Recommended
More Related Content
What's hot
What's hot (20)
Similar to Sted microscopy
Similar to Sted microscopy (20)
Sted microscopy
- 1. STED Microscopy Αριάδνη Αλιμπέρτη ΔημήτρηςΤρουμπούκης Χρήστος Μάντης Μάριος Σιμόπουλος Δανιήλ Κώτση ΣωτήρηςΤόσκος Γιώργος Κόντης
- 2. 1 Βασικές αρχές του STED
- 3. Μικροσκοπία και Φθορισμός Στην οπτική μικροσκοπία: Ακτίνες φωτός διέρχονται από το δείγμα Οι ακτίνες φωτός διαθλώνται, ανακλώνται, απορροφούνται ή περνάνε άθικτες Ανιχνεύονται όλες οι ακτίνες φωτός που διέρχονται από το δείγμα και φτάνουν στον αντικειμενικό φακό
- 4. Μικροσκοπία και Φθορισμός Ανιχνεύεται μόνο το φως που εκπέμπεται από τα φθορίζοντα μόρια Στις μικροσκοπίες φθορισμού: Φθορίζοντα μόρια προστίθενται στο δείγμα Το δείγμα φωτίζεται και τα φθορίζοντα μόρια διεγείρονται Με το φαινόμενο του φθορισμού τα φθορίζοντα μόρια εκπέμπουν φωτόνια
- 5. Φθορισμός Φωτόνιο συγκεκριμένης ενέργειας διεγείρει ηλεκτρόνιο μεταφέροντάς το σε μια υψηλότερη ενεργειακή στιβάδα Το ηλεκτρόνιο μεταπίπτει στην χαμηλότερη ενεργειακά επιτρεπτή υποστιβάδα της στιβάδας αυτής (με δόνηση ή έκλυση θερμότητας) Το ηλεκτρόνιο αποδιεγείρεται, πέφτει στην βασική στιβάδα απελευθερώνοντας ενέργεια σε μορφή φωτονίου 01 02 03
- 6. Φθορισμός Το κάθε φθορίζον μόριο απορροφά σε συγκεκριμένο μήκος κύματος και εκπέμπει διαφορετικού χρώματος φωτόνια
- 7. NA : Numerical aperture Διακριτικό Όριο d = 𝜆 2 𝑛 𝑠𝑖𝑛𝜃 NA Μεγάλο NA Μεγαλύτερη ευκρίνεια Μικρό λ Μεγαλύτερη ευκρίνεια λ: Wavelength Είναι το θεωρητικό όριο διακριτικότητας του μικροσκοπίου Καθορίζεται από την εξίσωση στα δεξιά:
- 8. PSF (Point Spread Function) Είναι το πρακτικό όριο διακριτικότητας του μικροσκοπίου Ουσιαστικά αναφέρεται στο πως μπορούμε να παρατηρήσουμε ένα φθορίζον μόριο με το συγκεκριμένο μικροσκόπιο Δεν μπορεί να ξεπεραστεί το όριο των 200 nm
- 9. STED Microscopy Μείωση φθορισμού των μορίων στην περιφέρεια, με αποτέλεσμα να ξεπερνάται το όριο διακριτικότητας των 200 nm (≈40 nm) Η τεχνική αξιοποιεί δύο ακτίνες laser: Διέγερση των μορίων (Excitation Beam) Αποδιέγερση των μορίων στην περιφέρεια (STED Beam)
- 10. Κατάρριψη PSF Λιγότερο θολή εικόνα Μεγαλύτε ρη ευκρίνεια Φθορισμός μόνο από την κεντρική περιοχή Δημιουργία μικρότερης διεγερμένης εστιακής περιοχής Μικρότερο PSF
- 11. Excitation Beam 1η ακτίνα laser: διέγερση μορίων δείγματος Αυθόρμητη εκπομπή φωτονίων (spontaneous emission)
- 12. Stimulated Emission 2η ακτίνα laser: προκαλεί εξαναγκασμένη εκπομπή φωτονίων (stimulated emission) Το 1ο φωτόνιο δίνει ενέργεια στα ηλεκτρόνια, έτσι ώστε να το διεγείρει (excited state). Τελικά παράγονται δυο ίδια φωτόνια (λ, f, φ0, κατεύθυνση) Το 2ο φωτόνιο αλληλεπιδρά πριν προλάβει να αποδιεγερθεί το ηλεκτρόνιο και το ωθεί από το excited στο ground state.
- 13. STED Beam Η εξαναγκασμένη εκπομπή φωτονίων τελικά έχει ως αποτέλεσμα το “switch off” των περιφερειακών μορίων (depletion) Η παρεμπόδιση των φωτονίων χαμηλότερης ενέργειας επιτυγχάνεται με τη χρήση φίλτρου ανίχνευσης και διχρωικών καθρεφτών Χαρακτηριστικά STED Beam: Ακτίνα σε σχήμα “donut” Εκπέμπει red-shifted φωτόνια
- 14. STED imaging Ελεύθερη μετακίνηση (σκανάρισμα) πάνω στο δείγμα Γνωστή προέλευση σήματος – προκαθορισμένες συντεταγμένες του STED Beam Ολοκληρωμένη η εικόνα των μορίων τροφοδοτείται απευθείας στον υπολογιστή
- 15. Ένταση του STED Beam Προσαρμόζοντας την ένταση μπορούμε να επιτύχουμε αποτελεσματική εστίαση σε μικρή περιοχή του δείγματος. I: Μέγιστη ένταση κατανομής φωτός στην STED Beam Is: Ένταση όπου η πιθανότητα φθορισμού είναι μειωμένη στο μισό Όπως είναι προφανές αυξάνοντας την ένταση, αυξάνεται και η διακριτικότητα του δείγματος. d = 𝜆 2 ΝΑ 1+𝐼/𝐼𝑠
- 16. Ένταση του STED Beam Μεγαλύτερη ευκρίνεια Μεγαλύτερη πιθανότητα τα μόρια να πάθουν photobleaching I >> Is I >> Is Για τιμές Iμεγαλύτερες του Isτα μόρια απενεργοποιούνται (“switched-off”) Παρόλα αυτά, υψηλές τιμές έντασης ενδέχεται να τραυματίσουν το δείγμα, ενώ χαμηλές τιμές μπορεί να μην δίνουν τη διακριτική ικανότητα που επιθυμούμε.
- 17. Διάταξη μικροσκοπίου STED Μικροσκόπιο & ανιχνευτής Μηχανισμός παραγωγής ακτινών 1 2 1 2
- 19. Κανονική STED λειτουργία Γνωρίζει τη στιβάδα που εστιάζει (εξαρτάται από τον αντικειμενικό φακό) Συνδυάζει το σήμα που λαμβάνει από το 2D μονοπάτι 2D 3D 3D STED imaging
- 20. 3D STED imaging Περιορίζει την αλληλεπίδραση των στιβάδων στον z άξονα 3D STED Microscope Excitation beam (Normal) STED Beam 2D path (P2D plate) 3D path (P3D plate)
- 21. Παίρνουμε την ακριβή 3D δομή ενώ ταυτόχρονα μπορούμε να εντοπίσουμε και τις δύο ομάδες σηματοδοτημένων μορίων Two-color STED 3D imaging
- 22. Απεικόνιση ζωντανών κυττάρων Βαφη με αντισώματα: εισάγωνται σε επεργασμένα και διαπερατά μόνο κύτταρα Δεν φαίνονται τα δυναμικά φαινόμενα Η εισαγωγή ολόκληρων αντισωμάτων: βαριά και ελαφριά αλυσίδα, αναδιπλώνονται και κάνουν και δισουλφιδικούς δεσμούς Η εισαγωγή nanobodies (βαριά αλυσίδα): προσδένονται στα αντιγόνα σε μια μόνο θέση 1 2 3
- 23. Χαρακτηριστικά nanobodies 01 02 03 04 05 Έχουν 1 υπομονάδα (βαριά αλυσίδα) Έχουν μικρό μέγεθος (2-3 nm) Έχουν μια θέση πρόσδεσης αντιγόνου Μπορούν να παραχθούν με ανασυνδυασμό Μονοκλωνικά Atto647N (φθορίζον μόριο)
- 24. Η διαλογή των φθορίζοντων μορίων Συχνά χρησιμοποιούμενες φθορίζουσες πρωτεΐνες στις μικροσκοπίες φθορισμού είναι οι GFP και ηYFP (ex: 480 nm & STED 595 nm) E2-Crimson : 611 nm - 646 nm mGarnet : 598 nm - 670 nm tagRFP657: 611nm - 657nm mNeptune2 : 599nm – 643nm Ωστόσο στην in vivo απεικόνιση προτιμάμε μήκη κύματος πιο κοντά στο υπέρυθρο, διότι έτσι: Απορροφάται λιγότερη ακτινοβολία από το δείγμα (μικρότερη φωτοτοξικότητα, ασφαλέστερο δείγμα) Λόγω της μικρότερης ενεργούς διατομής υπάρχει λιγότερη σκέδαση (μεγαλύτερη διείσδυση) Επιτυγχάνεται μικρότερος αυτοφθορισμός από την διέγερση μορίων που βρίσκονται φυσιολογικά στο κύτταρο (π.χ. NADH, φλαβίνες, αιμογλοβίνη)
- 25. Απεικόνιση ζωντανών κυττάρων Έτσι μπορούμε να φτάσουμε σε βάθος μέχρι και 120 μm με μια διακριτική ικανότητα κοντά στα 80 nm
- 26. STED Beam Αντισώματα (775nm) Νανοσώματα (775 nm) Excitation Beam Abberior-Star580 (561nm) Atto647N (640nm) 2μm500 nm Αλληλεπιδράσεις με χρήση nanobodies Μπορούν να μελετηθούν ταυτόχρονα, ενώ αλληλεπιδρούν μεταξύ τους αλλά και με άλλες πρωτεΐνες Παρατηρήθηκαν με τα nanobodies, ίχνη των πρωτεϊνών και εκτός της συναπτικής περιοχής
- 27. Τεχνική οπτικής μικροσκοπίας Βασίζεται στην παραμόρφωση του κύματος και δημιουργεί εικόνα με αντιθέσεις Δεν χρειάζεται φθορίζοντα μόρια SPC (Spiral Phase Contrast) 01 02 03
- 28. STED SPC Widefield SPC Λόγω διαφορετικής αρχής λειτουργίας το STED-SPC μπορεί να παίρνει ταυτόχρονα φωτογραφίες και από τα δύο συστήματα Ευρύτερη περιοχή Μικρότερη αντίθεση (LED) Scanning confocal SPC Μεγαλύτερη εστίαση Μεγαλύτερη αντίθεση (laser)
- 29. STED SPC STED λεπτομερή ανάλυση της δομής Widefield SPC γενικότερη δομή και αλληλεπίδραση το γύρω περιβάλλον STED – Widefield SPC STED – Scanning confocal SPC STED λεπτομερή ανάλυση συγκέντρωσης ακτίνης Scanning confocal SPC επιτρέπει την οπτικοποίηση των λεπτών προεξοχών της δομής
- 30. VRI (Video Rate Imaging) in STED Τεχνική συνεστιακής μικροσκοπίας που καταγράφει πολλές φωτογραφίες (frames) σε μικρό χρονικό διάστημα ενός κινούμενου δείγματος Χαρακτηριστικά frames 1) Pixels (ρυθμιζόμενες διαστάσεις) 2) Μονάδα μέτρησης ταχύτητας απεικόνισης (25-400 fps) Αδυναμία απλού STED για video rate imaging, δημιουργία ανάγκης για νέο μηχανισμό
- 31. Resonant Scanners Σκαννάρισμα διαφορετικού σημείου στο δείγμα (σχηματισμός της συνολικής εικόνας γραμμή – γραμμή) Ανακατεύθυνση ακτίνας laser (γωνία εκτροπής laser, ανάλογη γωνίας καθρέφτη) Αμφίδρομη περιοδική περιστροφή καθρεφτών (συγκεκριμένη (υψηλή 8-16 kHz) f – γρήγορη περιστροφή)
- 32. Μεταβλητές Scanning Μεγάλη ταχύτητα scanning Μείωση photobleaching Λεπτομερής αποτύπωση κίνησης Μείωση οπτικού πεδίου Αύξηση διακριτικού ορίου Μειωμένη ανάλυση
- 33. Εφαρμογές VRI in STED Κίνηση συναπτοταγμίνης σε καλλιέργειες νευρώνων ιππόκαμπου σε αρουραίο Χαρακτηριστικά : 28 fps 16 kHz (f καθρέφτη) 65 nm
- 34. Σύγκριση Super-Resolution Techniques x-y resolution 200-250 nm 100-130 nm 20-40 nm (<10 nm) 25-80 nm (<10 nm) Fluorophore flexibility High High Moderate STED compatible Bleaching Moderate Moderate - High Very High High Live cell Instrument complexity Low - Medium Medium Medium High Data processing Not required Required Required Not required
- 35. Σύγκριση Super-Resolution Techniques Pros • Established • Fast • High Flexibility • Compatible with wide- field • High resolution • Cost – effective • Lower light levels • High resolution • Fast for small field of view • No data processing Cons • Low resolution • Limited resolution improvement • Data processing • Extensive data processing • Slow speed imaging • Fluorophore limited • Fluorophore – limited • Multicolor – limited
- 37. Νευρώνας & Dendritic spines
- 38. Dendritic Spines Μεγάλος αριθμός spines σε κάθε δενδρίτη Σύνδεση με νευράξονες Υποδοχείς σύναψης του νευρικού κυττάρου Δυναμικές δομές, όπου η λειτουργία σχετίζεται με τη μορφολογία Χαρακτηριστικά δομής : Head (≈1μm) Neck diameter (50-150 nm) 1 2 3 4
- 39. Ιππόκαμπος και STED Ο ιππόκαμπος είναι από τις πιο μελετημένες δομές του εγκεφάλου λόγω της έντονης συσχέτισής του με την μνήμη και την πλαστικότητα (CA1 πυραμιδικοί νευρώνες) Το STED είναι κατάλληλο για τη μελέτη προκαλούμενων αλλαγών στη μορφολογία των συνάψεων
- 40. Με τεχνητό LTP (Long-Term Potentiation), προκάλεσαν στο 40-60% των spines τροποποίηση στη μορφολογία STED live-cell imaging of spines Αλλαγή μορφολογίας του head με βάση τα ερεθίσματα (πλαστικότητα) Πριν: Round shaped Large headed Μετά: Cup shaped Cup/Bulbous shaped Παρατήρησαν ότι:
- 41. STED μέτρησε το neck diameter 0.1μm σε αντίθεση με το confocal 0.2μm Λεπτομερής μορφολογία spines Διακριτική ικανότητα STED Small Thin Mushroom -like 3 κατηγορίες με βάση τη μορφολογία: Λεπτομερής ανάλυση της 3D δομής των spines
- 42. Δυναμικότητα των spines Σε περίοδο 4 ημερών παρατήρησαν: 40% των spines εξαφανίστηκαν Μόνο το 7% αυτών ανήκαν στην κατηγορία “mushroom-like” Υποδεικνύει αλλαγή στη δυναμικότητα των spines με βάση τη μορφολογία Η μεγαλύτερη κατηγορία σε μέγεθος (mushroom-like), εμφανίζει μεγαλύτερη σταθερότητα
- 43. Αντλίες Κ+/Να+ μέσω STED Μέσω της οπτικής μικροσκοπίας (confocal microscope) οι αντλίες φαίνονται να κατανέμονται ομοιόμορφα στις επιφάνειες των dendritic spines Χρησιμοποιώντας την μικροσκοπία STED διακρίνεται μια διαμερισματοποίηση της κατανομής Αντλίες K+/Να+ υπάρχουν όπως στις περισσότερες δομές έτσι και στα dendritic spines
- 44. Υπάρχουν περιθώρια για περεταίρω έρευνα μέσω της μικροσκοπίας για την παρατήρηση της δυναμικότητας των αντλιών K+/Να+ ! Αντλίες Κ+/Να+ μέσω STED Η διαμερισματοποίηση αυτή της ΝΚΑ υποδηλώνει πως έχει παραπάνω ρόλους: Διατηρεί μια αυξημένη συγκέντρωση Να+ τοπικά μέσα στους dendritic spines Καθορίζει τη αλληλεπίδραση με άλλες συναπτικές πρωτεΐνες που ρυθμίζουν την ενεργότητα της αντλίας
- 46. Εισαγωγή στον καρκίνο Ο καρκίνος είναι ένας κακοήθης όγκος που προκαλεί αφύσικη κυτταρική ανάπτυξη Η μετακίνηση του καρκίνου σε διαφορετικό ιστό ονομάζεται μετάσταση Καρκινικά κύτταρα: • διαφορετική μορφολογία • ιδιαίτερα επιθετικά • διαταραγμένος κυτταρικός κύκλος Α Β
- 47. Διάγνωση σε αρχικά στάδια (πριν γίνει μετάσταση) εξασφαλίζει περισσότερες πιθανότητες επιβίωσης. Έγκαιρη διάγνωση: • Διαγνωστική ευχέρεια • Παρενέργειες Μέθοδοι Διάγνωσης Μέθοδοι διάγνωσης λόγω ανθρώπινου παράγοντα: • Αστάθεια • Ασάφεια STED: • Εικόνες υψηλής ανάλυσης • Μεγάλη ευαισθησία • Ανίχνευση σε πρώιμα στάδια
- 48. Μεταστατικά κύτταρα 01Μηχανικές ιδιότητες (ινίδια βιμεντίνης) 02 Ιδιότητες προσκόλλησης (φωσφορυλιωμένες τυροσίνες) Τα μεταστατικά κύτταρα έχουν διαφορετική χωρική οργάνωση πρωτεϊνών, σχετικές με: Αυτό επιτρέπει την διάκριση των μεταστατικών από τα κανονικά κύτταρα
- 49. Σωματίδια κυτταρικής προσκόλλησης με STED Ως σωματίδια κυτταρικής προσκόλλησης θεωρήθηκαν οι φωσφορυλιωμένες τυροσίνες που βρίσκονταν σε ινίδια ακτίνης Για την απεικόνηση των ινιδίων ακτίνης χρησιμοποίηθηκεAtto-670N (κόκκινο) Για την απεικόνιση των φωσφορυλιωμένων τυροσινών χρησιμοποιήθηκεAtto-590 (πράσινο)
- 50. Σωματίδια κυτταρικής προσκόλλησης με STED Από την απεικόνιση των σωματιδίων προσκόλλησης και των ινιδίων ακτίνης σε κανονικά και μεταστατικά κύτταρα είχαμε τα εξής αποτελέσματα: Πολύ μεγαλύτερη πυκνότητα σωματιδίων εκτός των συμπλόκων για τα μεταστατικά κύτταρα Ίδια πυκνότητα σωματιδίων στα σύμπλοκα κυτταρικής προσκόλλησης Περισσότερα και μικρότερα σύμπλοκα κυτταρικής προσκόλλησης στα μεταστατικά κύτταρα 1 2 3
- 51. Σωματίδια κυτταρικής προσκόλλησης με STED Η αύξηση του αριθμού και η μείωση του μεγέθους των συμπλόκων κυτταρικής προσκόλλησης σχετίζεται με αυξημένη συσταλτική δύναμη των κυττάρων Η αυξημένη πυκνότητα και μια πιο ομοιογενής κατανομή των σωματιδίων προσκόλλησης προσδίδουν μειωμένη δυνατότητα κυτταρικής προσκόλλησης και αυξημένη συσταλτικότητα στα μεταστατικά κύτταρα Η κατανομή των σωματιδίων προσκόλλησης καθιστά τα μεταστατικά κύτταρα κατάλληλα για μετανάστευση
- 52. Βιμεντίνες (Vim) Εμπλέκονται σε μηχανικές/προσκολλητικές ιδιότητες Δομή: • Μεμονωμένη ανάπτυξη • Συγκεκριμένη κατεύθυνση Δομικές πρωτεΐνες υπεύθυνες για: • Σταθερότητα • Κινητικότητα
- 53. Πρόβλεψη παραμέτρων Χρήση λογισμικού για υπολογισμό: • Γωνία ανάπτυξης ινιδίων vim (παράλληλα/αποπροσανατολισμένα) • Πλάτος ινιδίων vim Χάρη στο STED παρατηρήσαμε για τα ινίδια vim: • Κυρίως αποπροσανατολισμένη ανάπτυξη • Μεγαλύτερο πλάτος ινιδίων
- 54. Εσωτερική δομή κυττάρων και STED Χαοτική δόμηση μεταστατικών κυττάρων: • Σύγχυση ινιδίων μεταξύ τους • Ανάπτυξη με τυχαίο τρόπο STED μια αποτελεσματική διαγνωστική μέθοδος Επηρεάζει τις μηχανικές/προσκολλητικές ιδιότητες του κυττάρου, προσδίδοντάς του μεγαλύτερη κινητικότητα (δυνητικά μετάσταση)
- 55. 5 Συμπέρασμα
- 56. Δυναμική τεχνικής STED Δυσνόητη και περίπλοκη τεχνική Απλοποίηση τεχνικής (καθίσταται πιο εύχρηστη) Εξειδίκευση για πιο συγκεκριμένη εφαρμογή Σημαντικές ανακαλύψεις αξιοποιώντας την τεχνική 1 2 3 4
- 57. 6 Βιβλιογραφία
- 58. Βιβλιογραφία 1. Lauterbach, M. A., Keller, J., Schönle, A., Kamin, D., Westphal, V., Rizzoli, S. O., & Hell, S. W. (2010). Comparing video-rate STED nanoscopy and confocal microscopy of living neurons. Journal of Biophotonics, 3(7), 417–424. doi: 10.1002/jbio.201000038 2. Müller, T., Schumann, C., & Kraegeloh, A. (2012). Cover Picture: STED Microscopy and its Applications: New Insights into Cellular Processes on the Nanoscale (ChemPhysChem 8/2012). ChemPhysChem, 13(8), 1986–2000. doi: 10.1002/cphc.201290035 3. Larson, J. M., Schwartz, S. A., Dragoo, T., & Davidson, M. W. (n.d.). Resonant Scanning Confocal Microscope Zoom. Retrieved from https://www.microscopyu.com/tutorials/resonant- scanning-confocal-microscope-zoom 4. Larson, J. M., Schwartz, S. A., & Davidson, M. W. (n.d.). Resonant Scanning in Laser Confocal Microscopy. Retrieved from https://www.microscopyu.com/techniques/confocal/reson ant-scanning-in-laser-confocal-microscopy 5. Larson, J. M., Schwartz , S. A., Rainey, A. M., Coker, A. B., & Davidson, M. W. (n.d.). Resonant Scanning in Laser Confocal Microscopy. Retrieved from https://www.microscopyu.com/tutorials/resonant- scanning-in-laser-confocal-microscopy 6. Spring, K. R., Fellers , T. J., & Davidson, M. W. (n.d.). Confocal Microscope Scanning Systems. Retrieved from https://olympus.magnet.fsu.edu/primer/techniques/confo cal/confocalscanningsystems.html 7. Microscopy: Super-Resolution: Overview and Stimulated Emission Depletion (Sted). (2013). Retrieved from https://www.youtube.com/watch?v=YyBGiZZSslY 8. Müller, T., Schumann, C., & Kraegeloh, A. (2012). STED Microscopy and its Applications: New Insights into Cellular Processes on the Nanoscale. ChemPhysChem, 13(8), 1986–2000. doi: 10.1002/cphc.201100986 9. Müller, T., Schumann, C., & Kraegeloh, A. (2012). STED Microscopy and its Applications: New Insights into Cellular Processes on the Nanoscale. ChemPhysChem, 13(8), 1986–2000. doi: 10.1002/cphc.201100986
- 59. Βιβλιογραφία 6. Zolghadr, K., Gregor, J., Leonhardt, H., & Rothbauer, U. (2012). Case Study on Live Cell Apoptosis-Assay Using Lamin-Chromobody Cell-Lines for High-Content Analysis. Single Domain Antibodies, 911, 569–575. doi: 10.1007/978-1-61779-968-6_36 7. Blom, H., Rönnlund, D., Scott, L., Spicarova, Z., Widengren, J., Bondar, A., … Brismar, H. (2011). Spatial distribution of Na -K -ATPase in dendritic spines dissected by nanoscale superresolution STED microscopy. BMC Neuroscience, 12(1), 16–22. doi: 10.1186/1471-2202-12-16 8. Cramer, K., Bolender, A.-L., Stockmar, I., Jungmann, R., Kasper, R., & Shin, J. Y. (2019). Visualization of Bacterial Protein Complexes Labeled with Fluorescent Proteins and Nanobody Binders for STED Microscopy. International Journal of Molecular Sciences, 20(14), 3376. doi: 10.3390/ijms20143376 9. Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., & Nägerl, U. V. (2011). STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices. Biophysical Journal, 101(5), 1277–1284. doi: 10.1016/j.bpj.2011.07.027 10. Bianchini, P., Peres, C., Oneto, M., Galiani, S., Vicidomini, G., & Diaspro, A. (2015). STED nanoscopy: a glimpse into the future. Cell and Tissue Research, 360(1), 143–150. doi: 10.1007/s00441-015-2146-3 11. Blom, H., & Widengren, J. (2014). STED microscopy— towards broadened use and scope of applications. Current Opinion in Chemical Biology, 20, 127–133. doi: 10.1016/j.cbpa.2014.06.004 12. Gao, Z., Wang, J. H., Song, P., Kang, B., Xu, J. J., & Chen, H. Y. (2020). Spaser Nanoparticles for Ultranarrow Bandwidth STED Super‐Resolution Imaging. Advanced Materials, 32(9), 1907233. doi: 10.1002/adma.201907233 13. Birka Hein, Katrin I. Willig, Stefan W. Hell, Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell.Proc Natl Acad Sci U S A.,105(38),14271–14276 (2008) 14. Mehdi Arbabi-Ghahroudi,Camelid Single-Domain Antibodies: Historical Perspective and Future Outlook,Front Immunol,8,1589 (2017)
- 60. Βιβλιογραφία 15. Wegner W., Ilgen P., Gregor C. et al. In vivo mouse and live cell STED microscopy of neuronal actin plasticity using far-red emitting fluorescent proteins. Sci Rep 7, 11781 (2017) 16. Daniel Ronnlund, Annica K. B. Gad, et al. Spatial Organization of Proteins in Metastasizing Cells.Cytometry Part A,83(9),855-865 (2013) 17. Johnny Tam, David Merino,Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) in comparison with stimulated emission depletion (STED) and other imaging methods.Journal of Neurochemistry,135,643-658 (2015) 18. Maidorn, M., et al., (2018) Nanobodies reveal an extra- synaptic population of SNAP-25 and Syntaxin 1A in hippocampal neurons, mAbs, v.11(2), pp.305-321, https://doi.org/10.1080/19420862.2018.1551675 19. What is Super-Resolution Microscopy? STED, SIM and STORM Explained. (2019). Retrieved from https://www.technologynetworks.com/neuroscience/artic les/what-is-super-resolution-microscopy-sted-sim-and- storm-explained-328572 20. Wegel, E., Göhler, A., Lagerholm, B. et al. (2016). Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports Volume, 6. doi: https://doi.org/10.1038/srep27290 21. Marcel A Lauterbach , Jan Keller, Andreas Schönle, Dirk Kamin, Volker Westphal, Silvio O Rizzoli, Stefan W Hell. (2010). Comparing Video-Rate STED Nanoscopy and Confocal Microscopy of Living Neurons. J Biophotonics, 417–424. doi:10.1002/jbio.201000038 22. Absorption, Spontaneous and stimulated emission (Engineering Physics). (2014). Retrieved from https://www.youtube.com/watch?v=iWaAPwsrJhg 23. Super resolution imaging with Stimulated Emission Depletion (STED). Retrieved from https://svi.nl/Stimulated-Emission-Depletion-(STED)- Microscopy 24. May, M. (2018) Super-Resolution Microscopy Options. Retrieved from https://www.biocompare.com/Editorial- Articles/350086-Super-Res-Microscopy-Options/
- 61. Βιβλιογραφία 25. Llères, D., Swift, S., & Lamond, A. I. (2007). Detecting protein-protein interactions in vivo with FRET using multiphoton fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Current protocols in cytometry, Chapter 12, Unit12.10. https://doi.org/10.1002/0471142956.cy1210s42 26. Gould, T. J., Burke, D., Bewersdorf, J., & Booth, M. J. (2012). Adaptive optics enables 3D STED microscopy in aberrating specimens. Optics Express, 20(19), 20998. doi:10.1364/oe.20.020998 27. Osseforth, C., Moffitt, J. R., Schermelleh, L., & Michaelis, J. (2014). Simultaneous dual-color 3D STED microscopy. Optics Express, 22(6), 7028. doi:10.1364/oe.22.007028 28. Patton, B. R., Burke, D., Owald, D., Gould, T. J., Bewersdorf, J., & Boot, M. J. (2016). Three-dimensional STED microscopy of aberrating tissue using dual adaptive optics. Optics Express, 24(8), 8862-8876. doi:10.1364/OE.24.008862 29. Wildanger, D., Medda, R., Kastrup, L., & Hell, S. (2009). A compact STED microscope providing 3D nanoscale resolution. Journal of Microscopy, 236(1), 35- 43. doi:10.1111/j.1365-2818.2009.03188.x 30. Steffens, H., Wegner, W., & Willig, K. I. (2020). In vivo STED microscopy: A roadmap to nanoscale imaging in the living mouse. Methods, 174, 42-48. doi:10.1016/j.ymeth.2019.05.020 31. Trifonov, A. S., Jaskula, J., Teulon, C., Glenn, D. R., Bar- Gill, N., & Walsworth, R. L. (2013). Limits to Resolution of CW STED Microscopy. Advances In Atomic, Molecular, and Optical Physics Advances in Atomic, Molecular, and Optical Physics, 279-302. doi:10.1016/b978-0-12-408090-4.00005-0 32. Jaworski, J., Kapitein, L. C., Gouveia, S. M., Dortland, B. R., Wulf, P. S., Grigoriev, I., . . . Hoogenraad, C. C. (2009). Dynamic Microtubules Regulate Dendritic Spine Morphology and Synaptic Plasticity. Neuron, 61(1), 85- 100. doi:10.1016/j.neuron.2008.11.013
- 62. Βιβλιογραφία 33. Yuste, R., & Bonhoeffer, T. (2001). Morphological Changes in Dendritic Spines Associated with Long-Term Synaptic Plasticity. Annual Review of Neuroscience, 24(1), 1071-1089. doi:10.1146/annurev.neuro.24.1.1071 34. Toomre , D., & Bewersdorf, J. (2010). 290–291. Retrieved from file:///C:/Users/User/Downloads/annurev-cellbio eclass2.pdf 35. Harke, B. (2008). 3D STED microscopy with pulsed and continuous wave lasers (Doctoral dissertation, Göttingen, Univ., Diss, 2008). Göttinge: Georg August University. 36. Physics Reimagined group (LPS, CNRS Universite Paris-Sud) with funding of Labex PALM, Phase contrast and dark field microscopes, 2016, retrieved from: https://www.youtube.com/watch?v=vr4tYUnaHNQ 37. Hruska, Martin, et al. “Synaptic Nanomodules Underlie the Organization and Plasticity of Spine Synapses.” Nature Neuroscience, vol. 21, no. 5, 2018, pp. 671–682., doi:10.1038/s41593-018-0138-9. 38. Loew, Leslie M., and Stefan W. Hell. “Superresolving Dendritic Spines.” Biophysical Journal, vol. 104, no. 4, 2013, pp. 741–743., doi:10.1016/j.bpj.2013.01.011. 39. Willig, Katrin I., and U.Valentin Nägerl. “Stimulated Emission Depletion (STED) Imaging of Dendritic Spines in Living Hippocampal Slices.” Cold Spring Harbor Protocols, vol. 2012, no. 5, 2012, doi:10.1101/pdb.prot069260. 40. Nägerl, U. (2012). Beyond Abbe’s Resolution Barrier. Cellular Imaging Techniques for Neuroscience and Beyond, 35-54. doi:10.1016/b978-0-12-385872-6.00002- 7
- 63. Εικόνες 1. Burns, G., Brooks, K., Wildung, M., Navakanitworakul, R., Christenson, L. K., & Spencer, T. E. (2014). Extracellular Vesicles in Luminal Fluid of the Ovine Uterus. PLoS ONE, 9(3). doi:10.1371/journal.pone.0090913, fig.7, pp.10 2. Optical Microscopy Application: Darkfield Illumination, edmundoptics.eu: https://www.edmundoptics.eu/resource-page/application- notes/microscopy/optical-microscopy-application- darkfield-illumination/ 3. Burns, G., Brooks, K., Wildung, M., Navakanitworakul, R., Christenson, L. K., & Spencer, T. E. (2014). Extracellular Vesicles in Luminal Fluid of the Ovine Uterus. PLoS ONE, 9(3). doi:10.1371/journal.pone.0090913, fig.7, pp10 4. Fluoresence Filters, wikipedia : https://commons.wikimedia.org/wiki/File:FluorescenceFi lters_2008-09-28.svg 5. Jablonski diagram of absorbance, non-radiative decay, and fluorescence. Wikipedia : https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Jablonski_Dia gram_of_Fluorescence_Only.png 6. Overview of Fluorescence Excitation and Emission Fundamentals, Olympus-lifescience.com : https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope- resource/primer/lightandcolor/fluoroexcitation/ 7. Roymahapatra, Gourisankar & Sinha, Chittaranjan. (2014). Birth of ‘Nanoscope’ and ‘Chemistry Nobel- 2014’. 10.13140/2.1.4536.3529. 8. Zeiss Campus, Education in Microscopy and Digital Imaging : http://zeiss- campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/psf.html 9. Happel , P. (n.d.). STED – Super-resolution fluorescence recordings - RUBION - Zentrale Einheit für Ionenstrahlen und Radionuklide. Retrieved from: https://www.rubion.rub.de/en/methods/sted-super- resolution-fluorescence-recordings/ 10. Scientific Volume Imaging Deconvolution - Visualization - Analysis. (n.d.). Retrieved from https://svi.nl/Stimulated-Emission-Depletion-(STED)- Microscopy
- 64. Εικόνες 11. Detecting Protein-Protein Interactions In Vivo with FRET using Multiphoton Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM). (n.d.). Retrieved from https://www.researchgate.net/figure/101-Fluorescence- fundamentals-Jablonski-diagram-displaying-the-energy- states-of-a_fig1_23236997 12. Marcel Leutenegger, Christian Eggeling, and Stefan W. Hell. (2010). Analytical description of STED microscopy performance, 18(25), 26417–26429. doi: https://doi.org/10.1364/OE.18.026417 13. Nika Mlinaric (2016) STED microscopy University of Ljubljana Faculty of Mathematics and Physics, January Ljubljana 14. M.O.Lenz,A.C.N. Brown,E.Auksorius, et al. A STED- FLIM microscope applied to imaging the Natural Killer cell immune synapse.Proceedings of SPIE - The International Society for Optical Engineering,7903 (2011) https://www.researchgate.net/figure/Fluorescence- intensity-left-and-intensity-STED-center-image-of-a- cell-of-the-human-NK_fig1_253134507 15. University of Zurich, Center for Microscopy an Image Analysis, CLSM - Leica SP8 inverse STED 3X (Irchel), https://www.zmb.uzh.ch/en/Instruments-and- tools/LightMicroscopes/CLSM/gSTED3X.html 16. PicoQuant, Stimulated Emission Depletion Microscopy (STED), https://www.picoquant.com/applications/category/life- science/sted#tab-2 17. Osseforth, C., Moffitt, J. R., Schermelleh, L., & Michaelis, J. (2014). Simultaneous dual-color 3D STED microscopy. Optics Express, 22(6), 7028. doi:10.1364/oe.22.007028 18. Wildanger, D., Medda, R., Kastrup, L., & Hell, S. (2009). A compact STED microscope providing 3D nanoscale resolution. Journal of Microscopy, 236(1), 35- 43. doi:10.1111/j.1365-2818.2009.03188.x 19. Nanobodies/VHHs, Chromotek.com : https://www.chromotek.com/technology/recombinant- single-domain-vhh-antibodies/
- 65. Εικόνες 20. ATTO-TEC, ATTO 647N, https://www.atto- tec.com/product_info.php?language=en&info=p114_atto -647n.html 21. Maidorn, M., et al., (2018) Nanobodies reveal an extra- synaptic population of SNAP-25 and Syntaxin 1A in hippocampal neurons, mAbs, v.11(2), pp.305-321, https://doi.org/10.1080/19420862.2018.1551675 22. Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., & Nägerl, U. V. (2011). STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices. Biophysical Journal, 101(5), 1277–1284. doi: 10.1016/j.bpj.2011.07.027. fig.2. pp.1281 23. Eggeling, C., Willig, K. I., & Barrantes, F. J. (2013). STED microscopy of living cells - new frontiers in membrane and neurobiology. Journal of Neurochemistry, 126(2), 203-212. doi:10.1111/jnc.12243. fig.2. pp. 207 24. Lauterbach, Marcel A., et al. “STED Microscope with Spiral Phase Contrast.” Scientific Reports, vol. 3, no. 1, 2013, doi:10.1038/srep02050. 25. Lauterbach, Marcel A., et al. “STED Microscope with Spiral Phase Contrast.” Scientific Reports, vol. 3, no. 1, 2013, doi:10.1038/srep02050. 26. Otomo, K., Hibi, T., Kozawa, Y., & Nemoto, T. (2015). STED microscopy—super-resolution bio-imaging utilizing a stimulated emission depletion. Microscopy, 64(4), 227–236. doi: 10.1093/jmicro/dfv036 27. Lauterbach, M. A., Keller, J., Schönle, A., Kamin, D., Westphal, V., Rizzoli, S. O., & Hell, S. W. (2010). Comparing video-rate STED nanoscopy and confocal microscopy of living neurons. Journal of Biophotonics, 3(7), 417–424. doi: 10.1002/jbio.201000038 28. Neuron, Wikipedia: https://en.wikipedia.org/wiki/Neuron 29. Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., & Nägerl, U. V. (2011). STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices. Biophysical Journal, 101(5), 1277–1284. doi: 10.1016/j.bpj.2011.07.027
- 66. Εικόνες 30. Pfeiffer, Thomas, et al. “Chronic 2P-STED Imaging Reveals High Turnover of Dendritic Spines in the Hippocampus in Vivo.” ELife, vol. 7, 2018, doi:10.7554/elife.34700. 31. Blom, H., Rönnlund, D., Scott, L., Spicarova, Z., Widengren, J., Bondar, A., … Brismar, H. (2011). Spatial distribution of Na -K -ATPase in dendritic spines dissected by nanoscale superresolution STED microscopy. BMC Neuroscience, 12(1), 16–22. doi: 10.1186/1471-2202-12-16. fig.3. pp.4 32. Blom, H., Rönnlund, D., Scott, L., Spicarova, Z., Widengren, J., Bondar, A., … Brismar, H. (2011). Spatial distribution of Na -K -ATPase in dendritic spines dissected by nanoscale superresolution STED microscopy. BMC Neuroscience, 12(1), 16–22. doi: 10.1186/1471-2202-12-16. fig.3. pp.4 33. Summary of cholinergic synaptic events, getbodysmart.com : https://www.getbodysmart.com/nervous- system/cholinergic-synaptic-events 34. Rönnlund, D., Gad, A. K. B., Blom, H., Aspenström, P., & Widengren, J. (2013). Spatial organization of proteins in metastasizing cells. Cytometry Part A, 83(9), 855–865. doi: 10.1002/cyto.a.22304. fig.1. pp. 858 35. Rönnlund, D., Gad, A. K. B., Blom, H., Aspenström, P., & Widengren, J. (2013). Spatial organization of proteins in metastasizing cells. Cytometry Part A, 83(9), 855–865. doi: 10.1002/cyto.a.22304. fig.1. pp. 858 36. Rönnlund, D., Gad, A. K. B., Blom, H., Aspenström, P., & Widengren, J. (2013). Spatial organization of proteins in metastasizing cells. Cytometry Part A, 83(9), 855–865. doi: 10.1002/cyto.a.22304. fig.1. pp. 858 37. Rönnlund, D., Gad, A. K. B., Blom, H., Aspenström, P., & Widengren, J. (2013). Spatial organization of proteins in metastasizing cells. Cytometry Part A, 83(9), 855–865. doi: 10.1002/cyto.a.22304. fig.1. pp. 858 38. Rönnlund, D., Gad, A. K. B., Blom, H., Aspenström, P., & Widengren, J. (2013). Spatial organization of proteins in metastasizing cells. Cytometry Part A, 83(9), 855–865. doi: 10.1002/cyto.a.22304. fig.1. pp. 858
- 67. Εικόνες 39. Rönnlund, D., Gad, A. K. B., Blom, H., Aspenström, P., & Widengren, J. (2013). Spatial organization of proteins in metastasizing cells. Cytometry Part A, 83(9), 855–865. doi: 10.1002/cyto.a.22304 40. Stefan Hell, iBiology Techniques, 17/11/2013, Microscopy: Super-Resolution: Overview and Stimulated Emission Depletion (STED) (Stefan Hell), https://www.youtube.com/watch?v=YyBGiZZSslY&t=1 7s
- 68. Ευχαριστούμε για την προσοχή σας!