1. Martina Volfová
Biofyzika
2009

2.  Úvod
 Experimentální část
 Konfokální mikroskopie
 Mikrospektrofluorimetrie
 Výsledky a diskuze
 Závěr
 Použitá literatura

3.  mikrospory výtrusy se rozmnožujících rostlin (přesličky,
mechy a kapradiny) patří díky velmi dobře pozorovatelnému
vývoji a citlivosti k různým vnějším faktorům mezi vhodné
modely buněčných biologů
 hlavní výhodou je jejich autofluorescence excitovaná UV-
zářením
 jednoduché buňky obalené mnohovrstevnou celulózní stěnou
– ochrana před nepříznivými faktory vnějšího prostředí

4.  dříve bylo pro studium vývoje mikrospor používáno
histochemické barvení nebo elektronová mikroskopie
 jejich fluorescenci lze sledovat pod luminiscenčním
mikroskopem (mikrospektrofluorimetry)
 konstrukce konfokálního mikroskopu umožňuje sledovat
buněčné struktury režimem hloubky
 touto metodou lze studovat i buňky
řas a některé nesekretující buňky
vyšších rostlin

5.  vegetativní mikrospory přesličky rolní
(Equisetum arvense)
 sběr v přírodních lokalitách v dubnu–květnu
1996-2001
 klíčení mikrospor bylo studováno kultivací
na podložním sklíčku položeném na vlhkém
papíru na Petriho misce
 pro analýzy konfokálním mikroskopem s olejovou imerzí –
mikrospory vlhčeny a poté sušeny horkým vzduchem (50-70 C)
5-7 minut (studium suchých i vlhkých vzorků)
 při měření s vodní imerzí nebyly používány krycí sklíčka

6.  LSM 510 NLO „Carl Zeiss“
 program LSM 510 and Lucida
Analyse 5
 vodní i olejová imerze
 buzení emise:
 argon laser (458, 488, 514 nm)
 He-Ne laser (543 nm)
 He-Ne laser (633 nm)

7.  tři fotonasobiče zachytávaly autofluorescenci samostatně
nebo současně užíváním pseudobarevných efektů
 excitace 488 nm – registrace autofluorescence 505-630 nm
 excitace 543 nm – registrace autofluorescence 565-615 nm
 excitace 633 nm – registrace autofluorescence 650-750 nm
 výsledný
obrázek je
superpozicí
pseudobarev

8.  vzorky excitovány UV-zářením 360-380 nm
 analýzy mikrospektrofluorimetry – registrace
fluorescenčních spekter a měření fluorescenčních intenzit pro
dvě oddělené vlnové délky
 program „Microfluor“ – histogramy intenzit fluorescence a
statistické řešení dat použitím t-testu

9.  autofluorescence intaktních buněčných povrchů pozorována
luminiscenčním mikroskopem Fluoval „Carl Zeiss“
 fluorescenční spektra intaktních buněk měřena
mikrospektrofluorimetrem

10.  průměry optických sond: 100 μm, 20 μm, 2 μm
 zvětšení objektivu 10x
 zvětšení okuláru 7x
 registrační čas fluorescenčních spekter v oblasti 400-700 nm
byl 22 s
 chyba fluorescenčního měření byla 1-2 r. j.
 fluorescenční intenzity mikrospor byly měřeny také duálně –
vlnovým mikrospektrofluorimetrem

11.  konfokální mikroskopie - demonstrován rozdíl mezi modře
fluoreskujícím obalem a červeně fluoreskujícími
chloroplasty mikrospor (pigmenty, azuleny)
 ostatní organely – žlutá fluorescence

12.  mikrospektrofluorimetrie – střední část mikrospory má 3
maxima – 460, 550 a 680 nm (typické pro chlorofyl)
 obal a elatery (haptery) maximum při 680 nm nemají

13.  během vývoje mikrospor docházelo ke změnám
fluorescenčních spekter i barev – vlhčení mikrospor
 po 15 min zesílila fluorescence
chloroplastů, buňky zmohutněly a
objevily se haptery
 chloroplasty se začaly difúzně
pohybovat k buněčnému obalu
 po 60 min se chloroplasty pohybovaly zpět do středu buňky

14.  indikace začátku buněčného dělení
 po 120 min buňka odložila obal
 obal - maximum 460nm a rameno 500 nm
 uvolněná buňka - maxima 460, 550 a 680 nm, rozdělení na:
 mnohobuněčnou stélku (thallus)
 rhizoid (redukovaný počet chloroplastů)

15.  data byla korelována s histochemickým barvením při
použití 6-9 syntetických barviv a biochemickými
analýzami obsahu chlorofylu a azulenů
 během studia nedošlo k žádnému poškození mikrospor,
byly schopné dále pokračovat ve svém vývoji

16.  Autofluorescence vegetativních mikrospor,
produkovaných přesličkou jarní, je vhodná pro studium
buněčného vývoje od jednobuněčné struktury po
mnohobuněčný organismus metodami konfokální
mikroskopie a mikrospektrofluorimetrie.
 Během studia nedochází k žádnému poškození
mikrospor.
 Mikrospory jsou schopné dále pokračovat ve svém
vývoji.

17.  ROSHCHINA, V. V., YASHIN, V. A., KONONOV, A. V., 2004:
Autofluorescence of Developing Plant Vegetative Microspores Studied by
Confocal Microscopy and Microspectrofluorimetry, In Journal of Fluorescence: s.
745 – 750.
 http://lecive-rostliny.krasne.cz/byliny/preslicka-rolni
 http://fotoblog.in/clanek/591
 http://academicdepartments.musc.edu/ccdir/center_microscopes/center_microsco
pes.htm
 http://cgi.benl.ebay.be/Carl-Zeiss-Jena-Fluoval-Fluoreszenz-
Mikroskop_W0QQitemZ190344580729QQcmdZViewItemQQptZDE_Co
mputer_Elektronik_Foto_Camcorder_Optik?hash=item2c516bce79