Opticka spektroskopie martina volfova

384 views

Published on

0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total views
384
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
2
Actions
Shares
0
Downloads
2
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Opticka spektroskopie martina volfova

  1. 1. Martina VolfováBiofyzika2009
  2. 2.  Úvod Experimentální část Konfokální mikroskopie Mikrospektrofluorimetrie Výsledky a diskuze Závěr Použitá literatura
  3. 3.  mikrospory výtrusy se rozmnožujících rostlin (přesličky, mechy a kapradiny) patří díky velmi dobře pozorovatelnému vývoji a citlivosti k různým vnějším faktorům mezi vhodné modely buněčných biologů hlavní výhodou je jejich autofluorescence excitovaná UV- zářením jednoduché buňky obalené mnohovrstevnou celulózní stěnou – ochrana před nepříznivými faktory vnějšího prostředí
  4. 4.  dříve bylo pro studium vývoje mikrospor používáno histochemické barvení nebo elektronová mikroskopie jejich fluorescenci lze sledovat pod luminiscenčním mikroskopem (mikrospektrofluorimetry) konstrukce konfokálního mikroskopu umožňuje sledovat buněčné struktury režimem hloubky touto metodou lze studovat i buňky řas a některé nesekretující buňky vyšších rostlin
  5. 5.  vegetativní mikrospory přesličky rolní (Equisetum arvense) sběr v přírodních lokalitách v dubnu–květnu 1996-2001 klíčení mikrospor bylo studováno kultivací na podložním sklíčku položeném na vlhkém papíru na Petriho misce pro analýzy konfokálním mikroskopem s olejovou imerzí – mikrospory vlhčeny a poté sušeny horkým vzduchem (50-70 C) 5-7 minut (studium suchých i vlhkých vzorků) při měření s vodní imerzí nebyly používány krycí sklíčka
  6. 6.  LSM 510 NLO „Carl Zeiss“ program LSM 510 and Lucida Analyse 5 vodní i olejová imerze buzení emise: argon laser (458, 488, 514 nm) He-Ne laser (543 nm) He-Ne laser (633 nm)
  7. 7.  tři fotonasobiče zachytávaly autofluorescenci samostatně nebo současně užíváním pseudobarevných efektů excitace 488 nm – registrace autofluorescence 505-630 nm excitace 543 nm – registrace autofluorescence 565-615 nm excitace 633 nm – registrace autofluorescence 650-750 nm výsledný obrázek je superpozicí pseudobarev
  8. 8.  vzorky excitovány UV-zářením 360-380 nm analýzy mikrospektrofluorimetry – registrace fluorescenčních spekter a měření fluorescenčních intenzit pro dvě oddělené vlnové délky program „Microfluor“ – histogramy intenzit fluorescence a statistické řešení dat použitím t-testu
  9. 9.  autofluorescence intaktních buněčných povrchů pozorována luminiscenčním mikroskopem Fluoval „Carl Zeiss“ fluorescenční spektra intaktních buněk měřena mikrospektrofluorimetrem
  10. 10.  průměry optických sond: 100 μm, 20 μm, 2 μm zvětšení objektivu 10x zvětšení okuláru 7x registrační čas fluorescenčních spekter v oblasti 400-700 nm byl 22 s chyba fluorescenčního měření byla 1-2 r. j. fluorescenční intenzity mikrospor byly měřeny také duálně – vlnovým mikrospektrofluorimetrem
  11. 11.  konfokální mikroskopie - demonstrován rozdíl mezi modře fluoreskujícím obalem a červeně fluoreskujícími chloroplasty mikrospor (pigmenty, azuleny) ostatní organely – žlutá fluorescence
  12. 12.  mikrospektrofluorimetrie – střední část mikrospory má 3 maxima – 460, 550 a 680 nm (typické pro chlorofyl) obal a elatery (haptery) maximum při 680 nm nemají
  13. 13.  během vývoje mikrospor docházelo ke změnám fluorescenčních spekter i barev – vlhčení mikrospor po 15 min zesílila fluorescence chloroplastů, buňky zmohutněly a objevily se haptery chloroplasty se začaly difúzně pohybovat k buněčnému obalu po 60 min se chloroplasty pohybovaly zpět do středu buňky
  14. 14.  indikace začátku buněčného dělení po 120 min buňka odložila obal obal - maximum 460nm a rameno 500 nm uvolněná buňka - maxima 460, 550 a 680 nm, rozdělení na: mnohobuněčnou stélku (thallus) rhizoid (redukovaný počet chloroplastů)
  15. 15.  data byla korelována s histochemickým barvením při použití 6-9 syntetických barviv a biochemickými analýzami obsahu chlorofylu a azulenů během studia nedošlo k žádnému poškození mikrospor, byly schopné dále pokračovat ve svém vývoji
  16. 16.  Autofluorescence vegetativních mikrospor, produkovaných přesličkou jarní, je vhodná pro studium buněčného vývoje od jednobuněčné struktury po mnohobuněčný organismus metodami konfokální mikroskopie a mikrospektrofluorimetrie. Během studia nedochází k žádnému poškození mikrospor. Mikrospory jsou schopné dále pokračovat ve svém vývoji.
  17. 17.  ROSHCHINA, V. V., YASHIN, V. A., KONONOV, A. V., 2004: Autofluorescence of Developing Plant Vegetative Microspores Studied by Confocal Microscopy and Microspectrofluorimetry, In Journal of Fluorescence: s. 745 – 750. http://lecive-rostliny.krasne.cz/byliny/preslicka-rolni http://fotoblog.in/clanek/591 http://academicdepartments.musc.edu/ccdir/center_microscopes/center_microsco pes.htm http://cgi.benl.ebay.be/Carl-Zeiss-Jena-Fluoval-Fluoreszenz- Mikroskop_W0QQitemZ190344580729QQcmdZViewItemQQptZDE_Co mputer_Elektronik_Foto_Camcorder_Optik?hash=item2c516bce79

×