Coinvolgimento della Membrana Plasmatica e delle Proteine Citoscheletriche nell'Infertilità Maschile

Universit`a Politecnica delle Marche
DIPARTIMENTO DI SCIENZE DELLA VITA E DELL’AMBIENTE
Corso di Laurea Magistrale in Biologia Applicata
Tesi di Laurea Magistrale
Coinvolgimento della membrana plasmatica e delle proteine
citoscheletriche nell’infertilit`a maschile
Candidato:
Ilaria Catalini
Matricola 1053042
Relatore:
Prof. Giancarlo Balercia
Correlatore:
Dott.ssa Eleonora Salvolini
Anno Accademico 2013-2014

Indice
1 Introduzione 1
1.1 Spermatogenesi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.2 Spermatozoi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.3 Analisi del liquido seminale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.4 Motilità nemaspermica e astenozoospermia . . . . . . . . . . . . 7
1.5 Alterazioni del DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.5.1 Difetti di maturazione del DNA e della cromatina . . . . 9
1.5.2 Fenomeno Apoptotico e sue alterazioni . . . . . . . . . . . 10
1.5.3 Stress Ossidativo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.6 Scopo della tesi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2 Materiali e Metodi 16
2.1 Pazienti oggetto di studio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.2 Valutazione del materiale seminale . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.3 Isolamento di spermatozoi da liquido
seminale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.4 Fluidità ed idratazione di membrana . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.5 Analisi Immunoistochimica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.6 Analisi Statistica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
i

ii
3 Risultati 25
3.1 Studi di uidità ed idratazione di membrana . . . . . . . . . . . . 25
3.2 Analisi Immunoistochimica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
4 Discussione 33

Elenco delle gure
1.1 €ro™esso di sperm—togenesi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2 en—tomi— dello sperm—tozoo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.3 elter—zioni nell— morfologi— degli sperm—tozoi . . . . . . . . . . . 6
1.4 p—si dell— sostituzione delle proteine istoni™he ™on prot—mine duE
r—nte il pro™esso di sperm—togenesi . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.5 i'etto dei r—di™—li li˜eri — livello ™ellul—re . . . . . . . . . . . . . 13
2.1 ƒonde h€r e „weEh€r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.2 ƒonde h€r e „weEh€r in rel—zione —ll— mem˜r—n— pl—sm—ti™— 21
2.3 ƒond— v—urd—n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.1 enisotropi— di )uores™enz— delle sonde „weEh€r e h€r . . . . 26
3.2 €ol—rizz—zione gener—lizz—t— medi—nte utilizzo dell— sond— v—urd—n 27
3.3 ispressione immunoisto™himi™— di izrin . . . . . . . . . . . . . . 28
3.4 ispressione immunoisto™himi™— di gd™RP . . . . . . . . . . . . . 29
3.5 ispressione immunoisto™himi™— di ghW . . . . . . . . . . . . . . 30
3.6 ispressione immunoisto™himi™— dell— pE—™tin— . . . . . . . . . . 31
3.7 ispressione immunoisto™himi™— dell— βEtu˜ulin— . . . . . . . . . 32
iii

ELENCO DELLE TABELLE iv
Elenco delle tabelle
1.1 gonfronto p—r—metri semin—li ‡ry IWWWEPHIH . . . . . . . . . . 5
3.1 gonfronto espressione immunoisto™himi™— di izrinF . . . . . . . . 28
3.2 gonfronto espressione immunoisto™himi™— di gd™RP . . . . . . . 29
3.3 gonfronto espressione immunoisto™himi™— di ghW . . . . . . . . 30
3.4 gonfronto espressione immunoisto™himi™— dell9 pE—™tin— . . . . . 31
3.5 gonfronto espressione immunoisto™himi™— dell— βEtu˜ulin— . . . . 32

Sommario
L'infertilità di coppia rappresenta un importante problema medico e sociale.
Almeno la metà delle sue cause è da ricercare nel maschio. I soggetti infertili
possono essere caratterizzati da un ridotto numero di spermatozoi, da una ri-
dotta motilità, da un'alterata morfologia nemaspermica o da un insieme di tutti
questi fattori. Tra di essi la motilità spermatica rappresenta una condizione
necessaria ai ni della fertilizzazione e quindi uno dei principali determinanti
dell'infertilità maschile. Sulla base di ciò il seguente studio ha posto l'attenzio-
ne sull'analisi dell'astenozoospermia di tipo idiopatico, condizione caratterizzata
da una riduzione della percentuale di spermatozoi mobili le cui cause possibili
non sono individuabili. Pertanto inizialmente verrà introdotta una panoramica
sull'analisi del liquido seminale e sulle cause che possono alterarne i principa-
li parametri. Verrà poi presentata la popolazione oggetto di studio. Quindi
verranno esposte le tecniche attraverso le quali sono state eettuate l'analisi
del liquido seminale e l'isolamento degli spermatozoi. Poi saranno esaminate
le caratteristiche chimico-siche della membrana plasmatica dello spermatozoo
e verrà determinata l'espressione immunoistochimica di proteine transmembra-
na e citoscheletriche coinvolte nella fertilizzazione. Inne verranno riportati i
risultati che saranno discussi, alla luce di quanto riportato nora in letteratura.
v

1Introduzione
Le cause di infertilità sono da ricondurre per un buon 40% ad un decit della
componente maschile, mentre per il 20% circa ad una sovrapposizione di fattori
maschili e femminili. Da qui possiamo rilevare che il 60% dell'infertilità è di
natura maschile. I soggetti infertili possono essere caratterizzati da un ridot-
to numero di spermatozoi, da una ridotta motilità, da un'alterata morfologia
nemaspermica o da un insieme di tutti questi fattori. Negli ultimi dieci anni
la misurazione dell'integrità della struttura della cromatina negli spermatozoi è
stato oggetto di numerosi studi che hanno evidenziato come un'eccessiva fram-
mentazione del DNA spermatico comprometta la fertilità maschile. Infatti si è
visto che, spermatozoi con normali parametri tradizionali ma con anomalie a
livello genomico, dicilmente sono in grado di determinare un concepimento.
1.1 Spermatogenesi
Il gamete maschile è lo spermatozoo, prodotto attraverso il processo di sper-
matogenesi [1]. Le cellule spermatiche (sperm—tozoi) sono prodotte nei testi-
coli, che contengono le cellule germinali progenitrici (sperm—togoni prim—ri).
Attraverso il processo mitotico le cellule germinali progenitrici producono gli
sperm—togoni se™ond—ri. Gli spermatogoni si trasformano in sperm—to™iti priE
m—ri, ognuno dei quali subisce una meiosi I dando origine a due sperm—to™iti
1

CAPITOLO 1. INTRODUZIONE 2
se™ond—ri. Ogni spermatocita secondario va incontro alla meiosi II e il risulta-
to di queste due divisioni sono quattro sperm—tidi aploidi che si dierenziano
successivamente nei gameti maturi, gli sperm—tozoi (Figura 1.1).
Figura 1.1: €ro™esso di sperm—togenesi
1.2 Spermatozoi
Lo spermatozoo maturo, derivante dal processo di spermatogenesi, presenta
una test— e una ™od—; quest'ultima è a sua volta costituita da un pezzo di
connessione o collo, una porzione intermedia, una principale ed una terminale
(Figura 1.2).

Figura 1.2: en—tomi— dello sperm—tozoo
La testa dello spermatozoo maturo risulta appiattita e appuntita. All'inter-
no essa è costituita da due parti: il nucleo contenente cromatina ed il cappuccio
acrosomico che lo riveste. La cromatina nucleare è condensata e interrotta solo
occasionalmente da zone eucromatiche, più chiare. Il cappuccio acrosomico è
posto a ricoprire tra i due terzi e i tre quarti del nucleo; esso contiene numerosi
enzimi tra cui proteasi, fosfatasi acida, neuroaminidasi, ialuronidasi e può esse-
re considerato come un lisosoma gigante specializzato. Gli enzimi acrosomiali
vengono rilasciati quando lo spermatozoo prende contatto con la cellula uovo
e facilitano la penetrazione della testa dello spermatozoo attraverso la corona
radiata e la zona pellucida dell'oocito. La coda di uno spermatozoo maturo è
costituita da un agello molto lungo che termina poco prima della testa in cor

rispondenza di una particolare zona chiamata piastra basale. La coda presenta
caratteristiche morfologiche dierenti lungo il suo decorso, caratteristiche che
rendono necessaria la suddivisione della sua struttura in quattro parti: regione
del collo, porzioni intermedia, principale e terminale. Lungo la coda decorre
l'assonema, che è responsabile della motilità degli spermatozoi; esso è la strut-
tura portante di ciglia e agelli e presenta la classica organizzazione 9 + 2 (2
microtubuli centrali circondati da 9 coppie di microtubuli periferici). La parte
prossimale della coda è detta collo. Si tratta di un segmento ristretto che contie-
ne una coppia di centrioli e il pezzo di connessione, dal quale si dipartono i nove
anelli brosi che circondano l'assonema. L'assonema è situato nel centro della
porzione intermedia; si trova tra le nove bre dense longitudinali che partono dal
pezzo di connessione del collo e presenta una zona esterna ricca di mitocondri
allungati strettamente impaccati. La funzione dei mitocondri è quella di utiliz-
zare il fruttosio e il glucosio presenti nel liquido seminale per produrre energia
sotto forma di ATP, al ne di consentire il movimento dello spermatozoo. Il
passaggio alla porzione principale è segnato da un brusco restringimento, a vol-
te associato ad un ispessimento anulare della membrana cellulare, l'annulus. La
porzione principale è la parte più lunga della coda e comprende l'assonema cir-
condato dalle nove bre dense longitudinali, che sono a loro volta racchiuse da
numerose bre di rivestimento disposte circolarmente. Siccome una delle bre
longitudinali anteriori e una di quelle posteriori sono fuse con le bre circolari,
le sette rimanenti sono distribuite asimmetricamente, quattro in un comparti-
mento laterale e tre nell'altro. Nella giunzione tra la porzione principale e quella
terminale, le bre longitudinali e circolari si interrompono, per cui la porzione
terminale della coda è composta dal solo assonema [2].
1.3 Analisi del liquido seminale
Lo spermiogramma è l'analisi del liquido seminale nalizzata a valutare la
qualità degli spermatozoi, attraverso la verica della forma, del numero e del-

la motilità. Tale esame rappresenta lo strumento principale per la valutazione
della fertilità maschile. Come riportato dalla rivista Annali dell'Istituto Supe-
riore di Sanità (2001) [3], lo spermiogramma è tra gli esami di laboratorio che
si distingue per il signicato particolare che si associa ai valori normali dei
vari parametri che misurano la qualità dello sperma: infatti, normalità non
implica necessariamente fertilità, dal momento che molte delle caratteristiche
funzionali che contribuiscono a denire la fertilità non sono ancora oggi ben
conosciute. La complessità dello spermiogramma è cresciuta a tal punto da in-
durre la World Health Organization (WHO) nel 1980 a promuovere alcune linee
guida per la standardizzazione delle indagini per lo studio di base del liquido
seminale e per la descrizione ed interpretazione dei risultati ottenuti; linee guida
che periodicamente vengono tenute al passo dei progressi nel settore, attraver-
so aggiornamenti successivi. Nel 2010 è stato redatto un nuovo Manuale di
Laboratorio per l'Esame del Liquido Seminale [4] che ha apportato importan-
ti aggiornamenti sui parametri di riferimento del liquido seminale rispetto alle
precedenti edizioni. Nella Tabella 1.1 vengono riportati i parametri seminali
relativi al 1999 e al 2010.
Valori WHO 1999 WHO 2010
N◦
Spermatozoi/ml ≥ 20 · 106
≥ 15 · 106
Motilità Progressiva ≥ 50% ≥ 32%
Morfologia ≥ 30% ≥ 4%
Tabella 1.1: gonfronto p—r—metri semin—li ‡ry IWWWEPHIH
Per quanto riguarda la motilità, un sistema semplice di classicazione pre-
vede la distinzione degli spermatozoi in progressivi, non-progressivi e immobili:
• motilità progressiva (PR): lo spermatozoo si muove attivamente, in modo
lineare o in un ampio circolo, indipendentemente dalla velocità;
• motilità non-progressiva (NP): comprende tutti gli altri tipi di motilità in
cui non c'è progressione nello spazio, per esempio movimenti che descrivo-
no piccoli circoli oppure quando l'onda agellare riesce a spostare appena
la testa o ancora quando si osserva soltanto il movimento agellare;

• immobilità (IM): nessun movimento.
Per quanto riguarda la morfologia, perché uno spermatozoo possa essere
considerato normale è necessario che siano normali la testa, il collo, il tratto
intermedio e la coda (Figura 1.3)
Figura 1.3: elter—zioni nell— morfologi— degli sperm—tozoi
Dal momento che spesso è dicile descrivere con parole o numeri tutte le
alterazioni dei parametri seminali, è stata introdotta una terminologia per in-
dicarne i tipi principali [5], come riportato nel Manuale di laboratorio della
WHO. E' importante precisare che essa ha solo un valore descrittivo per le va-
riabili seminali e non indica nessuna relazione causale. Fatta questa premessa,
la terminologia dovrebbe essere così utilizzata:
• Oligozoospermia: concentrazione spermatica inferiore ai valori di riferi-
mento
• Astenozoospermia: motilità inferiore ai valori di riferimento
• Teratozoospermia: morfologia non conforme ai valori di riferimento
Possiamo trovare anche combinazioni di queste, come ad esempio l'oligoa-
stenospermia, in cui oltre ad avere una concentrazione spermatica inferiore ai
valori di riferimento, gli spermatozoi presentano anche valori di motilità inferiori

ai valori di riferimento, no ad arrivare all'oligoastenoteratospermia (OAT) in
cui tutti e tre le variabili sono alterate e quindi al di sotto dei valori di riferi-
mento. In ultimo si può aggiungere l'azoospermia, cioè l'assenza di spermatozoi
nell'eiaculato e l'aspermia, cioè l'assenza di eiaculato. Con l'introduzione dei
nuovi valori di riferimento, soprattutto relativamente alla morfologia e alla mo-
tilità degli spermatozoi, sono stati forniti più frequentemente referti di normo-
spermia per liquidi seminali che prima risultavano oligoastenozoospermici e/o
teratozoospermici.
1.4 Motilità nemaspermica e astenozoospermia
La motilità spermatica rappresenta uno dei principali determinanti dell'in-
fertilità maschile ed una condizione necessaria ai ni della fertilizzazione. Con il
termine motilità si indicano fondamentalmente due concetti dierenti: la moti-
lità progressiva e la percentuale totale di spermatozoi dotati di movimento. La
valutazione della motilità viene espressa come percentuale totale di spermatozoi
mobili (aspetto quantitativo) e come percentuale delle diverse categorie cinetiche
(aspetto qualitativo inteso come tipo di velocità e direzione degli spermatozoi
mobili). È noto che gli spermatozoi testicolari nelle prime fasi successive alla
spermioistogenesi sono immobili. Gli spermatozoi acquisiscono la capacità di
movimento durante il transito attraverso l'epididimo. Infatti, in seguito all'in-
terazione con le cellule ciliate dell'epitelio epididimario e con il loro secreto,
essi vanno incontro soprattutto a modicazioni a carico della membrana cito-
plasmatica e ad un graduale sviluppo della motilità durante la progressione del
gamete dalla testa alla coda dell'epididimo [6]. Gli spermatozoi sono in grado
di eettuare movimenti di tipo diverso, che si adattano alle diverse esigenze
funzionali. Gli spermatozoi eiaculati infatti, nel plasma seminale, mostrano una
traiettoria lineare che corrisponde a quella presente durante la penetrazione nel
muco cervicale. Una volta che lo spermatozoo abbandona il plasma seminale e
inizia la sua risalita lungo le vie genitali femminili, le caratteristiche di moti-

lità cambiano. Quando avviene la capacitazione o poco prima, l'ampiezza del
movimento del agello aumenta e lo spermatozoo inizia una traiettoria con uno
spostamento laterale della testa più pronunciato, si parla di stato transizionale
[7]. Quando ha realmente inizio la capacitazione, l'ampiezza dell'onda agel-
lare diventa asimmetrica, dando luogo ad un movimento non più progressivo
ma vigoroso, noto come iperattivazione. Questa forma di motilità è tipica degli
spermatozoi totalmente capacitati e si pensa che fornisca allo spermatozoo la
forza necessaria per attraversare la zona pellucida [8]. È stato dimostrato che
il contatto delle cellule apicali della tuba con gli spermatozoi ore un prolun-
gamento della durata della motilità, con incremento della velocità progressiva e
ritardo della capacitazione [9]. Si parla di astenozoospermia laddove ci si trovi
di fronte ad una riduzione della percentuale di spermatozoi mobili. Nel caso in
cui non sia possibile individuare cause speciche di tale riduzione, si parla di
astenozoospermia di tipo idiopatico. Nonostante le strutture cellulari coinvolte
nello sviluppo e nel mantenimento della motilità dello spermatozoo siano state
ampiamente identicate, i meccanismi molecolari alla base di questa funzione e
la loro concatenazione temporale e spaziale non sono stati del tutto chiariti [10].
1.5 Alterazioni del DNA
Come descritto da Schulte et al. (2010) [11] ci sono una varietà di fattori
eziologici associati al danno del DNA degli spermatozoi e/o che comprometto-
no l' integrità della cromatina. Queste cause sono molteplici e dipendono da
condizioni ambientali come fumo di sigaretta, agenti chemioterapici, radiazioni,
esposizione a pesticidi, o da fattori intrinseci come leucocitospermia, varicocele,
cancro, eventi iatrogeni. I meccanismi attraverso i quali questi fattori portano
anomalie a livello del DNA e/o cromatina degli spermatozoi non sono ancora
chiari, tuttavia possiamo elencare tre diverse condizioni di danno al DNA dovute
a:
1. difetti di maturazione

2. alterazioni del fenomeno apoptotico
3. stress ossidativo
1.5.1 Difetti di maturazione del DNA e della cromatina
A dierenza delle cellule somatiche, la cromatina dello spermatozoo è mol-
to più compatta, condensata, altamente organizzata e possiede una struttura
molto stabile [11]. Ciò consente al genoma paterno di essere protetto durante
il trasporto attraverso i dotti riproduttivi maschili e femminili e di raggiunge-
re, in un secondo momento, la cellula uovo in condizioni ottimali. Inoltre tale
struttura assicura che il DNA sia consegnato in una forma sica e chimica tale
da permettere all'embrione in via di sviluppo di accedere facilmente all'infor-
mazione genetica. Durante il processo di spermatogenesi, la cromatina degli
spermatozoi va incontro ad una serie di cambiamenti in cui gli istoni vengono
sostituiti con proteine di transizione e in ultimo con protamine (nell'uomo sono
di due tipi prevalenti: PRM1 e PRM2)(Figura 1.4). Le protamine sono proteine
basiche a basso peso molecolare e ad alto contenuto di arginina e cisteina, che
vanno a costituire il componente proteico più abbondante nel nucleo spermatico
[12]. I domini di arginina sulle protamine inducono la doppia elica del DNA
ad assumere una struttura toroidale, in maniera indipendente dalla sequenza
nucleotidica. Ogni molecola di protamina viene avvolta da una spira di DNA,
di circa 11 bp, intercalando prevalentemente il solco minore dell'elica [13]. Lo
spermatozoo maturo dell'uomo, dierenziato terminalmente, è caratterizzato da
un materiale genetico circa 6 volte più compatto di un cromosoma mitotico e
occupa un volume 40 volte inferiore a quello di una cellula somatica tipica. In
pratica, 1 m di DNA lineare nudo viene accomodato in un nucleo lungo circa
2 µm contenente circa 300 milioni di protamine. Se la quantità e il rappor-
to tra istoni e protamine non viene rispettato, il DNA degli spermatozoi può
essere più facilmente soggetto ad attacchi di varia natura che ne alterano la
struttura e quindi la funzionalità. Il rapporto fra protamine e istoni nell'uomo

è costante ed è di circa 85 : 15. Nell'uomo anche il rapporto fra le protami-
ne 1 e 2 (P1/P2) deve essere costante [14]. Negli individui fertili il rapporto
P1/P2 è compreso tra 0, 8 e 1, 2 mentre alterazioni di tale rapporto sono state
osservate negli uomini infertili. In particolare nei pazienti infertili si rilevano so-
prattutto bassi livelli di P2 e rapporti P1/P2 incrementati rispetto ai controlli
fertili. Tuttavia esiste una quota di pazienti caratterizzati da un basso rapporto
P1/P2. Questi dati suggeriscono l'esistenza di una relazione diretta tra de-
cit protaminico ed infertilità maschile, infatti, l'alterata espressione di queste
due proteine provoca l'insorgenza di difetti nel processo spermatogenetico, con
un'incompleta condensazione cromatinica del nucleo dello spermatozoo e una
mancata progressione nella linea spermatogenetica. In conclusione, un alterato
rapporto fra istoni e protamine, fra le stesse protamine e la presenza di tagli
(nicks) a livello del DNA dello spermatozoo, dovuti alla mancata riparazione
da parte della topoisomerasi, compromettono la capacità dello spermatozoo di
fecondare l'uovo. In realtà l'ovocita è in grado di riparare eventuali danni del
DNA dello spermatozoo penetrato al suo interno, ma solo se questi sono di lieve
entità.
1.5.2 Fenomeno Apoptotico e sue alterazioni
Un'altra teoria relativa al danno a livello del DNA degli spermatozoi è as-
sociata all'apoptosi abortiva, come descritto da Schulte et al. (2010) [11]. Si
denisce apoptosi quel processo di morte programmata che avviene in tutte le
cellule del corpo. Nel testicolo, il processo apoptotico avviene normalmente,
al ne di prevenire una sovrapproduzione di cellule germinali e di eliminare
selettivamente le cellule germinali non funzionali. Ciò è essenziale in quanto
le cellule del Sertoli sono in grado di contenere un numero limitato di cellule
germinali nel testicolo. Dunque l'apoptosi delle cellule germinali è un processo
che avviene normalmente e continuamente nel corso della vita [15]. Il norma-
le processo apoptotico è innescato tramite l'interazione del ligando Fas (FasL),
secreto dalle cellule del Sertoli, con la proteina Fas localizzata sulla supercie

Figura 1.4: p—si dell— sostituzione delle proteine istoni™he ™on prot—mine
dur—nte il pro™esso di sperm—togenesi
esterna della cellula germinale. La proteina Fas appartiene alla superfamiglia
dei recettori TNF (fattore di necrosi tumorale). Il ligando FasL è una protei-
na transmembrana ed anch'esso fa parte della famiglia dei TNF. L'interazione
ligando-recettore si risolve nella formazione di un complesso di segnalazione che
induce la morte cellulare. Dagli studi di Sakkas et al. (1999) [15] si evince che il
ruolo della proteina Fas durante la spermatogenesi non è ancora chiaro. Tutta-
via diversi studi evidenziano che l'apoptosi si verica durante la spermatogenesi.
Ciò però non sempre accade. Si è visto infatti che gli spermatozoi con DNA
frammentato e che esprimono a livello della loro membrana il recettore Fas van-

no incontro ad un processo di apoptosi abortiva, in cui gli spermatozoi iniziano
il processo apoptotico ma poi sfuggono a quest'ultimo. Per valutare la presenza
di corpi apoptotici può essere utilizzata la citometria a usso, che mostra una
popolazione apparentemente ipodiploide per ridotta capacità del DNA di legare
il colorante (ioduro di propidio o altri) o per eettiva riduzione del contenuto
di DNA.
1.5.3 Stress Ossidativo
Il danno a livello del DNA degli spermatozoi può essere associato anche ad
alti livelli di Specie Reattive dell'Ossigeno (ROS). Lo stress ossidativo è deter-
minato da uno squilibrio tra la produzione e l'eliminazione delle ROS da parte
del nostro sistema di difesa antiossidante. Le ROS sono una categoria di piccole
molecole, molto reattive [16]. Esse derivano, normalmente, dall'ossigeno du-
rante il processo di produzione dell'energia cellulare e sono divisibili in radicali
(ione idrossile, superossido, monossido d'azoto) e non radicali (ozono, perossido
di idrogeno). Diversi fattori esterni e speciche condizioni cliniche possono in-
crementare la produzione di ROS: particolari stili di vita (fumo, alcool, droghe),
inquinamento ambientale ed alimentare (radiazioni, smog, gas industriali, dieta
sbilanciata ricca di grassi), patologie come inammazioni, traumi, infezioni. Po-
tenziali obiettivi delle ROS sono componenti cellulari come lipidi, proteine, acidi
nucleici e zuccheri (Figura 1.5). L'entità del danno indotta dalle ROS dipende
non solo dalla natura e dalla quantità di ROS coinvolta, ma anche dalla durata
dell'esposizione alle ROS stesse.
1.6 Scopo della tesi
Qualsiasi eiaculato presenta dierenti tipi di cellule in grado di produrre
ROS, come gli spermatozoi maturi e immaturi, i leucociti e le cellule epiteliali.
Tra queste, i leucociti e gli spermatozoi sono considerati essere le due princi-
pali fonti di ROS. Piccole quantità di ROS possono avere un ruolo siologico,

Figura 1.5: i'etto dei r—di™—li li˜eri — livello ™ellul—re
risultando necessarie per lo spermatozoo nell'acquisizione della capacità fecon-
dante. L'incubazione degli spermatozoi con basse dosi di ROS, infatti, stimola
la capacitazione, l'iperattivazione, la reazione acrosomiale e l'interazione con l'o-
vocita [17]. D'altro canto livelli eccessivi di ROS determinano una bassa qualità
del seme e generalmente uno stato di stress ossidativo spermatico che produ-
ce dei danni. In particolare le ROS possono causare infertilità attraverso due
meccanismi principali:
1. danni al DNA degli spermatozoi: quando il grado del danno al DNA
è basso, gli spermatozoi possono andare incontro ad una riparazione ed
inoltre lo stesso ovocita può riparare il danno al DNA dello spermatozoo,
una volta che esso è entrato al suo interno;
2. danni alla membrana spermatica che riducono la motilità e la capacità di
fusione con l'ovocita.

Se il danno è estensivo si può vericare una diminuzione della percentuale
di fecondazione, una bassa qualità dell'embrione e un rischio di abortività. I ra-
dicali liberi possono causare la rottura dei lamenti di DNA ed essere causa di
alterazioni cromosomiche (Azione Mutagena) attraverso l'attivazione di enzimi
come caspasi ed endonucleasi. Il danno al DNA indotto dalle ROS può accelerare
il processo di apoptosi e provocare una riduzione del numero degli spermato-
zoi. La frammentazione è un evento post-testicolare e può comportare anomalie
morfologiche che si evidenziano con la presenza di residui citoplasmatici nel col-
lo del gamete maschile. Inoltre le ROS possono reagire con gli acidi grassi dei
fosfolipidi che costituiscono la membrana plasmatica, inuenzando così la ui-
dità della membrana stessa e causando conseguentemente un danno funzionale
agli spermatozoi, anche se è stato suggerito che livelli elevati di ROS non inter-
feriscono sulla spermatogenesi. Dagli studi eettuati negli ultimi dieci anni [18]
viene evidenziato come il danno a livello della membrana spermatica avvenga
in seguito alla perossidazione lipidica della membrana stessa, che è particolar-
mente ricca di acidi grassi polinsaturi (PUFA). Questa particolare ricchezza di
acidi grassi insaturi della membrana spermatica rende gli spermatozoi parti-
colarmente suscettibili al danno perossidativo causato dall'attacco delle ROS.
Tale perossidazione lipidica provoca una riduzione della uidità e della stabilità
della membrana ed una riduzione della motilità. Ciò ha un eetto negativo sui
meccanismi della fertilizzazione dell'ovocita maturo da parte dello spermatozoo.
Infatti, la struttura della membrana plasmatica ha una grande importanza per
il successo della fecondazione, dato che la capacitazione, la reazione acrosomiale
(AR) e la fusione spermatozoo-uovo sono eventi associati alla membrana. Per
quanto riguarda la capacitazione degli spermatozoi, è stato suggerito l'interven-
to della ezrina, che rappresenta la più nota proteina della famiglia ERM, alla
quale appartengono anche la radixina e la moesina. Tale proteina potrebbe con-
tribuire al rimodellamento della membrana dello spermatozoo, poiché collega il
citoscheletro corticale con le proteine di membrana. L'ezrina è coinvolta anche
nell'attivazione della Rho GTPasi, promuovendo la polimerizzazione dell'acti-

na. Le proteine ERM sono inoltre indirettamente collegate ad altre proteine, le
tetraspanine. In particolare, la tetraspanina CD9 è essenziale per l'interazione
spermatozoo-oolemma. Le Rho GTPasi (come RhoA, Rac1 e Cdc42) sembra-
no essere implicate anche nella reazione acrosomiale, un evento fondamentale
per la fecondazione. Inoltre, Cdc42 è coinvolta nello stabilimento della polarità
cellulare in diversi citotipi. L'acquisizione della polarità cellulare è un requisito
importante per la formazione di spermatozoi vitali. Anche l'actina, insieme ad
altre proteine citoscheletriche, come la tubulina, sembra essere implicata nella
regolazione della capacitazione e della reazione acrosomiale, nonché nella motili-
tà degli spermatozoi. Sulla base delle conoscenze sopra citate lo scopo di questa
tesi è stato quello di isolare spermatozoi umani da donatori fertili normospermici
e da soggetti infertili aetti da astenozoospermia idiopatica al ne di valutare le
caratteristiche sico-chimiche della membrana plasmatica mediante spettrosco-
pia di uorescenza. Inoltre è stata valutata l'espressione immunoistochimica di
proteine transmembrana e citoscheletriche coinvolte nella regolazione della ca-
pacitazione, della reazione acrosomiale e nella motilità degli spermatozoi come
ezrina, CD9, Cdc42, F-actina, e β-tubulina.

2Materiali e Metodi
2.1 Pazienti oggetto di studio
Sono stati reclutati ed inclusi nello studio 25 uomini infertili, di età compresa
tra i 34 e i 47 anni. Tali pazienti sono da considerare infertili poiché incapaci
di iniziare una gravidanza dopo un periodo di tempo ≥ 18 mesi di rapporti non
protetti. Ventuno uomini fertili, della stessa fascia di età, hanno rappresenta-
to il nostro gruppo di controllo. I campioni di sperma sono stati ottenuti con
la masturbazione facendo attenzione alle condizioni igieniche e raccogliendo il
campione in contenitori di plastica sterili. Il paziente deve aver osservato un
periodo di astinenza sessuale dai tre ai cinque giorni. Un intervallo di tempo
più breve, diminuisce la concentrazione degli spermatozoi, un periodo più lungo,
ne diminuisce la motilità. Se il campione non è raccolto in un'apposita stanza
nei pressi del laboratorio, è importante che esso venga consegnato in labora-
torio entro un'ora, cercando di mantenere il contenitore ad una temperatura
di 20◦
− 40◦
C, questo per evitare una diminuzione della motilità. Il campione
deve essere etichettato con un numero di identicazione e con la data e l'ora
della raccolta. Non appena emesso, il liquido seminale coagula per poi liquefarsi
nuovamente dopo trenta, sessanta minuti a temperatura ambiente. Campioni
normali di liquido seminale possono contenere granuli gelatinosi (corpi amila-
cei) che non si liquefanno e che non sembrano avere nessuna rilevanza clinica.
16

CAPITOLO 2. MATERIALI E METODI 17
La presenza di strie di muco, segno di incompleta liquefazione, può interferire
con l'esecuzione dell'analisi seminale. Il campione deve essere ben mescolato
nel contenitore dove è avvenuta la raccolta, ma non deve essere agitato ecces-
sivamente. Una delicata miscelazione continua o una rotazione del campione,
durante la liquefazione, possono ridurre gli errori nel determinare la concen-
trazione degli spermatozoi [19]. Dopo la liquefazione, sono stati determinati il
volume ed il pH dello sperma e la concentrazione, la vitalità, la motilità e la
morfologia degli spermatozoi, sulla base delle linee guida per l'esame e il tratta-
mento dello liquido seminale emesse dall'Organizzazione Mondiale della Sanità
(World Health Organization = WHO). Per essere inclusi nello studio i soggetti
dovevano mostrare una morfologia degli spermatozoi normale (forme normali
4%) e una concentrazione di globuli bianchi nel liquido seminale inferiore
a 1 · 106
/mL. Quest' ultima sta ad indicare che non sono presenti eventuali
infezioni ed inammazioni. L'esame colturale, inoltre, ha evidenziato l'assenza
di infezioni alle vie genitali i cui microrganismi responsabili sono: ghl—mydi—,
wy™opl—smi ed intero˜—tteri ‚outin—ri—menter. Allo stesso modo ha dato esi-
to negativo il MAR test (test di agglutinazione mista) che valuta la presenza
di anticorpi adesi agli spermatozoi. Infatti, in seguito a traumi o infezioni la
resistenza della barriera emato-testicolare viene alterata, dando origine ad una
reazione autoimmunitaria nei confronti degli spermatozoi contenuti nel testico-
lo, con produzione di auto-anticorpi rivolti contro gli spermatozoi del paziente.
L'anticorpo che lega lo spermatozoo ha un eetto immobilizzante quando si le-
ga a livello della coda e promuove la comparsa di agglutinazioni. Inoltre può
impedire la penetrazione dello spermatozoo nell'ovocita nel caso in cui si leghi
alla testa dello spermatozoo [20]. Allo stesso modo anche il dosaggio ormonale è
risultato normale. Inne, sono state escluse anche anomalie anatomiche del trat-
to genitale, varicocele, torsione testicolare ed infezioni del tratto genitale, così
come malattie sistemiche nei tre mesi precedenti all'analisi. Sono stati esclusi
dallo studio i soggetti aetti da diabete mellito, ipertensione e dislipidemia, i
fumatori, i bevitori ed i tossicodipendenti. Dal momento che nessuno dei fattori

presi in esame è responsabile dell'alterazione della motilità degli spermatozoi, si
può parlare di astenozoospermia idiopatica.
2.2 Valutazione del materiale seminale
Per ogni paziente sono state eseguite due analisi complete per la valutazione
del volume, del numero di spermatozoi, della vitalità, della motilità e della mor-
fologia sulla base delle linee guida della WHO. L'analisi del materiale seminale è
stata eseguita mediante sistemi computerizzati di analisi delle immagini (sistemi
CASA) che consentono di valutare il movimento del agello, l'ampiezza dell'on-
da agellare, la velocità di propagazione e la frequenza del battito del agello.
Sono disponibili speciche camere di conta da impiegare nei sistemi CASA. Una
camera dello spessore di 20 µm Microcell (Conception Technologies) è in grado
di fornire risultati ottimali nell'analisi del liquido seminale. Un'aliquota di sper-
ma (3 µL) è stata quindi inserita nella camera di conta. Sono state caricate due
camere e sono stati esaminati diversi campi: 6 campi per settore sono necessari
per un risultato adabile. Sono stati analizzati un numero di spermatozoi
≥ 200 per ogni settore. La misurazione dei parametri del movimento spermatico
è stata eettuata con l'Analizzatore del Liquido Spermatico WLY 9000-CGA.
Tali parametri sono:
• †elo™ità: per la descrizione della motilità si utilizzano tre valori: velocità
curvilinea (VCL), velocità rettilinea (VSL) e velocità media (VAP).Ciascuna
delle tre descrive un aspetto dierente della progressione nemaspermica.
La VCL è la distanza che compie lo spermatozoo lungo la sua traiettoria,
e viene calcolata con la somma delle distanze nel corso del tempo. La VSL
viene determinata calcolando la distanza in linea retta tra il primo e l'ul-
timo punto nel percorso dello spermatozoo. La VAP indica la longitudine
di una traiettoria nemaspermica.
• vine—rità: esprime la relazione tra la proiezione bidimensionale della tra-
iettoria di uno spermatozoo e lo spazio guadagnato, calcolato come:

V SL
V CL
· 100 (2.1)
Una traiettoria circolare, per esempio, avrà una ridotta linearità.
• ‚ettilineità: fornisce l'indicazione della relazione tra lo spazio netto gua-
dagnato e la traiettoria generale dello spermatozoo, calcolato come:
V SL
V AP
· 100 (2.2)
• empiezz— dei movimenti l—ter—li dell— test— @evrA: viene calcolata come
un'approssimazione del battito del agello.
• prequenz— del ˜—ttito @fgpA: dal momento che ogni avanzamento presup-
pone un ulteriore battito agellare, la BCF denisce il numero dei battiti
del agello dello spermatozoo, supponendo una rotazione come inizio del
battito.
Questi parametri deniscono con precisione le caratteristiche della motilità
nemaspermica. A partire da questi parametri è possibile discriminare oggettiva-
mente uno spermatozoo maturo da uno immaturo, uno mobile da uno immobile,
uno con movimenti lenti e irregolari da uno con velocità elevata e moto lineare.
2.3 Isolamento di spermatozoi da liquido
seminale
La separazione degli spermatozoi dal plasma seminale per ottenere un cam-
pione contenente un'alta percentuale di spermatozoi morfologicamente normali
e mobili, privo di detriti e spermatozoi morti, è stata eettuata utilizzando i
gradienti di densità. La tecnica utilizzata in questo caso è quella su gradienti di
Percoll discontinui. Brevemente il Percoll è stato reso isotonico mediante l'ag-
giunta di 1 volume di NaCl 1, 5 mol/L tamponato con HEPES 0, 1 mol/L, pH

7, 4 a 9 volumi di Percoll. Sono poi state preparate due dierenti concentrazioni
di Percoll, una all'80% ed una al 40%, diluendo la soluzione isotonica con Hu-
man Tubal Fluid Medium (Irvine Scientic) in Hepes 0, 01 mol/L. Inne è stato
straticato un millilitro di liquido seminale liquefatto al di sopra del gradiente
di Percoll ed è stato centrifugato a 500 g per 20 minuti. Gli spermatozoi che
costituiscono il pellet sono stati poi risospesi in PBS (0, 1 mol/L) a pH 7.4.
2.4 Fluidità ed idratazione di membrana
La uidità di membrana è stata valutata determinando l'anisotropia di uo-
rescenza (inversamente proporzionale alla uidità di membrana) di due sonde:
1, 6 − difenil − 1, 3, 5 − esatriene (DPH), 1 − [4 − (trimetilammonio)fenil] −
6 − fenil − 1, 3, 5 − esatriene (TMA-DPH) (Figura 2.1).
Figura 2.1: ƒonde h€r e „weEh€r
La sonda uorescente TMA-DPH si lega all'interfaccia acqua-lipidi del

doppio strato della membrana plasmatica, mentre il DPH è una sonda idrofobica
(Figura 2.2).
Figura 2.2: ƒonde h€r e „weEh€r in rel—zione —ll— mem˜r—n— pl—sm—ti™—
In particolare gli spermatozoi sono stati sospesi in tampone fosfato 0, 03
M a pH 7.8 (1900 ml) ed incubati con 3 µL della sonda TMA-DPH e DPH
rispettivamente per 5 minuti e 45 minuti a temperatura ambiente. Le intenstà
di uorescenza delle componenti verticali ed orizzontali della luce emessa sono
state misurate con uno spettrofotometro Perkin-Elmer MPF66 ( λ d'eccitazione
= 365 nm, λ d'emissione = 430 nm). L'anisotropia di uorescenza statica del
TMA-DPH e del DPH, in condizioni di equilibrio, viene calcolata usando la
seguente formula:
r =
IV G − Ih
IV + 2Ih
(2.3)
Dove G è un fattore strumentale che corregge il valore r per un diverso rileva-
mento della luce polarizzata verticale (IV ) ed orizzontale (Ih). L'anisotropia di
uorescenza è inversamente correlata alla uidità della membrana che circonda

le sonde uorescenti [21]. La sonda 6−dodecanoil−2−dimetil−aminonaftalene
(Laurdan) è stata invece utilizzata per lo studio dell' idratazione della membrana
plasmatica degli spermatozoi. (Figura 2.3)
Figura 2.3: ƒond— v—urd—n
In particolare gli spermatozoi sono stati sospesi in tampone HEPES 50 mM,
pH 7.4, contenente NaCl (125 mM). Le cellule sono state incubate con la sonda
Laurdan in DMSO (0, 2 µmol/L) per 15 minuti a 37◦
C [22]. L'idratazione è
stata valutata considerando le modicazioni della polarizzazione generalizzata
(GP). Il valore di GP è stato calcolato utilizzando l'equazione:
GP =
1430 − 1480
1430 + 1480
(2.4)
dove I430 e I480 sono le intensità di uorescenza registrate rispettivamente
alle lunghezze d'onda di emissione di 430 e 480 nm (lunghezza d'onda di ecci-
tazione: 350 nm). Il valore di GP che si ottiene è inversamente proporzionale
all'idratazione della membrana plasmatica.

2.5 Analisi Immunoistochimica
Per l'analisi Immunoistochimica, gli spermatozoi isolati sono stati citocen-
trifugati a 200 g per 10 minuti su vetrini rivestititi con poli-L-lisina e ssati in
paraformaldeide al 4% in tampone fosfato, pH 7.4, per 20 minuti a temperatura
ambiente. In seguito gli spermatozoi sono stati permeabilizzati in Triton X-100
(Sigma-Aldrich) allo 0, 1% in PBS per 10 minuti ed incubati a 4◦
C per tutta
la notte con l'anticorpo policlonale di capra anti-ezrin o con gli anticorpi mono-
clonali di topo anti-Cdc42, anti-CD9, anti-f-actina e anti-β-tubulina I. L'analisi
Immunoistochimica è stata eettuata utilizzando la tecnica della streptoavidina-
biotina perossidasi. Dopo incubazione con 3, 3 − diaminobenzidina (0, 05%
diaminobenzidina in 0, 05 mol/L tampone Tris, pH 7.6, e 0, 01% perossido di
idrogeno), i vetrini sono stati contro-colorati con l'ematossilina di Mayer. Come
controllo negativo al posto degli anticorpi primari sono state utilizzate IgG di
topo (al posto di anti-Cdc42, anti-CD9, anti-F-actina, anti-β-tubulina) e IgG di
capra (anziché anti-ezrin). Tutte le valutazioni sono state eseguite in modo in-
dipendente da due operatori mediante l'utilizzo di un microscopio ottico dotato
di una fotocamera digitale Nikon DS-Vi1. La concordanza dei risultati ottenuti
dai due operatori era sempre 95%. Le eventuali discrepanze sono state risolte
ricorrendo ad un riesame dei vetrini con l'utilizzo di un microscopio in simul-
taneo. L'intensità di colorazione è stata valutata in modo semi-quantitativo
usando una scala a 5 punti:
• 0 = nessuna colorazione
• 0.5 = intensità debole
• 1 = intensità moderata
• 2 = intensità buona
• 3 = intensità forte
Inoltre è stata registrata anche la localizzazione cellulare della colorazione, a
livello della testa e della coda dello spermatozoo. Per la conta cellulare è stato

utilizzato il software di analisi d'immagine NIS Elements BR 3.22 (Nikon In-
struments) e sono stati presi in considerazione almeno dieci campi per campione
(dimensione del campo: 0, 07 mm2
, ingrandimento: 400×). Le cellule colorate
sono state espresse come percentuale delle cellule totali presenti nel campo.
2.6 Analisi Statistica
Le analisi statistiche sono state eettuate utilizzando il pacchetto statistico
SAS (Statistical Analysis System Institute). Tutti gli esperimenti sono stati
eseguiti in triplo. I risultati sono stati espressi in termini di Medie ± Deviazione
Standard (SD). E' stato utilizzato il Test di Kolmogorov-Smirnov per vericare
che i dati siano derivati da una distribuzione normale. Il t-Test di Student è
stato usato per valutare se le dierenze tra i gruppi fossero signicative. Sono
stati considerati statisticamente signicativi valori di p0.05.

3Risultati
In questo studio sono stati esaminati 46 soggetti, di cui 25 aetti da aste-
nozoospermia di tipo idiopatico e 21 soggetti come popolazione di controllo.
Le caratteristiche del liquido seminale dei pazienti normospermici e astenozoo-
spermici sono state determinate seguendo i parametri di riferimento della WHO
aggiornati nel 2010. Come previsto i valori ottenuti sono stati simili nei due
gruppi, fatta eccezione per i parametri cinetici.
3.1 Studi di uidità ed idratazione di membrana
La uidità di membrana è stata valutata determinando l'anisotropia di uo-
rescenza di due diverse sonde: il TMA-DPH fornisce informazioni riguardanti lo
strato più superciale della membrana plasmatica mentre il DPH sulla porzione
più interna essendo una sonda idrofobica. L'anisotropia di uorescenza associata
alla sonda TMA-DPH è risultata signicativamente più alta negli spermatozoi
isolati da soggetti astenozoospermici (normospermici: 0, 179 ± 0, 01; astenozoo-
spermici: 0, 194 ± 0, 03; P 0, 01). Al contrario, utilizzando la sonda DPH,
sono stati osservati valori più bassi di anisotropia di uorescenza nei campioni
ottenuti dagli individui astenozoospermici rispetto a quelli isolati dai sogget-
ti normospermici (normospermici: 0, 196 ± 0, 02; astenozoospemici: 0, 178 ±
0, 01; P 0, 01). Poiché l'anisotropia di uorescenza è inversamente proporzio-
25

CAPITOLO 3. RISULTATI 26
nale alla uidità di membrana, i risultati ottenuti hanno mostrato una riduzione
della uidità di membrana nella porzione superciale della membrana plasma-
tica degli spermatozoi isolati dai soggetti astenozoospermici e un incremento
della stessa nella zona interna rispetto ai controlli (Figura 3.1).
Figura 3.1: enisotropi— di )uores™enz— delle sonde „weEh€r e h€r
La sonda Laurdan è stata invece utilizzata per lo studio dell'idratazione
della membrana plasmatica degli spermatozoi. L'idratazione è stata valutata
considerando le modicazioni della polarizzazione generalizzata (GP). La sonda
risponde in modo diverso al cambiamento del numero di molecole d'acqua ac-
cessibili ad essa stessa. Ciò dipende dalla struttura lipidica e dal contenuto in
colesterolo. I campioni ottenuti dai soggetti astenozoospermici mostrano valori
di GP signicativamente più alti rispetto a quelli isolati da individui normosper-
mici. Questo indica una bassa idratazione della membrana dei primi, in quanto il
valore GP e l'idratazione di membrana sono inversamente proporzionali (normo-
spermici: 0, 228 ± 0, 008; astenozoospermici: 0, 239 ± 0, 006; P0, 001) (Figura
3.2).

Figura 3.2: €ol—rizz—zione gener—lizz—t— medi—nte utilizzo dell— sond— v—urd—n
3.2 Analisi Immunoistochimica
Le analisi immunoistochimiche sono state condotte valutando la positività
dei campioni ottenuti dagli individui astenozoopermici comparata con quella
dei controlli. I campioni isolati dai soggetti normospermici hanno mostrato
un'espressione immunoistochimica forte di Ezrin (98, 7 ± 7, 2% del totale delle
cellule) a livello sia della testa che della coda dello spermatozoo. I campioni
ottenuti dai pazienti astenozoospermici avevano una percentuale di spermatozoi
positivi signicativamente più bassa (90, 3 ± 5, 5%) e un'intensità debole a livello
della testa (25, 5 ± 3, 7% del totale), moderata e discontinua a livello della coda
(Tabella 3.1) (Figura 3.3).

Testa Coda
Intensità della
colorazione 1
% 2 Intensità della
colorazione 1
% 2
Controlli 2, 98 ± 0, 11 98, 7 ± 7, 2 2, 95 ± 0, 22 98, 7 ± 7, 2
Astenozoospermici 0, 52 ± 0, 163 25, 5 ± 3, 73 1, 00 ± 0, 14 3 90, 3 ± 5, 5 3
Tabella 3.1: gonfronto espressione immunoisto™himi™— di izrinF
Figura 3.3: ispressione immunoisto™himi™— di izrin
L'espressione immunoistochimica di Cdc42 era forte e diusa nei normosper-
mici (98, 6 ± 8, 1% di cellule positive); in particolare, nella testa l'espressione
era forte nella regione postacrosomiale e moderata/buona in quella apicale. Nei
campioni astenozoospermici la percentuale di cellule positive era simile a quella
dei normospermici (95, 4 ± 4, 3%), tuttavia l'intensità era debole a livello del-
la testa (25, 2 ± 4, 1% del totale delle cellule) e moderata a livello della coda
Tabella (3.2) (Figura 3.4).
10 = negatività; 0, 5 = intensità debole; 1 = intensità moderata; 2 = intensità buona; 3 =
intensità forte.
2media ± deviazione standard delle cellule colorate rispetto alla totalità delle cellule
contate.
3p 0, 001
4p 0, 005

Testa Coda
Intensità della
colorazione1
% 2 Intensità della
colorazione 1
% 2
Controlli 2, 95 ± 0, 15 98, 6 ± 8, 1 2, 98 ± 0, 11 98, 6 ± 8, 1
Astenozoospermici 0, 48 ± 0, 083 25, 2 ± 4, 23 0, 98 ± 0, 183 95, 4 ± 4, 33
Tabella 3.2: gonfronto espressione immunoisto™himi™— di gd™RP
Figura 3.4: ispressione immunoisto™himi™— di gd™RP
Inoltre nei campioni normospermici la percentuale di spermatozoi positivi
al CD9 è stata del 95, 2 ± 6, 45% con un'intensità moderata a livello della
testa e moderata/buona a livello della coda. Nei campioni astenozoospermici la
percenutale di cellule positive era signicativamente più bassa (90, 1 ± 4, 7%)
e l'espressione immunoistochimica era debole a livello della coda e negativa a
livello della testa (Tabella 3.3) (Figura 3.5).
intensità forte.
contate.
3p 0, 001
4p 0, 005

Testa Coda
Intensità della
colorazione 1
%2 Intensità della
colorazione 1
%2
Controlli 1, 10 ± 0, 26 95, 2 ± 6, 4 1, 55 ± 0, 22 95, 2 ± 6, 4
Astenozoospermici 0, 52 ± 0, 103 90, 1 ± 4, 74
Tabella 3.3: gonfronto espressione immunoisto™himi™— di ghW
Figura 3.5: ispressione immunoisto™himi™— di ghW
L'analisi dell'espressione immunoistochimica delle proteine del citoschele-
tro, F-actina e β-tubulina, ha evidenziato quanto segue. La F-actina, negli
spermatozoi isolati da pazienti normospermici, aveva un'intensità buona nella
testa e forte nella coda. Negli spermatozoi di pazienti astenozoospermici l'e-
spressione immunoistochimica della f-actina era debole a livello della testa e
buona/moderata a livello della coda. La percentuale di cellule positive è stata
del 95, 5 ± 5, 2% e 95, 3 ± 6, 7% rispettivamente per i due gruppi di soggetti
(Tabella 3.4) (Figura 3.6).
intensità forte.
contate.
3p 0, 001
4p 0, 005

Testa Coda
Intensità della
colorazione 1
%2 Intensità della
colorazione 1
%2
Controlli 1, 98 ± 0, 16 95, 5 ± 5, 2 2, 93 ± 0, 18 95, 5 ± 5, 2
Tabella 3.4: gonfronto espressione immunoisto™himi™— dell9 pE—™tin—
Figura 3.6: ispressione immunoisto™himi™— dell— pE—™tin—
In ultimo l'intensità della β-tubulina era maggiore negli spermatozoi otte-
nuti da uomini normospermici rispetto a quella degli spermatozoi ottenuti da
uomini astenozoospermici. In particolare, nei campioni di controllo l'intensità
era forte e diusa, mentre negli spermatozoi ottenuti da pazienti infertili aetti
da astenozoospermia idiopatica, l'intensità era buona sia nella testa che nella
coda. La percentuale di cellule positive era simile per le due categorie di indivi-
dui (normospermici: 98, 7 ± 7, 4%; astenozoospermici: 98, 5 ± 4, 9%) (Tabella
3.5) (Figura 3.7).
intensità forte.
contate.
3p 0, 001
4p 0, 005

Testa Coda
Intensità della
colorazione 1
%2 Intensità della
colorazione 1
%2
Controlli 2, 90 ± 0, 20 98, 7 ± 7, 4 2, 95 ± 0, 18 98, 7 ± 7, 4
Tabella 3.5: gonfronto espressione immunoisto™himi™— dell— βEtu˜ulin—
Figura 3.7: ispressione immunoisto™himi™— dell— βEtu˜ulin—
intensità forte.
contate.
3p 0, 001
4p 0, 005

4Discussione
Lo stress ossidativo rappresenta una delle principali cause di compromissione
della funzione dello spermatozo nei pazienti astenozoospermici. Studi preceden-
ti hanno suggerito come l'aumento della produzione di ROS possa causare la
perossidazione dei lipidi della membrana citoplasmatica dello spermatozoo, in-
uenzando così le caratteristiche chimico-siche della stessa [23]. Ciò a sua
volta, può inuire notevolmente sulle proprietà strutturali e funzionali della
membrana o delle proteine in essa incorporate. Sulla base di ciò, la nostra at-
tenzione si è focalizzata sullo studio della membrana plasmatica e delle proteine
caratteristiche del citoscheletro degli spermatozoi. Questa analisi, condotta su
spermatozoi isolati da soggetti normospermici fertili e pazienti astenozoospermi-
ci infertili, è la prima che si sia posta come obiettivo quello di valutare non solo
la uidità e l'idratazione della membrana citoplasmatica dello spermatozoo, ma
anche quello di analizzare l'espressione immunoistochimica delle proteine tran-
smembrana e citoscheletriche, quali ezrin, Cdc42, CD9, F-actina e β-tubulina.
In primo luogo si sono dimostrati rilevanti i dati ottenuti sulla uidità della
membrana citoplasmatica. In particolare, gli spermatozoi del gruppo degli aste-
nozoospermici presentano una ridotta uidità di membrana a livello dello strato
superciale, cioè quello posto all'interfaccia lipidi-acqua, e una maggiore uidi-
tà nella porzione più profonda del doppio strato lipidico, rispetto ai campioni
utilizzati come controllo. Inoltre l'analisi riguardante l'idratazione di membra-
33

CAPITOLO 4. DISCUSSIONE 34
na mediante utilizzo della sonda Laurdan ha evidenziato come gli spermatozoi
dei pazienti astenozoospermici mostrino un'idratazione di membrana inferiore
rispetto a quelli dei soggetti normospermici. Questo dato era già stato rilevato
da studi precedenti che avevano infatti dimostrato come la diminuzione dell'i-
dratazione della membrana fosse correlata alla riduzione della funzionalità degli
spermatozoi [22]. Pertanto, la ridotta capacità di fecondazione da parte di in-
dividui astenozoospermici potrebbe dipendere, almeno in parte, da alterazioni
che interessano la membrana. Infatti, è ben noto che la uidità di membrana
regoli alcune funzioni importanti come la capacitazione, la reazione acrosomia-
le e la fusione spermatozoo-uovo [24]. Per quanto riguarda ezrin, la più nota
proteina della famiglia ERM che collega il citoscheletro corticale con le proteine
di membrana, i nostri risultati hanno dimostrato una sua espressione immunoi-
stochimica più forte e diusa a livello della testa e della coda degli spermatozoi
nei soggetti normospermici rispetto a quelli isolati dai pazienti astenozoosper-
mici, in cui l'espressione risulta invece debole a livello della testa, moderata e
discontinua a livello della coda. Inoltre i campioni ottenuti dal gruppo di con-
trollo hanno una percentuale di spermatozoi positivi signicativamente più alta
in confronto a quella dei campioni ottenuti dai pazienti aetti da astenozoosper-
mia idiopatica. Analogamente l'espressione immunoistochimica di Cdc42 risulta
forte e diusa negli spermatozoi dei soggetti normospermici; in particolare nella
testa l'espressione è forte nella regione postacrosomiale e moderata/buona in
quella apicale; mentre nei campioni ottenuti dai pazienti astenozoospermici è
debole a livello della testa e moderata a livello della coda. Questi risultati sono
coerenti con gli studi precedenti che hanno messo in evidenzia il coinvolgimento
delle GTPasi nel processo di polimerizzazione dell'actina a livello della regione
postacrosomiale [25]. Anche se negli spermatozoi umani le funzioni di queste
proteine sono in gran parte sconosciute, esse sembrano essere coinvolte nella
motilità degli spermatozoi e in eventi fondamentali per la fecondazione. Quindi
non è da stupirsi se la loro espressione risulta essere più bassa nei soggetti infer-
tili astenozoospermici. Per quanto riguarda la proteina CD9, appartenente alla

famiglia delle tetraspanine, così chiamate perché contengono quattro segmenti
che attraversano la membrana, i nostri risultati hanno evidenziato che nei cam-
pioni normospermici l'espressione immunoistochimica è più intensa rispetto agli
astenozoospermici. Inoltre nei campioni di controllo la percentuale di sperma-
tozoi positivi al CD9 risulta maggiore in confronto a quella degli spermatozoi
provenienti da soggetti aetti da astenozoospermia idiopatica. In particolare,
è da notare che, negli spermatozoi di pazienti astenozoospermici la testa è ne-
gativa per il CD9. Anche questo risultato non ci ha sorpreso visto che il CD9
a livello della testa dello spermatozoo sembra essere coinvolto nell'interazione
con l'oolemma. Di conseguenza una ridotta espressione di CD9 potrebbe con-
tribuire ad un'alterazione della capacità di fecondazione dei pazienti interessati
da astenozoospermia idiopatica. Recentemente, è stato suggerito che la protei-
na ezrin, le Rho GTPasi, le proteine della membrana citoplasmatica e quelle
del citoscheletro, siano coinvolte assieme nell'attivazione dello spermatozoo e
nella fecondazione. Circa l'espressione immunostochimica della proteina del
citoscheletro F-actina, abbiamo trovato che essa risulta più alta negli sperma-
tozoi ottenuti da soggetti normospermici, dove è diusa sia nella testa che nella
coda. Al contrario negli spermatozoi ottenuti da pazienti astenozoospermici,
l'espressione immunoistochimica della F-actina è debole a livello della testa e
buona/moderata a livello della coda. Questi dati sono in linea con l'ipotesi se-
condo la quale la F-actina, insieme alle altre proteine del citoscheletro, giochi un
ruolo importante nella siologia dello spermatozoo. Pertanto l'inibizione della
F-actina può compromettere la fecondazione e ridurre indirettamente la moti-
lità degli spermatozoi attraverso una disorganizzazione dell'assonema. Inne
abbiamo valutato l'immunoespressione della β-tubulina. Abbiamo notato che
in entrambi i gruppi l'immunocolorazione è diusa, ma nei campioni di pazienti
astenozoopermici è meno intensa rispetto a quella dei campioni di controllo.
Anche se è ben noto che le proteine del citoscheletro, a livello della coda degli
spermatozoi, hanno un ruolo centrale nella motilità, è stato suggerito che la tu-
bulina potrebbe avere un ruolo altrettanto importante a livello della testa dello

spermatozoo, dove sarebbe coinvolta attivamente nella fecondazione, in associa-
zione con altre proteine del citoscheletro. In conclusione, i nostri risultati nel
loro insieme suggeriscono che una riorganizzazione del citoscheletro, indotta da
un'alterazione delle caratteristiche sico-chimiche della membrana plasmatica
degli spermatozoi e potenzialmente mediata dalle proteine ezrin, Cdc42 e CD9,
potrebbe contribuire alla compromissione della funzionalità spermatica in casi
di astenozoospermia idiopatica.

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