1. Presented by:
DR. PAMPI GHOSH
18/01/2022
Assistant Professor & Head,
Department of Botany,
Seva Bharati Mahavidyalaya, Kapgari, Jhargram, West
Bengal
Email: pampikapgari@gmail.com
SEM –UG-CBCS- BOTANY (Gen.)
Vidyasagar University, Midnapore, W.B.
GE3P: Economic Botany and Plant Biotechnology
Unit 10 Recombinant DNA Techniques:
(Blotting techniques: Northern, Southern and Western Blotting, DNA Fingerprinting;
Molecular DNA markers i.e. RAPD, RFLP, SNPs; DNA sequencing, PCR and Reverse
Transcriptase-PCR. Hybridoma and monoclonal antibodies, ELISA and Immuno
detection. Molecular diagnosis of human disease, Human gene Therapy.)
Lecture-10
Link:
2. GE3P: Economic Botany and Plant Biotechnology
Unit 10 Recombinant DNA Techniques:
Blotting techniques: Northern, Southern and Western Blotting,
DNA Fingerprinting;
Molecular DNA markers i.e. RAPD, RFLP, SNPs; DNA sequencing,
PCR and Reverse Transcriptase-PCR.
Hybridoma and monoclonal antibodies,
ELISA and Immuno detection.
Molecular diagnosis of human disease,
Human gene Therapy.
3. ব্লটিং
• ব্লটিং, মলিলিউিার biology এবিং জেনেটনে, জরাটে, লিএেএ বা
আরএেএনি িযালরযানর স্থাোন্তর িরার এিট পদ্ধলি (উদাহরণস্বরূপ,
এিট োইনরানেিুনিাে, পলিলিলেিাইলিে জলারাইি বা োইিে
লিলি)।
অনেি জেনে, এট এিট জেি ইনিনরান ারলেনের পনর িরা হয, জেি
জেনি অণুগুলিনি ব্লটিং জমমনেনে স্থাোন্তর িরা হয এবিং অনেি। েময
েমুোগুলি েরােলর লিলিনি যুক্ত িরা হয। ব্লটিং িরার পনর,
স্থাোন্তলরি জরাটে, লিএেএ বা আরএেএনি জদখা েম্ভব হয colourant
stain দ্বারা (উদাহরণস্বরূপ, ইলেলিযাম জোমাইি, লিস্টাি িানযানিট,
ো রাোইে এবিং অেলমযাম জটনরাোইি ইিযালদ বা জরাটনের silver
staining), জরলিওনিনবিযুক্ত অণুর অনটানরলিওগ্রাল ি লিেুযযািাইনেশে
দ্বারা (ব্লট িরার আনে েম্পালদি), বা লিছু জরাটে বা লেউলিি
অযালেনির লেলদিষ্ট জিনবলিিংনযর মাধ্যনম ।
10. রিারনিদ
• ব্লটিং এর রিারনিদ
মূিি 3 ধ্রনণর ব্লটিং রনযনছ:
1) দলেণ ব্লটিং (Southern blotting)
2) উত্তর ব্লটিং (Northern blotting)
3) ওনযস্টােি ব্লটিং (Western blotting)
11. োউদােি ব্লটিং
• োউদােি ব্লটিং এর োমিরণ িরা হনযনছ এিওযাি
ি এম োউদানেির (Edward M. Southern) োনম। এই
পদ্ধলিট DNA িম লবনেষনণর েেয বযবহৃি হয।
এখানে লেম্নলিলখি পদনেপগুলি জেওযা হয :
• রেমি, বড় ওেেযুক্ত লিএেএ েীমাবদ্ধিা এনডালেউলিে (Restriction endonucleases)
বযবহার িনর জছাট জছাট টু িনরা টু িনরা িরা হয।
• িারপনর, এই টু িনরাগুলি আিাদা িরার েেয জেি ইনিনরান ানরলেে িরা হয যানি িারা িানদর
আিার অেুোনর আিাদা হনি পানর।
• যলদ লিএেএ খণ্ডগুলি আিানর অনেি বড় হয, িাহনি রেনম জেিটনি HCl লদনয treat িরা উলিি, যা
লিএেএ টু িনরাগুলির লবশুদ্ধিা ঘটায।
• এই টু িনরাগুলিনি আিাদা িরার পনর, আিাদা িরা জেনির উপনর এিট োইনরানেিুনিাে শীট রাখা
হয। লিলির উপর িাপ রনযাে িরা হয যানি এই দুটর মনধ্য েঠিি লমেলিযা ঘটনি পানর।
• এর পনর লিলিট অলিনবগুেী লবলিরনণর েিংস্পনশি রাখা হয যানি টু িনরাগুলি স্থাযীিানব লিলির োনে
েিংযুক্ত হনি পানর।
• িারপর লিলি হাইলেিাইনেশে জরানবর েিংস্পনশি আে হয । লিন্তু লিএেএ জরাবনি জিনবি িরা হয
যানি এট েহনেই েোক্ত িরা যায , যখে অণুটনি এিট জিানমানেলেি িাই (Chromogenic
dye) লদনয টযাে িরা হয।
• হাইলেিাইনেশে রলিযার পনর, এেএেলে( SSC buffer) বা ার বযবহার িনর অলিলরক্ত জরাব ধ্ুনয জ িা
হয এবিং এট অনটানরলিওগ্রাল র োহানযয এে-জর ল নে লিেুযযািাইে িরা যায।
12. োউদােি ব্লটিং এর অযালিনিশে:
i) এট RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) মযালপিং োমি জিৌশনি
বযবহৃি হয।
ii) াইনিানেনেটি লবনেষনণও বযবহৃি হয।
iii) লেনের পুেলবিেযাে শোক্ত িরার েেয বযবহার িরা হয।
13. েেিােি ব্লটিং (Northern blotting):
উত্তর ব্লটিং োমট অযািওযাইে (Alwine) রেম বযবহার িনরে।
এই পদ্ধলিট এিট েমুোয আরএেএ লবনেষণ এবিং েোক্ত িরনি
বযবহৃি হয।
এখানে লেম্নলিলখি পদনেপগুলি জেওযা হয:
• রেমি, জিাষ জেনি এমআরএেএ (mRNA) জি আিাদা িনর
লবশুদ্ধ িরনি হনব।
• RNA জি পৃেি িরার েেয লিোিালরিং এনেন্ট লহোনব
মিািলিহাইি যুক্ত অযাোনরাে জেি বযবহার িরা হয ।
14. েেিােি ব্লটিং
• এই জেিট লিলপউলরনেশে বা ানর 5-
10 লমলেনটর েেয িু লবনয রাখা হয
এবিং েি লদনয ধ্ুনয জ িা হয।
• িারপনর এই আরএেএ খণ্ডগুলিনি
িযালরযার জমমনেনে অেিাৎ অযালমনো -
জবেোইি - অলেলমোইি ল ল্টার
জপপানর স্থাোন্তলরি িরা হয।
• আরএেএ স্থাোন্তর িরার পনর, এট
UV বা িাপ বযবহার িনর লিলিনি (
membrane ) লস্থর িরা হয।
• হাইলেিাইনেশনের েেয লিএেএ
জিনবিযুক্ত জরাব জযাে িরা হয ।
• আেবাউড জরাব ধ্ুনয জ নি জশনষ
এমআরএেএ-লিএেএ হাইলেি জি এে-
জর ল ে দ্বারা েোক্ত িরা হয।
15. েেিােি ব্লটিং এর অযালিনিশে:
• Applications:
i) উত্তর ব্লটিং এিট েিংনবদেশীি পরীো লহোনব
বযবহৃি হয লিএেএ খণ্ডগুলির রলিলিলপ
েোক্তিরনণর েেয যা দলেণ ব্লটিং-এ এিট
জরাব লহোনব বযবহার িরা হয।
ii) এট লবলিন্ন টেুয এবিং লবলিন্ন েীবন্ত রাণী
জেনি লেলদিষ্ট এমআরএেএ (m RNA)েোক্তিরণ
এবিং পলরমাণ লেধ্িারনণর অেুমলি জদয।
16. ওনযস্টােি ব্লটিং (Western blotting)
• ওনযস্টােি ব্লটিং (Western blotting) ওনযস্টােি ব্লটিং এর োমিরণ িরা
হনযনছ িলব্লউ লেি বানেিনটর (W. Neal Burnette) োনম। এই পদ্ধলিট এিট
রদত্ত েমুোয জরাটে েোক্তিরণ এবিং লবনেষনণর েেয বযবহৃি হয।
18. ওনযস্টােি ব্লটিং পদনেপগুলি
• এখানে লেম্নলিলখি পদনেপগুলি জেওযা হয :
• রেমি, লবনশষ েমুো জেনি জরাটে লবলিন্ন িরা হয জেি electrophoresis পপদ্ধলিনি।
• এর পনর জরাটে োেনপেশনে লবটা-মারিাপনটানেেি ( beta- mercaptoethanol (BME) লবএমই)
এবিং জোলিযাম জিানিলেি োিন ট ( Sodium dodecyl Sulfate (SDS) এেলিএে) জযাে িরা হয।
• িারপর, জরাটে-এেলিএে িমনিেট জেনির কূনপর উপনর স্থাপে িরা হয। অেযােয জরাটনের
আণলবি ওেে লেধ্িারনণর েেয এিট আণলবি ওেে লিলিিিারীও (molecular weight marker)
এিট কূনপ জিাি িরা হয। এর পনর জেনির অবলশষ্ট কূনপ েমুো জযাে িরা হয।
• এিবার েমুো এবিং মািি ার জিাি হনয জেনি জেি এর মনধ্য লদনয িানরন্ট িািো ির হয ।নরাটে
কূনপর ধ্োত্মি জমরুনি েমে িনর িারণ এট শক্তিানব SDS এর োনে আবদ্ধ োনি যা
জেলিবািিিানব (negatively) িাে
ি িরা হয। জরাটনের িিািি িার আিানরর লবপরীিিানব
েমােুপালিি (inversely proportional)।
•.এই ধ্ানপর পনর, জেিট এিট লিলির উপর স্থাপে িরা হয এবিং জেি েুনড় িানরন্ট জররণ িরা
হয যানি েমস্ত জরাটে লিলিনি স্থাোন্তলরি হয।
• িারপর ইলমউনোব্লটিং িরনি হয। এই পদ্ধলিনি, রেনম অ-লেলদিষ্ট জরাটে এর েনে লিলি জি
বদ্ধ িরা হয যানি অযালন্টবলি লিলির োনে আবদ্ধ হনি ো পানর জযখানে জরাটে বিি মাে জেই।
• িারপর রােলমি অযালন্টবলি দ্রবনণ জযাে িরা হয। এই অযালন্টবলিগুলি এিট লেলদিষ্ট অযালমনো-
অযালেি িম েোক্ত িরনি েেম । িারপর আে-বাউড রােলমি অযালন্টবলি অপোরণ ও
জেনিডালর অযালন্টবলি জযাে িরনি এট ধ্ুনয লেনি হনব।
• এখে এই অযালন্টবলিগুলি এিট এেোইনমর োনে েিংযুক্ত হয এবিং রােলমি অযালন্টবলি লিেনি েেম
হয । েবনশনষ, আেবাউড জেনিডালর অযালন্টবলি অপোরনণর েেয আনরি বার জধ্াযা হয।
• এখানে, জিলমিুলমনেনেন্ট োবনেট জরাটে েোক্তিরনণর েেয বযবহৃি হয। োবনেট জযাে িরার
পনর আনিা লেেিি হনি জদনখ এবিং ল ে ইনমোর লদনয জরাটেনি েোক্ত িরা জযনি পানর।
19. • ওনযস্টােি ব্লটিং এর অযালিনিশে:
i) লিলেিাি উনেনশয বযবহৃি এই ওনযস্টােি ব্ললটিং বযবহৃি হয ।
ii) িম পলরমানণ লেলদিষ্ট জরাটে েোক্ত িরনি বযবহৃি হয।
iii) এিট লেে উত্পদনে০ পলরমাণ লেধ্িারণ িরনি বযবহৃি হয।
20. উপেিংহার
• উপেিংহার
লবলিন্ন ধ্রনণর মযানিানমালিলিউি েোক্ত িরনি
লবলিন্ন ব্লটিং বযবহার িরা হয জযমে দলেণী
ব্লটিং বযবহার িরা হয লিএেএ লবনেষনণর েেয,
ওনযস্টােি ব্লটিং জরাটে লবনেষনণর েেয, উত্তর
ব্লটিংট আরএেএ লবনেষনণর েেয।
21. পােিিয: োউদােি ব্লটিং / েেিাে ব্লটিং / ওনযস্টােি ব্লটিং
সাউদার্ন ব্লটিং র্র্নার্ ব্লটিং ওনযস্টােি ব্লটিং
লিএেএর লেলদিষ্ট িম েোক্তিরনণর
েেয এিট রলিযা I
RNA এর লেলদিষ্ট িম েোক্ত িরার েেয
এিট পদ্ধলি যা পলরপূরি DNA (cDNA) এর
লেলদিষ্ট অেুিনমর েিংিরাযে দ্বারা েম্পন্ন হয
।
এিট ব্লটিং পদ্ধলি যা জরাটনের
লেলদিষ্ট অযালমনো অযালেি িম েোক্ত
িরনি বযবহৃি হয I
1975 োনি এিওযাি
ি এম োউদােি
দ্বারা আলবষ্কৃি I
1979 োনি Alwine এবিং িার েহিমীরা
দ্বারা আলবষ্কৃি।
1981 োনি িলব্লউ লেি বানেিনটর (W.
Neal Burnette) দ্বারা আলবষ্কৃি
হয I
লেলদিষ্ট লি এেএ িম েোক্ত িরনে
বযবহৃি হয I
লেলদিষ্ট আরএেএ িম েোক্ত িরনে বযবহৃি
হয
লেলদিষ্ট জরাটে েোক্ত িরনি বযবহৃি
হয I
পলিযার েনে অযাোনরাে জেি /
পলিঅিীিামইি জেি ( Agarose
gel / polyacrylamide gel )
ইনিনরান ানরলেে েলড়ি I
Denatured মিািলিহাইি অযাোনরাে জেি
পলিযার েনে েলড়ি
SDS - PAGE েলড়ি I
কিলশি স্থাোন্তর েলড়ি I কিলশি স্থাোন্তর েলড়ি কবদুযলিি স্থাোন্তর েলড়ি I
লিএেএ জরাব বযবহৃি হয I লে লিএেএ ( c DNA) জরাব বযবহৃি হয I রােলমি এবিং মাধ্যলমি অযালন্টবলি
বযবহার হয জরাব লহনেনব।
লেলদিষ্ট লেে লেনিানযন্স এবিং লিএেএ
ল োরলরলন্টিং েোক্ত িরনি এই
কেবরযুলক্ত বযবহৃি হয।
লেে এেনরশে লবনেষনণ বযবহৃি হয জরাে লেণিনযর েেয বযবহৃি হয I
