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Identificación de staphylococcus aureus y staphylococcus coagulasa negativa en un caso de otitis externa en canino (2)

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Identificación de staphylococcus aureus y staphylococcus coagulasa negativa en un caso de otitis externa en canino (2)

  1. 1. Identificación de Staphylococcus aureusy Staphylococcus coagulasa-negativa en un caso de Otitis Externa en canino C.Cabrera1, K. Jiménez1, C. Noriega1, X. Olivares1 1 Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Pedro de Valdivia, La Serena, Chile. RESUMEN: La otitis externa es causada comúnmente por infecciones de la flora bacteriana normal cuando se sobrepasan las barras de defensa. A partir de un canino de 10 años con episodios intermitentes de OE, se realiza una toma de muestras, siembra, aislamiento para poder identificar el agente patógeno implicado. Se realizó tinción de Gram y se aplicaron las siguientes pruebas bioquímicas: Catalasa, O-F, Coagulasa, Voges Proskauer, Oxidasa, Antibiograma. El análisis revela la presencia de Staphylococcus aureus y Staphylococcus coagulasanegativa en la muestra. PALABRAS CLAVE: Staphylococcus aureus, Staphylococcus coagulasa-negativa, Otitis Externa, Canino. ABSTRACT: The External Otitis is commonly caused by infection of normal bacterial flora when exceed the defend barrier. From a 10 years dog, with constant episodes of OE, we take a simple sowing isolation of pathogen agent involved. Gram staining was performed and applied the following biochemical test: Catalase, O-F, Coagulase, Voges Proskauer, Oxidase, Antibiogram. The analysis reveals the presence of Staphylococcus aureus and Coagulase-negative Staphylococcus in the sampling. KEY WORDS: Staphylococcus aureus, Coagulasenegative Staphylococcus, Otitis Externa, Canid. Introducción La Otitis Externa (OE), comúnmente conocida como “infección del oído”, es una condición caracterizada por inflamación del canal exterior. Las infecciones de oído representan una de las principales razones por la que los perros se presentan al veterinario, y puede afectar alrededor del 20% de ellos (Carlotti, 1991 c.p. Lozina, 2010). Es una de las enfermedades más comunes que afectan perros de diferente género, edad y raza. Se ha observado que los machos son más susceptibles a la OE que las hembras. (Lozina et al, 2010). Al igual que toda la piel, el conducto auditivo externo tiene una flora bacteriana normal y permanece libre de la infección si no se interrumpen sus defensas. Cuando se produce la interrupción, esta flora patógena (antes normal) se desarrolla (Sander, 2001). Las formas de otitis externa según Pérez (1995) normalmente son de origen bacteriano, siendo los gérmenes patógenos más comúnmente observados Pseudomonas, Staphylococcus y Proteus. Sin embargo, puede encontrarse hongos como aspergillus y cándida. Los factores ambientales como altas temperaturas y humedad pueden influenciar la incidencia de OE en perros (Carlotti, 1991).
  2. 2. Lozina en su experiencia en 2010 encontró que los microorganismos más frecuentes aislados en medios de cultivo fueron: Malassezia pachydermatis (54.2%), Staphylococcus aureus (43.8%), Staphylococcus coagulasa-negativa (25.0%), Pseudomonas aeruginosa (20.8%), Candida albicans (18.8%), Proteus mirabilis (16.7%), Streptococcus spp. (16.7%), Enteroccocus faecalis (12.5%), Escherichia coli (12.5%), Staphylococcus intermedius (6.3%), Klebsiella spp. (4.2%), y Candida glabrata (2.1%). Aunque la flora microbiana de la oreja de perros se ha estudiado y algunos autores intentado correlacionar los signos de la enfermedad con un agente etiológico, la identificación en laboratorio del agente es generalmente aceptada (Kowalski, 1988 c.p. Silva, 2001). A partir de un canino de 10 años de edad que presenta cuadros intermitentes de OE caracterizada por eritema y descamación del pabellón auricular sin exudado y rascado frecuente de la oreja, se extrajeron muestras para realizar siembra, aislamiento e identificación bacteriana. Material y método Se realizó la toma de muestras con dos tórulas estériles desde el pabellón auricular enrojecido de un can de 10 años (Figura 1) que ha presentado en el pasado episodios de otitis. Las tórulas fueron colocadas en Medio de Transporte AMIES sin/con carbón activado (para G -) y Cary Blair (G+). Estos medios semisólidos tienen un ph regulado y son esencialmente una mezcla de sustancias tamponadas que carecen de factores de crecimiento. Alrededor de 4 hrs más tarde, se realizó una siembra desde Cary Bair en estría en Agar Triptona y Soja (TSA), y desde AMIES en TSA y Agar McConkey (MCK). Figura 1: Toma de muestra desde pabellón y conducto externo de canino 24 hrs más tarde, se evidenció crecimiento sólo de la siembra realizada desde Cary Blair, Presumiendo la presencia de bacterias gram positivas, se realiza una siembra por agotamiento en Agar Sangre (AS) para aislar la bacteria. Después de 24 hrs de incubación, se realizó tinción de Gram (Cristal Violeta 1’, Lugol 1’, Alcohol-acetona 5”, Safranina 30”) desde el medio AS. Se visualizó la muestra en microscopio, determinándose la presencia de Staphylococcus. Luego, de acuerdo a las instrucciones del Manual de
  3. 3. Microbiología de Medicina Veterinaria, se realizaron las siguientes pruebas bioquímicas de resultados inmediatos: Catalasa, Coagulasa; y OF. 24 hrs más tarde, se recopilaron los resultados de las pruebas realizadas el dia anterior. Luego, se procedió a la realización de Antibiograma a través del Método de Kirby-Bauer, realizándose para esto una siembra en Müller Hinton Broth (MHB) con una concentración de bacterias según estándar 0,5 Mac Farland. Seguidamente, se realizó un césped microbiano desde MHB con una tórula. Luego, se procedió a colocar los sensidiscos con correspondientes a los antibióticos Novobiocina (NO5) y Bacitracina (B10). También se realizó la prueba de la Ureasa. Los resultados se recopilaron 24 hrs más tarde (Tabla 1) y se realizó resiembra en AS. 72 hrs más tarde, ante la presunción de contaminación, se realizó nuevamente siembra por aislamiento en AS. 24 hrs después, a partir de una colonia aislada en AS, se realizó tinción de Gram, prueba de la Ureasa y Antibiograma con Novobiocina (NO5), Bacitracina (B10) y Vancomicina (VA30). Finalmente, se realizó cultivo en RMVP y 72 hrs después se realizó la prueba de Voges Proskauer. Resultados Después del aislamiento de la bacteria en medio AS, la observación de la muestra en microscopio teñida con Gram reveló bacterias azules de forma esférica, agrupadas en racimo, y algunas agrupadas como diplococos (Figura 2). El crecimiento de éstas en AS fue en forma de colonias esféricas que presentaron β-hemolisis, que con el pasar de los días se hacía más notoria y se pigmentaba de color amarillo (Figura 3). Figura 2: Observación de la muestra con tinción de Gram al microscopio En cuanto a las pruebas bioquímicas, la se observó la formación inmediata de burbujas durante la prueba de la catalasa; óxidofermentación positiva en tubo abierto como el sellado con vaselina estéril, evidenciando la presencia de una bacteria anaerobia facultativa; Coagulasa negativa; Ureasa positiva débil (color anaranjado) luego de 24 hrs de incubación y positivo a las 48 hrs, (color magenta). El antibiograma arrojó halos de inhibición de 16 mm (S) y 10 mm (S) de diámetro para Novobiocina y Bacitracina respectivamente. Los resultados de estas pruebas bioquímicas se resumen en la “Tabla 1”.
  4. 4. Tabla 1: Resultados de Pruebas Bioquímicas n°1 Prueba Prueba de la Catalasa OxidoFermentación de la Glucosa Prueba de la Coagulasa Ureasa Figura 3: Observación de hemólisis en medio AS con 48 hrs de incubación Las segundas pruebas se realizaron presumiendo la no obtención de un cultivo aislado: la prueba de la OxidoFermentación arrojó como resultado negativa para ambos tubos; en la Coagulasa no se observó formación de coagulo propiamente tal, sin embargo, se observó cierta formación extraña; Ureasa negativa, evidenciada por la coloración amarilla del tubo. El Antibiograma arrojó halos de inhibición de 26 mm (S), 16 mm (S) y 17 mm (S) de diámetro para Novobiocina, Bacitracina y Vancomicina respectivamente. Los resultados de estas pruebas se resumen en la “Tabla 2”. Antibiograma Resultado Catalasa + ÓxidoFermentación positiva Coagulasa 24 hrs: Positivo débil 48 hrs: Positiva NO5: 16 mm B10: 10 mm
  5. 5. Tabla 2: Resultados de Pruebas Bioquímicas n°2 Prueba OxidoFermentación de la Glucosa Prueba de la Coagulasa Ureasa Antibiograma Resultado ÓxidoFermentación negativa Coagulasa 24 hrs: negativa 48 hrs: negativa NO5: 26 mm B10: 16 mm VA30: 17 mm Discusión Los cocos gram positivos son un grupo heterogéneo de bacterias. Las características que tienen en común son su forma esférica, su reacción a la tinción de Gram. requiere una disrupción de las barreras del huésped para penetrar. El cultivo rara vez produce falsos negativos en las infecciones por estafilococos. Ante cualquier caso de sospecha, se debe incluir el antibiograma para guiar el tratamiento si es necesario. Presenta colonias de 1 a 3 mm de diámetro, lisas, levemente elevadas, de bordes enteros, levemente convexas y generalmente pigmentadas con un color crema-amarillo. La producción de pigmento se ve favorecida si se incuban los cultivos por 24-48 hrs. adicionales a temperatura ambiente. S. epidermidis presenta colonias generalmente de menor tamaño y estas no presentan pigmentación. Si un aislamiento se identifica como una especie de estafilococo o se sospecha con firmeza que esa es su identidad, se realiza una prueba para determinar la producción de coagulasa a fin de diferenciar S. aureus de las otras especies que reciben el nombre colectivo de estafilococos coagulasanegativa o “no productores de coagulasa” (Forbes, 2009). Pottumarthy et. al. (2004) indica que Staphylococcus intermedius exhibe propiedades fenotípicas propias de S. aureus y S. epidermidis, “intermedias”. Es coagulasa-positivo y presenta βhemolisis. Descartamos la presencia de este estafilococo dado el resultado de la prueba de Vogues Proskauer que sirve para diferenciar S. aureus (positiva) de S. intermedius y S. hycus (negativo). El Staphylococus aureus es uno de los gérmenes que puede verse como agente etiológico de la OE. Su principal característica para identificación es ser coagulasa positivo y presentar β-hemólisis. Según Sardiñas y col. (2006), sólo es infeccioso cuando se encuentran en gran número y habitualmente Los papeles desempeñados por los diferentes microorganismos patógenos y saprófitos implicados en la otitis externa son claros (Silva, 2001). Sin embargo, hay pocos informes acerca de la importancia de los estafilococos coagulasa negativos en otitis y lesiones cutáneas caninas (Acosta et al., 1992 c.p. Silva, 2001).Los estafilococos
  6. 6. coagulasa negativos son las bacterias más comúnmente aisladas en los laboratorios microbiológicos. Entre ellos S. epidermidis, que se caracteriza por ser coagulasa negativo y Novobiocina sensible. Al ser un comensal habitual de la piel, la distinción entre infección y contaminación puede resultar en ocasiones difícil. Lilenbaum et al. (2000), c.p.Lozina (2010) reportan que los Staphylococcus coagulasa-negativos son las bacterias aisladas más comunes en exudados de oído de perros con OE, pero el can en observación no presentaba tal estadio avanzado de otitis. Presumimos que el resultado negativo para la prueba de la Coagulasa se debe a la contaminación del cultivo con algún Staphyloccoccus coagulasa-negativo. Esto se apoya con el resultado de los Antibiogramas, dado que S. epidermidis es sensible a la Novobiocina, en cambio S. aureus presenta resistencia para ésta, pero es sensible a la Bacitracina. Algunos estafilococos son ureasa positivos, incluidos S. epidermidis (coagulasa-negativo), S. intermedius y la mayoría de las cepas de S. saprophyticus (Winn et. al., 2008). celulitis, que se limitan a una pequeña área de la piel. Los estafilococos coagulasa negativos son un grupo de microorganismos frecuentes en la piel, causa de infecciones nosocomiales sobre todo en recién nacidos de bajo peso y pacientes inmunocomprometidos. La causa específica de la otitis externa puede determinarse por cultivo de material obtenido del conducto auditivo afectado; no obstante, debe tenerse en cuenta que la contaminación superficial y la flora cutánea normal pueden originar cultivos mixtos que son origen de confusión. Bibliografía Álvarez, H., Santanana, J., Castillo, L., García, E., & María, Á. (2010). Comportamiento de la otitis externa en pacientes diabéticos. AMC [online], 14(5), 0-0. Forbes, B., Sahm, D., & Weissfeld, A. (2009). Diagnóstico Microbiologico. Buenos Aires: Editorial Médica Panamericana. Conclusión Gorrotxategi, P., & Manterola, J. (2011). Otitis externa por Staphylococcus aureus resistente a meticilina en un lactante. Pediatria de Atención Primaria(13), 585-90. La presencia de S. aureus en cultivos es común. Pertenece a la flora nativa del cuerpo y eventualmente puede causar infecciones en la piel, como foliculitis, forúnculos, impétigo y Lozina, L., Peichoto, M., Boehringer, S., Koscinczuk, P., Granero, G., & Acosta, O. (2010). Efficacy of Argentine propolis formulation for topical treatment of canine otitis externa. Arquivo Brasileiro
  7. 7. de Medicina Veterinária e Zootecnia, 62(6), 1359-1366. Pottumarthy, S., Schapiro, J., Prentice, J., Houze, Y., Swanzy, S., Fang, F., y otros. (2004). Clinical Isolates of Staphylococcus intermedius Masquerading as Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Journal of Clinical Microbiology, 42(12), 58815884. Sander, R. (2011). Otitis Externa: A practical Guide to Treatment and Prevention. Am Fam Physician(63), 927-936,941-942. Venkatesh, M., Placencia, F., & Weisman, L. (2006). Coagulasenegative Staphylococcal Infections in the Neonate and Child: An UpdateSeminars in Pediatric Infections Diseases(17), 120-127. Winn, W., Allen, S., Janda, W., Koneman, E., Procop, G., Schernckenberger, P., y otros. (2008). Koneman Diagnostico microbiológico. Argentina: Editorial Médica Panamericana S.A. Sardiñas, G., Santana, J., & Morales, E. (2006). Papel del cerumen humano en la profilaxis de la Otitis Externa Aguda Difusa. Medi Ciego, 12(1). Silva, N. (2001). Identification and antimicrobial susceptibility patterns of Staphylococcus spp. isolated from canine chronic otitis externa. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. [online], 53(2), 1-5. .

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