké de la région côtière
Figure 17 :Structure des populations caprines du Cameroun
43. 43
Résultats & Discussions
CHSHL = Chèvre Sahélienne ; CHKRD= Chèvre Kirdi ; DJHSG= Chèvre Djallonké des Hautes savanes guinéennes; DJHTOU=
Chèvre Djallonké des Hautes terres de l’Ouest ; DJHTNW= Chèvre Djallonké des Hautes terres du Nord-Ouest; DJFOC= Chèvre
Djallonké de la Forêt-Centre ; DJFOE= Chèvre Djallonké Forêt-Est ; DJCOT = Chèvre Djallonké de la région côtière
Figure 18: Relations phylogénétiques entre les écotypes caprins du Cameroun
44. 44
Résultats & Discussions
R2: Biodiversité génétique des écotypes caprins à partir des microsatellites
homologues
- Nombre d’allèles : 1 à 10 pour l’ensemble des écotypes. Jusqu'à 11
pour les types génétiques CHKRD et EASG. C’est l’écotype DJFOE qui a
été le plus monomorphique
- Taux d’hétérozygoties : Ho et He varient de 0,052 (écotype DJFOE)
à 0,550 (écotype CHSHL), et 0,232 (écotype DJFOE) à 0,644 (écotype
CHSHL). EASG a la variabilité génétique la plus importante avec Ho =
0,665 et He = 0,706.
- Index de fixation (F): variable. L’écotype DJFOE présente une très
forte situation de consanguinité (F = -0,48).
La très grande majorité des écotypes considérés (83%) résentent
une riche très biodiversité génétique.
47. 47
Résultats & Discussions
•EASG = East African Small Goat ; CHSHL = Chèvre Sahélienne ; CHKRD= Chèvre Kirdi ; DJHSG= Chèvre Djallonké des Hautes savanes guinéennes;
DJHTOU= Chèvre Djallonké des Hautes terres de l’Ouest ; DJHTNW= Chèvre Djallonké des Hautes terres du Nord-Ouest; DJFOC= Chèvre Djallonké de
la Forêt-Centre ; DJFOE= Chèvre Djallonké Forêt-Est ; DJCOT = Chèvre Djallonké de la région côtière * P<0,05 ; ** P<0,01 ; *** P<0,001
Tableau 21 : Tests de probabilités de l’équilibre de Hardy Weinberg par marqueur
et en fonction de l’écotype
48. 48
Résultats & Discussions
Tableau 22: Fréquence des allèles privés en fonction de l’écotype
11 marqueurs pour 23 alleles privés dont 9 pour EASG
49. 49
Résultats & Discussions
Entre Ecotypes
6%
Entre Indiv
45%
Intra Indiv
49%
Pourcentages de la Variance Moleculaire
Figure 19 : Représentation graphique de l’AMOVA des caprins du Cameroun
50. 50
Résultats & Discussions
EASG
DJFOC DJFOE
CHKRD
DJCOT
DJHSG
DJHTNW
DJHTO
CHSHL
Coord.2
Coord. 1
EASG = East African Small Goat ; CHSHL = Chèvre Sahélienne ; CHKRD= Chèvre Kirdi ; DJHSG= Chèvre
Djallonké des Hautes savanes guinéennes; DJHTOU= Chèvre Djallonké des Hautes terres de l’Ouest ;
DJHTNW= Chèvre Djallonké des Hautes terres du Nord-Ouest; DJFOC= Chèvre Djallonké de la Forêt-Centre ;
DJFOE= Chèvre Djallonké Forêt-Est ; DJCOT = Chèvre Djallonké de la région côtière
Figure 20: Analyses par Coordonnées Principales des écotypes caprins
51. 51
Résultats & Discussions
EASG = East African Small Goat ; CHSHL = Chèvre Sahélienne ; CHKRD= Chèvre Kirdi ; DJHSG= Chèvre Djallonké des Hautes savanes guinéennes;
DJHTOU= Chèvre Djallonké des Hautes terres de l’Ouest ; DJHTNW= Chèvre Djallonké des Hautes terres du Nord-Ouest; DJFOC= Chèvre
Djallonké de la Forêt-Centre ; DJFOE= Chèvre Djallonké Forêt-Est ; DJCOT = Chèvre Djallonké de la région côtière
Figure 21 : Structure des populations caprines du Cameroun par des microsatellites
homologues
52. 52
Résultats & Discussions
EASG = East African Small Goat ; CHSHL = Chèvre Sahélienne ; CHKRD= Chèvre Kirdi ; DJHSG= Chèvre Djallonké
des Hautes savanes guinéennes; DJHTOU= Chèvre Djallonké des Hautes terres de l’Ouest ; DJHTNW= Chèvre
Djallonké des Hautes terres du Nord-Ouest; DJFOC= Chèvre Djallonké de la Forêt-Centre ; DJFOE= Chèvre
Djallonké Forêt-Est ; DJCOT = Chèvre Djallonké de la région côtière
Figure 22: Interrelations estimées entre les écotypes de chèvres du Cameroun
53. 53
Résultats & Discussions
R3 : Biodiversité génétique des écotypes caprins à partir de l’ADNmt
Figure 23 : Vue partielle de l’alignement des séquences de la position 309 à 659
54. 54
Résultats & Discussions
Tableau 23 : Taux moyen de substitution des nucléotides de l’ADNmt des caprins
en fonction de différents modèles
58. 58
Résultats & Discussions
R4 : Efficacité comparée des méthodes d’évaluation de diversité moléculaire
caprine
Les microsatellites homologues plus polymorphes que les
microsatellites hétérologues (4 regroupements possibles).
L’analyse de l’ADNmt a fait ressortir 5 clades, et uniquement en
rapport avec la diversité des origines maternelles.
En considérant les relations phylogénétiques, il apparaît que ce
sont les microsatellites homologues qui donnent des résultats
les plus vraisemblables au regard de la répartition
géographique des écotypes.
59. 59
Résultats & Discussions
Les microsatellites ont permis l’identification des allèles privés
(plus important pour le jeu de microsatellites homologues)
L’analyse de l’ADNmt a été un outil complémentaire, notamment
la formation des clades sur la base des fréquences de mutations
et d’évolution minimum enregistrés.
Le matériel génétique de base dans cette étude a été
chromosomique (microsatellites) et mitochondrial (ADNmt).
Pris individuellement, l’effectivité de l’évaluation de la diversité
n’a pas été uniforme comme il apparaît selon les méthodes, aussi
bien, sur le plan intra qu’inter-population.
60. 60
Conclusion
Les écotypes de chèvres du Cameroun ont une importante
diversité génétique, intra et inter écotypes.
Elles constituent une part spéciale dans la biodiversité
animale mondiale. Cette richesse génétique est le pilier de la
création des races, de leur amélioration en vue d’une bonne
exploitation et encore mieux de leur préservation.
Le polymorphisme relatif des microsatellites homologues
indiquent une meilleure aptitude de ce dernier groupe pour
des analyses de diversité plus élargies.
61. 61
Conclusion
L’existence des allèles privés au sein des écotypes constitue un
atout majeur dans l’évaluation de l’adaptation des chèvres.
Les perturbations de l’Equilibre de Hardy Weinberg ont eu
pour facteurs le flux de gènes et la dilution par croisements
hasardeux entre écotypes.
Le flux de gènes bien que source de variation génétique, il
aboutira à l’uniformisation génotypique et donc à une
sérieuse perte de biodiversité s’il est constant.
62. 62
Conclusion
Les 8 écotypes caprins considérés sont distincts
génétiquement, formant 4 groupes (certains se comportant
comme des hybrides entre types extrêmes).
Le peuplement caprin du Cameroun des origines maternelles
multiples et est du plus grand Haplogroupe A.
Le niveau de diversité des haplotypes des écotypes est élevé.
L’étude met en évidence la richesse génétique des écotypes
caprins du Cameroun et leurs interrelations.
63. 63
Recommandations et perspectives
Recommandations :
Utilisation des poils et adaptations des méthodes pour des
analyses moléculaires du bétail pour des raisons économiques;
L’application préférentielle du panel microsatellites
homologues;
Documentation/information publique sur les types
génétiques caprins du Cameroun;
Développement d’un plan d’amélioration des caprins du
Cameroun et appui aux initiatives actuelles (Stations
spécialisées et groupements)
64. 64
Recommandations et perspectives
Perspectives :
L’étude du polymorphisme de l’ADNmt pourrait être complétée
par l’analyse de la séquence SRYM18 transmise uniquement par
les mâles à la descendance chez les caprins du Cameroun.
L’analyse métagénomique permettrait d’associer les mutations
et délétions identifiées aux phénotypes spécifiques des
écotypes caprins du Cameroun.
Le polymorphisme du nucléotide monocaténaire (Single
nucleotide polymorphisms -SNPs) pourrait être appliqué dans
des investigations futures.
Enfin, cette investigation pourrait être étendue aux pays
limitrophes avec qui il y a échanges du matériel génétique