Tesi Laurea Specialistica Chimica

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Modulazione dell'attività catalitica
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con nanoparticelle

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Tesi Laurea Specialistica Chimica

  1. 1. ` Universita degli Studi di Perugia Facolt` di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali a Corso di laurea in Scienze Chimiche Tesi di Laurea Specialistica Modulazione dell’attivit` catalitica a di enzimi tramite interazione con nanoparticelleLaureanda: Relatore:Orsola Ripa Prof. Antonio Cipiciani Correlatore: Dott.ssa Francesca Bellezza Anno Accademico 2009/2010
  2. 2. a Marcello e Marella ♥
  3. 3. PremessaLa possibilit` di regolare l’attivit` catalitica delle proteine gioca un ruolo impor- a atante nella modulazione di processi cellulari vitali. Disfunzioni a livello dell’azionesvolta da enzimi e proteine sono la causa di disturbi e malattie per l’uomo, e lacapacit` di regolare la funzione enzimatica e l’interazione tra sistemi proteici pu` a ofornire una promettente strategia per curare tali disturbi.La struttura e la funzione di un enzima possono essere modulate tramite l’intera-zione con nanoparticelle. Il ruolo chiave ` svolto dalle propriet` del nanomateriale, e acome la struttura, le dimensioni, la chimica superficiale, la carica e la forma.Le nanoparticelle hanno alcuni vantaggi rispetto ad altre piccole molecole organi-che: esse hanno una grande area superficiale (rapporto superficie/volume elevato)che favorisce il legame con le proteine e le interazioni di tipo biologico. Le parti-celle di dimensioni nanometriche possono entrare facilmente nelle cellule, cosa chenon ` permessa ad alcune piccole molecole, anche di natura biologica. Inoltre, oggi esono disponibili strategie sintetiche che permettono di ottenere nanoparticelle conpropriet` controllabili in termini di dimensioni, geometria e caratteristiche super- aficiali, che siano integrabili con la complessit` strutturale delle proteine. Il fiorente asviluppo nel campo dei nanomateriali offre una nuova strada verso la modulazionedell’attivit` di proteine attraverso l’instaurarsi di interazioni superficiali tra i due asistemi.D’altra parte, la diffusione massiccia di questo tipo di materiali in numerosi ambi-ti, che vanno dal biomedico all’alimentare, ha come conseguenza l’introduzione diquesto tipo di molecole nell’organismo. Proprio allo scopo di verificare e prevenireeventuali effetti negativi e/o problemi di tossicit` diventa fondamentale studiare acosa succede a questi sistemi quando vengono a contatto con l’ambiente fisiologi-co, con particolare attenzione verso gli enzimi, per capire il tipo di interazione cheeventualmente si instaura e verificare le ripercussioni sull’attivit` catalitica della aproteina.
  4. 4. Solo conoscendo in modo preciso e da ogni punto di vista il sistema proteina-nanoparticella si pu` controllarlo, manipolarlo e utilizzarlo al meglio la dove ne- ocessario.In questo lavoro ` stata posta l’attenzione su due eme-proteine che svolgono un eruolo molto importante nell’organismo: la mioglobina, la cui funzione principe ` elegare reversibilmente l’ossigeno molecolare, e il citocromo C, enzima essenzialedella catena di trasporto mitocondriale degli elettroni.Di entrambi ` stata studiata l’attivit` perossidasica, cio` la capacit` di ossidare e a e asubstrati donatori di elettroni, in presenza di nanomateriali quali la silice e il fo-sfato di zirconio. Il primo ` un materiale molto diffuso e ampiamente utilizzato ementre il secondo ` un materiale di nuova sintesi. eLo scopo del lavoro di tesi ` stato capire come nanoparticelle cariche negativamen- ete in superficie interagiscono con la mioglobina e il citocromo C, che possiedonocarica netta differente a pH sperimentale, e vedere che ripercussioni ha tale inte-razione sulla loro attivit` perossidasica. a
  5. 5. Indice1 Interazione di enzimi con nanomateriali 1 1.1 Il ruolo delle nanotecnologie oggi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.2 L’interazione proteine-nanoparticelle . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1.3 Modulazione dell’attivit` catalitica con nanoparticelle . . . . . . . a 6 1.4 Materiali nanostrutturati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1.4.1 Silice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1.4.2 α-Fosfato di zirconio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132 Emeproteine e attivit` perossidasica a 16 2.1 La catalisi enzimatica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 2.2 Le emeproteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 2.2.1 Mioglobina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 2.2.2 Citocromo C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 2.2.3 Interazione di emeproteine con materiali nanostrutturati . . 27 2.3 Attivit` perossidasica e studi cinetici . . . . . . . . . . . . . . . . . a 28 2.4 Equilibri di formazione di complessi proteina- ligando . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 343 Scopo del lavoro 374 Risultati e discussione 40 4.1 Interazione della mioglobina con nanoparticelle di silice Ludox TM-40 41 4.1.1 Attivit` catalitica della mioglobina in presenza di SiO2 . . . a 41 4.1.2 Spettri UV-Vis della mioglobina in presenza di SiO2 . . . . 45 i
  6. 6. INDICE 4.1.3 Attivit` catalitica della mioglobina in presenza di SiO2 in a funzione della forza ionica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 4.1.4 Attivit` catalitica della mioglobina in presenza di SiO2 -APTES 49 a 4.1.5 Stabilit` della mioglobina all’inattivazione in presenza di a perossido di idrogeno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 4.1.6 Determinazione delle costanti di equilibrio per i sistemi mioglobina- imidazolo e mioglobina-azide . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 4.2 Interazione del citocromo C con nanoparticelle di silice Ludox TM-40 55 4.2.1 Attivit` catalitica del citocromo C in presenza di SiO2 . . . a 55 4.2.2 Spettri UV-Vis del citocromo C in presenza di SiO2 . . . . 58 4.2.3 Attivit` catalitica del citocromo C in presenza di SiO2 in a funzione della forza ionica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 4.2.4 Attivit` catalitica del citocromo C in presenza di SiO2 -APTES 60 a 4.2.5 Stabilit` del citocromo C all’inattivazione in presenza di a perossido di idrogeno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 4.3 Interazione di emeproteine con α-ZrP in forma nanostrutturata . . 62 4.3.1 Interazione della mioglobina con nanoparticelle di α-ZrP . . 63 4.3.2 Interazione del citocromo C con nanoparticelle di α-ZrP . . 675 Conclusioni 726 Parte sperimentale 75 6.1 Materiali utilizzati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 6.1.1 Funzionalizzazione della silice Ludox TM-40 . . . . . . . . . 75 6.1.2 Sintesi di nanoparticelle di α-ZrP . . . . . . . . . . . . . . . 76 6.2 Studi cinetici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 6.2.1 Studio dell’attivit` catalitica di emeproteine in presenza di a nanoparticelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 6.2.2 Determinazione delle costanti cinetiche kcat e KM per la proteina nativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 ii
  7. 7. INDICE 6.2.3 Determinazione delle costanti cinetiche kcat e KM della pro- teina adsorbita su nanoparticelle . . . . . . . . . . . . . . . 78 6.3 Inattivazione della proteina in presenza di perossido di idrogeno . . 79 6.4 Spettroscopia UV-Vis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79 6.4.1 Spettri UV-Vis delle proteine nella forma nativa . . . . . . 79 6.4.2 Spettri UV-Vis delle proteine in presenza di silice . . . . . . 80 6.4.3 Spettri UV-Vis delle proteine in presenza di fosfato di zirconio 80 6.5 Determinazione delle costanti di equilibrio per i sistemi mioglobina- ligando . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80Bibliografia 82 iii
  8. 8. Capitolo 1Interazione di enzimi connanomateriali1.1 Il ruolo delle nanotecnologie oggiLe nanotecnologie si occupano della ricerca e sviluppo di sistemi nanostrutturatie sono il ramo scientifico pi` studiato e su cui si ` investito moltissimo, a livello u emondiale, in questo inizio di secolo.La capacit` di lavorare a livello molecolare, atomo per atomo, e di manipolare aspecifiche caratteristiche dei nanomateriali, quali propriet` fisiche, chimiche e bio- alogiche, offre una gamma di possibilit` di sintesi di minuscole strutture, altamente afunzionalizzate, utilizzabili nell’ambito del drug delivery, in tecniche di imaging,per la progettazione di biosensori, circuiti elettrici, microchips, switches moleco-lari e anche analoghi per tessuti cutanei, ossa, muscoli e altri organi.D’altra parte, i notevoli passi avanti fatti dalla medicina e dalle biotecnologie nelcampo della diagnostica e della cura di malattie dipendono da una approfonditaconoscenza dei processi biologici. Le malattie possono essere identificate sulla ba-se di anomalie a livello molecolare e anche le cure progettate a partire da questostesso livello. Anche se esistono molti metodi diagnostici cosi come esistono gi` acure mirate, ` auspicabile usare strumenti con dimensioni paragonabili a quelle emolecolari per capire meglio i meccanismi coinvolti nei processi. Questi strumen-ti possono essere basati su nanoparticelle, nano-probs o altri nanomateriali, che 1
  9. 9. 1.2 L’interazione proteine-nanoparticellepossono essere usati per interagire col processo biologico d’interesse.La scienza biomedica e le biotecnologie hanno beneficiato dei progressi tecnologiciraggiunti in molti campi e le nanotecnologie sono uno di questi, rappresentandoun’area molto importante e promettente anche per il futuro.Le nanoparticelle hanno propriet` uniche che possono essere sfruttate in questo aambito: possiedono propriet` elettroniche, ottiche, chimiche e magnetiche inusuali arispetto ai materiali di dimensioni macro, hanno un elevato rapporto superficie-volume e dimensioni paragonabili a quelle di importanti sistemi biologici (proteine,DNA, membrane cellulari). Tutto questo permette loro di interagire in manierasofisticata e controllata a livello cellulare.Negli ultimi anni, nanoparticelle di diverse dimensioni, composizione e funzionalit` asuperficiale sono state studiate per capirne l’interazione con proteine. I meccani-smi d’interazione nanoparticella-proteina implicati sono, nella maggior parte deicasi, interazioni idrofobiche, π − π ed elettrostatiche, che ovviamente possonocoesistere.1.2 L’interazione proteine-nanoparticelleLo studio del meccanismo di interazione di proteine con nanomateriali ha avutoinizio negli anni ’50, quando cominciarono i primi tentativi di utilizzare enzimifuori dal loro ambiente naturale. Ad oggi l’interesse nel comprendere le forze cheregolano il legame proteina-solido non ` soltanto rendere l’enzima pi` stabile e e uresistente al variare delle condizioni sperimentali in cui lavora, ma anche quello dimodulare l’attivit` enzimatica tramite l’interazione con specifici nanomateriali. aProprio per la sempre maggiore diffusione di tali sistemi in prodotti di tipo biome-dico e di consumo, pu` essere facile entrare in contatto con essi e diventa quindi ocruciale conoscere cosa accade quando nanoparticelle si trovano a contatto di li-quidi biologici. Questo obiettivo pu` essere raggiunto, step by step, partendo dallo ostudio dell’interazione di nanomateriali con le proteine presenti nel nostro organi-smo. 2
  10. 10. 1.2 L’interazione proteine-nanoparticelleUna proteina pu` interagire con nanoparticelle tramite adsorbimento o tramite oformazione di legami covalenti; in entrambi i casi ` necessario capire quale parte edella proteina ` coinvolta e nel caso di enzimi se il sito attivo ` direttamente coin- e evolto o meno.In genere il processo di adsorbimento di proteine prevede pi` passaggi: u 1. deidratazione della superficie: consiste nel rilascio di molecole di acqua dalla superficie della proteina e delle nanoparticelle; favorisce l’adsorbimento su materiali idrofobici e sfavorisce quello su materiali idrofilici; 2. interazioni proteina-nanoparticelle: sono in genere interazioni elettro- statiche o di Van der Waals; 3. cambiamenti strutturali della proteina: la struttura folded di una pro- teina ` il risultato del fatto che le interazioni idrofobiche tra i residui apolari e interni riescono a superare sia le repulsioni tra cariche dello stesso segno di residui esterni sia la perdita di entropia dovuta alla struttura folded pi` or- u dinata. A contatto con un nanomateriale idrofobico tale bilanciamento viene meno e le interazioni idrofobiche tra i residui apolari interni sono sostituite da quelle che si instaurano tra la macromolecola e il solido. Pu` verificarsi che le repulsioni tra cariche dello stesso segno di residui o esterni prevalgano e si abbia l’unfolding della proteina, con successivo au- mento dell’area occupata da ciascuna molecola proteica sulla superficie del nanomateriale. 4. interazioni laterali tra proteine adsorbite: sulla superficie delle na- noparticelle possono legarsi pi` unit` proteiche in grado di interagire tra u a loro sia in modo attrattivo che repulsivo. Tali interazioni sono fortemente dipendenti dal grado di copertura della superficie.La comprensione e il controllo dei fenomeni che regolano l’interazione tra unaproteina e un materiale nanostrutturato ` molto complesso. e 3
  11. 11. 1.2 L’interazione proteine-nanoparticelleAltri fattori importanti che influenzano il modo in cui una proteina si adsorbe suuna superficie solida sono: • propriet` e stabilit` della proteina: le proteine possono essere suddivise a a in due grandi classi, proteine hard e soft. Questa terminologia ` utile per e descrivere la tendenza di una proteina a subire cambiamenti strutturali pi` u o meno significativi quando si adsorbe su superfici solide. Le proteine hard hanno elevata stabilit` strutturale e tendono ad interagire a con materiali superficialmente idrofobici, a meno che non ci siano forze di attrazione elettrostatica. A seguito dell’adsorbimento, interazioni di questo tipo inducono sulla proteina hard variazioni conformazionali poco significa- tive. A questa classe appartengo per esempio l’α-chimotripsina , il lisozima e il citocromo C (CytC). Le proteine soft hanno una bassa stabilit` strutturale e maggiore flessibilit`; a a ne sono un esempio l’emoglobina (Hb), la mioglobina (Mb) e l’albumina (HSA). Esse si adsorbono pi` facilmente su superfici idrofiliche anche in pre- u senza di repulsione elettrostatica, grazie al guadagno entropico dovuto ad alterazioni conformazionali indotte dall’interazione; • fattori termodinamici: oltre alla natura della proteina il processo di in- terazione tiene conto dell’energia messa in gioco. Termodinamicamente, l’adsorbimento ` determinato dalla variazione di ener- e gia libera che, a temperatura ambiente, ` correlata a fattori entalpici ed en- e tropici. I primi dipendono dalla intensit` delle forze attrattive e/o repulsive a (elettrostatiche, idrofobiche e di Van der Waals) che regolano la formazione del sistema proteina-nanomateriale. I fattori entropici sono legati al rilascio dell’acqua di idratazione della proteina e delle nanoparticelle e ad un even- tuale riduzione di ordine nella struttura proteica dovuto all’unfolding che lo stabilirsi dell’interazione pu` causare; o • condizioni sperimentali: note le caratteristiche strutturali della protei- 4
  12. 12. 1.2 L’interazione proteine-nanoparticellena e del nanomateriale, ` possibile ottimizzare l’adsorbimento variando le econdizioni sperimentali. In particolare l’interazione tra i due sistemi ` in- efluenzata dal pH e dalla temperatura.Un aumento della temperatura pu` avere un effetto sulla stabilit` e sulla o astruttura conformazionale della proteina. Pur essendo una possibile causadi denaturazione, la variazione di temperatura pu` essere utilizzata per de- ofinire le driving-forces responsabili dell’adsorbimento. La variazione dellapercentuale di proteina adsorbita all’aumentare della temperatura indica seil processo ` endotermico o esotermico: una diminuzione della percentuale edi adsorbimento corrisponde ad un processo esotermico (∆H < 0) mentre,un aumento corrisponde ad un processo endotermico (∆H > 0). In quest’ul-timo caso, dato che il processo ` spontaneo, si deve verificare un aumento di eentropia dovuto, ad esempio, a variazioni conformazionali.Le proteine soft risentono maggiormente di variazioni di temperatura ri-spetto alle hard, perch´ le modifiche strutturali che subiscono favoriscono il eprocesso da un punto di vista entropico.Anche il pH ha un ruolo fondamentale sui processi di interazione proteine-nanomateriali. Il massimo valore di proteina adsorbita si ottiene, in genere,a un valore di pH prossimo a quello del punto isoelettrico (pI) della proteina:quando il pH uguaglia il pI la proteina non ha una carica superficiale nettae risente meno delle repulsioni laterali tra molecole adsorbite, favorendo unmiglior impaccamento.Un altro fattore molto importante ` la forza ionica del mezzo in cui avviene el’interazione: essa pu` avere un effetto drammatico su processo di adsorbi- omento. Valori elevati di forza ionica favoriscono l’adsorbimento in condizionidi repulsione elettrostatica tra proteina e solido e lo inibiscono se c’` attra- ezione elettrostatica. In generale, una marcata dipendenza dell’adsorbimentodalla forza ionica indica un forte contributo da parte di interazioni di tipoelettrostatico. 5
  13. 13. 1.3 Modulazione dell’attivit` catalitica con nanoparticelle a1.3 Modulazione dell’attivit` catalitica con nanopar- a ticelleL’importanza che l’interazione tra una proteina e nanoparticelle pu` avere in am- obito biologico nel modulare l’attivit` enzimatica ` dimostrata dal sempre crescente a enumero di lavori di letteratura che riguardano tale argomento e dagli ottimi risul-tati raggiunti [1].Nell’ambito di tale tematica particolare interesse ` stato rivolto allo studio di na- enoparticelle di natura inorganica. Ad esempio, nanoparticelle di silice di diversedimensioni sono state utilizzate per indagare l’effetto su proteine quali il lisozima[2], la ribonucleasi A [3] e l’anidrasi carbonica [4].Il tipo di interazione, la struttura e la capacit` catalitica della proteina adsorbita asono fortemente influenzate dalle dimensioni della silice. Un differente raggio dicurvatura influenza l’assorbimento che a sua volta induce cambiamenti conforma-zionali diversi e quindi modifiche sull’attivit` dell’enzima. Nel caso del lisozima, ananoparticelle di dimensioni pi` grandi (100 nm di diametro) stabiliscono intera- uzioni pi` forti con la proteina (4 nm di diametro), causando un maggiore unfolding ucon conseguente diminuzione di attivit` enzimatica (Figura 1.1) [2]. aFigura 1.1: Adsorbimento del lisozima su nanoparticelle di silice di diversedimensioni.Inoltre, la funzionalizzabilit` superficiale delle nanoparticelle offre una gamma adi possibilit` per lo studio dei processi che avvengono all’interfaccia proteina- ananoparticella. 6
  14. 14. 1.3 Modulazione dell’attivit` catalitica con nanoparticelle aAd esempio, sono stati messi a punto sistemi costituiti da un core di nanoparti-celle d’oro, ricoperti da un monostrato organico con diversi gruppi superficiali edenominati MMPC (Figura 1.2): questi sistemi hanno un diametro di circa 6 nme sono in grado di interagire con biomolecole come la chimotripsina [5] [6].Figura 1.2: a) Struttura chimotripsina. b) Dimensioni relative dellachimotripsina e delle nanoparticelle MMPC. c) MMPC anionici e cationici.In base alla carica dei gruppi funzionali superficiali gli MMPCs hanno un effettodiverso sulla proteina: quelli di tipo anionico inibiscono la chimotripsina a causadelle cariche negative terminali complementari a quelle localizzate attorno a sitoattivo dell’enzima. (Figura 1.3).Figura 1.3: Rappresentazione dell’interazione tra la chimotripsina enanoparticelle di oro funzionalizzate in superficie. 7
  15. 15. 1.3 Modulazione dell’attivit` catalitica con nanoparticelle aL’attivit` catalitica della chimotripsina si pu` quindi modulare attraverso l’inte- a orazione con diversi tipi MMPC.L’interazione nanoparticelle-proteine pu` pertanto essere messa a punto modifi- ocando la superficie del nanomateriale: in questo modo si pu` ottimizzare l’attivit` o acatalitica dell’enzima di interesse in base al tipo di applicazione desiderata.Particelle di CdSe, derivatizzate sulla superficie con gruppi terminali diversi, sonoun altro esempio interessante [7]: tre situazioni possibili sono illustrate nella Fi-gura 1.4.Figura 1.4: Modalit` d’interazione della chimotripsina al variare dei legandi apresenti sulla superficie di nanoparticelle di CdSeCambiando la natura del legando superficiale cambia il comportamento della pro-teina. Nel caso a) la chimotripsina si lega alle nanoparticelle ma l’interazionedetermina l’unfolding con conseguente denaturazione; nel caso b) la proteina nonsi lega mentre, nel caso c), l’enzima si lega mantenendo inalterata la sua strutturae attivit`. aAnche alcuni amminoacidi sono stati utilizzati come legandi per modificare la su-perficie di nanoparticelle di oro in modo da modulare l’attivit` della chimotripsina. aLe nanoparticelle possono avere un ruolo chiave anche nei processi di riconoscimen- 8
  16. 16. 1.4 Materiali nanostrutturatito e di interazione tra proteine che sono alla base di complesse funzioni cellulari,quali l’apoptosi e l’angiogenesi. Ad esempio nanoparticelle di oro possono inibirel’interazione tra il CytC e la citocromo C perossidasi se funzionalizzate con gruppitiolato con linker PEG biocompatibili e gruppi amminici terminali [8].1.4 Materiali nanostrutturatiLa scelta del materiale da far interagire con una proteina va fatta in base allecaratteristiche che esso possiede, al tipo di reazione che si vuole studiare e allecondizioni sperimentali. Alcuni parametri sono considerati fondamentali: • il tipo, la distribuzione e la densit` dei gruppi funzionali superficiali; questi a fattori influenzano l’adsorbimento e la stabilit` del sistema che si forma; a • area superficiale: si preferiscono nanomateriali con ampia area superficiale cosi da garantire un maggiore carico di proteina; • rapporto idrofobicit`/idrofilia della matrice: essa influisce sulle interazioni a non covalenti, l’adsorbimento, la distribuzione e la disponibilit` di substrato a e prodotto; • forma e grandezza delle nanoparticelle.I materiali studiati in questo lavoro di tesi sono di tipo inorganico e sono moltodiffusi, sia in ambito di ricerca che dal punto di vista applicativo: questo, insiemealle caratteristiche che essi possiedono, ` tra i motivi per cui ` interessante capire e ecosa succede quando essi entrano in contatto con enzimi presenti nell’organismoper fare luce anche sulla loro eventuale pericolosit` per l’uomo. a1.4.1 SiliceLa silice ` da molti anni tra i nanomateriali pi` utilizzati nella ricerca e nella e uprogettazione di sistemi con applicazioni in diversi campi. 9
  17. 17. 1.4 Materiali nanostrutturatiEssa pu` essere sintetizzata tramite diverse tecniche preparative sotto forma di onanoparticelle e film trasparenti. Le tecniche sintetiche pi` comuni prevedono un uapproccio di tipo bottom-up e sono: • metodo di st¨ber [9]: il metodo pi` utilizzato per la sintesi di silice col- o u loidale in forma nanometrica e con dimensioni inferiori a 100 nm. Il processo prevede l’idrolisi di un precursore, in genere tetraetossisilano (TEOS), in una miscela di etanolo, acqua e idrossido di ammonio; durante la reazione si forma acido silicico e quando la sua concentrazione supera la solubilit` in etanolo esso aggrega in modo omogeneo e forma particelle di a silice con diametro che va da meno di 10 nm a 1 µm. Le dimensioni delle par- ticelle possono essere controllate ottimizzando alcuni parametri sperimentali come la concentrazione e la temperatura. La presenza di alcool e di condizioni di pH basiche fanno si che questa tecnica sintetica sia poco compatibile con la formazione di bio-coniugati in quanto, in queste condizioni, la proteina pu` subire denaturazione; esistono comunque o altri approcci che cercano di limitare tale inconveniente; • metodo delle micelle inverse: una micro-emulsione di acqua in olio (W/O) crea aggregati di surfattanti anfifilici termodinamicamente stabili. All’interno di questi aggregati si crea una zona idrofilica e le nano goccioline di acqua fanno da micro-reattore: ` qui che si formano le nanoparticelle a e partire dal’idrolisi di silani precursori. Il diametro delle nanoparticelle in crescita ` controllato dalla grandezza delle gocce di acqua e dal rapporto e acqua/surfattante. Questa procedura richiede un tempo di reazione pi` lungo rispetto al me- u todo precedente ma permette di sintetizzare particelle altamente sferiche e monodisperse.La struttura e la superficie della silice sono rappresentate in Figura 1.5: il core diogni particella ` costituito da unit` SiO2 che si ripetono mentre sulla superficie e a 10
  18. 18. 1.4 Materiali nanostrutturatisono presenti gruppi silano (-OH) e/o silossano (-OR). Sono questi gruppi chedeterminano le propriet` chimiche superficiali della silice. aFigura 1.5: a) Immagine TEM di nanoparticelle di silice Ludox TM-40. b)Rappresentazione schematica di una nanoparticella di silice.La silice pu` essere facilmente derivatizzata sostituendo gli ossidrili con gruppi oamminici, carbossilici o tiolici (Figura 1.6). La funzionalizzazione non si limitasoltanto a procedure che prevedano modifiche chimiche ma si pu` ottenere anche otramite assorbimento passivo di molecole.Tutte queste caratteristiche fanno della silice un ottimo materiale anche per ap-plicazioni di tipo biotecnologico e medico [10].Le nanobiotecnologie si occupano principalmente dello sviluppo di circuiti elet-tronici, switches molecolari, biosensori e microchips, mentre la nanomedicina fo-calizza l’attenzione sulla cura di malattie, tecniche di diagnosi, di monitoraggio,e sul rilascio e l’individuazione di agenti diagnostici, terapeutici e farmaceutici.L’importanza che l’uso di questo nanomateriale pu` avere in questi ambiti ` di- o emostrato dalla quantit` di lavori pubblicati al riguardo (Figura 1.7). aLe applicazioni come biosensori sono le pi` studiate e diffuse: in questo ambi- uto si utilizzano biotecnologie avanzate per creare prodotti in grado di rilevare equantificare analiti in ambiente clinico (analisi del sangue di routine), domestico 11
  19. 19. 1.4 Materiali nanostrutturatiFigura 1.6: Nanoparticelle di silice funzionalizzate con diversi gruppi organici.(monitoraggio del glucosio), industriale (sicurezza lavoratori, sicurezza alimentare)e ambientale. Questi devices devono unire alte prestazioni, in termini di sensibi-lit` e selettivit`, dimensioni minime, alta velocit` di risposta e bassi costi. Per a a arealizzarli ` necessario mettere insieme fondamenti di biologia, chimica e scienze edei materiali. Le nanoparticelle sono unit` attive per sistemi di questo tipo perch´ a esono in grado di amplificare un segnale. Nanoparticelle di silice funzionalizzatecon proteine e acidi nucleici sono state usate come unit` per amplificare la tra- asduzione di segnali di riconoscimento biologico.Intrappolando le biomolecole in nanosfere a base di silice alcuni ricercatori hannoottenuto sistemi con elevata capacit` di immobilizzazione per le biomolecole. aLa silice ` molto utilizzata anche nell’ambito dei saggi di tipo immunologico [11]: equesti si basano sulla reazione tra un analita (antigene) e un anticorpo selettivo adare un complesso. La reazione pu` essere visualizzata in diversi modi ad esempio ocon enzimi e fluorofori. Per ottenere una elevata sensibilit` del saggio sono indi- aspensabili anticorpi con alta affinit` e appropriati supporti. a 12
  20. 20. 1.4 Materiali nanostrutturatiFigura 1.7: Pubblicazioni riguardanti applicazioni di nanoparticelle di silicefunzionalizzate nel periodo 1999-2008.Le nanoparticelle di silice hanno enorme potenzialit` come base per ottenere bio- amarker per l’imaging cellulare. Le nanoparticelle, in questo caso, possono esseredrogate con molecole fluorescenti e derivatizzate in modo che abbiano una elevataaffinit` per molecole in grado di legarsi a recettori di membrane cellulari. aProprio in virt` del suo potenziale applicativo in ambito biotecnologico, c’` la u econcreta possibilit` che questi materiali entrino in contatto con gli enzimi, mole- acole che hanno un ruolo cruciale in processi vitali, ed ` importante capire anche el’eventuale tossicit` e i problemi che, nel tempo, possono causare all’organismo. a1.4.2 α-Fosfato di zirconioI fosfati di zirconio sono una classe di composti largamente investigati in virt` udelle loro potenzialit` dal punto di vista applicativo in numerosi campi. Sono aottenuti soprattutto in forma lamellare, in diverse strutture, ognuna delle qualipossiede particolari caratteristiche [12] [13].Diversi gruppi funzionali, da super-acidi a basici, da liofili a lipofili possono essereinseriti nella struttura base del solido sia tramite sintesi diretta che attraversoprocedure specifiche quali lo scambio topotattico, reazione di scambio anionico 13
  21. 21. 1.4 Materiali nanostrutturatidi gruppi fosfato acidi superficiali della lamella con altri gruppi organo-fosfato ofosfonati.Il fosfato di zirconio monoidrato di tipo α (α-Zr(HPO4 )2 · H2 O), indicato comeα-ZrP, appartiene alla classe dei solidi lamellari carichi negativamente la cui strut-tura ` quella riportata in Figura 1.8. e Figura 1.8: Rappresentazione schematica dell’α-Zr(HPO4 )2 · H2 O.Le lamelle consistono di atomi di Zr (rosa) posti su piani al di sopra e al di sot-to dei quali si trovano alternativamente i gruppi monoidrogeno-fosfato (verde) incoordinazione tetraedrica. I tre atomi di ossigeno (blu) di ogni gruppo fosfatosono legati a tre differenti atomi di zirconio, i quali formano un triangolo equila-tero distorto; ogni atomo di Zr ` cosi coordinato ottaedricamente a sei atomi di eossigeno. Il quarto atomo di ossigeno del gruppo fosfato ` legato ad un protone e(non mostrato in figura) e punta nella regione interstrato.L’impacchettamento degli strati ` tale che ciascun atomo di Zr trova sopra e sotto edi se gli ossidrili dei due stati adiacenti; si formano quindi piccole cavit` esagonali ain cui viene ospitata una mole di acqua per peso formula. Le molecole di acquaformano dei legami a idrogeno con i gruppi fosfato ma gli strati sono tenuti insiemeda forze di Van der Waals; non ci sono dunque legami a idrogeno interstrato.Nell’α-ZrP i protoni sono in grado di diffondere attraverso il reticolo cristallino 14
  22. 22. 1.4 Materiali nanostrutturatied possono essere sostituiti con cationi metallici (es. Na+ ) (propriet` di scambio a `ionico). E possibile inserire, spesso reversibilmente, specie ospiti tra le lamellesenza alterare la struttura degli strati (propriet` di intercalazione). aIl fosfato di zirconio in forma nanostrutturata ` stato sintetizzato tramite la tec- enica della microemulsione inversa [14] o tramite reazione solvotermica [15].Il fosfato di zirconio e i suoi derivati, unendo un’ampia possibilit` di modulare le apropriet` superficiali a propriet` quali la biocompatibilit`, sono molto interessanti a a ada un punto di vista applicativo in ambito biologico. Numerosi studi riportanol’interazione di tali materiali con proteine ed enzimi [17] [18] [19], anche se datiriguardanti l’attivit` catalitica di tali sistemi sono ancora carenti. a 15
  23. 23. Capitolo 2Emeproteine e attivit` aperossidasicaGli enzimi sono proteine e rappresentano le macromolecole pi` abbondanti presen- uti nelle cellule. All’interno della cellula ci sono migliaia di differenti enzimi, ognunodei quali sovrintende uno specifico processo chimico, rendendolo possibile in tempibrevi e concertato con tutti quelli necessari alla vita cellulare. La funzione svoltada un enzima ` specificata dal DNA sotto forma di sequenza amminoacidica, la equale rappresenta la struttura primaria di una proteina. I legami peptidici sonolo scheletro della struttura proteica e si formano tra amminoacidi adiacenti coneliminazione di una molecola di acqua.La conformazione tridimensionale pu` essere descritta sulla base di tre livelli ul- oteriori: struttura secondaria, terziaria e quaternaria. Le interazioni responsabilidella stabilizzazione di questi tre livelli sono principalmente di natura non cova-lente.La struttura secondaria rende conto della disposizione nello spazio di amminoaci-di vicini ed ` dovuta alla ripetizione regolare di tratti di catena peptidica grazie eall’instaurarsi di legami a idrogeno tra un azoto amminico e l’ossigeno carbonilicotra residui distanti poche unit` amminoacidiche. Le pi` frequenti strutture secon- a udarie sono l’α-elica e il β-foglietto.La struttura terziaria riguarda la disposizione spaziale di amminoacidi lontani traloro nella struttura primaria. La stabilizzazione di questa struttura ` resa possibi- e 16
  24. 24. 2. Emeproteine e attivit` perossidasica ale da interazioni tra le catene laterali di amminoacidi non adiacenti. La strutturaquaternaria deriva dall’associazione di due o pi` catene polipeptidiche con forma- uzione di una proteina a pi` subunit`. u aOgni proteina pu` avere una sola struttura tridimensionale e ad ognuna ` asso- o eciata una specifica funzione chimica o strutturale. Le proteine hanno un ruolofondamentale praticamente in tutti i processi biologici: nel metabolismo del ciboper generare energia, nella sintesi di nuove strutture cellulari, come trasportatoridi molecole necessarie alla vita, nelle principali funzioni svolte dal sistema nervosocentrale.Da tempo ` nota anche la capacit` degli enzimi di catalizzare processi fuori dal- e al’ambiente biologico, trasformazioni che coinvolgono substrati diversi da quellinaturali e il loro impiego come biocatalizzatori si ` diffuso in diversi settori indu- estriali.I vantaggi principali legati all’utilizzo di questa classe di catalizzatori sono legatiad alcune caratteristiche peculiari degli enzimi: • selettivit`: ` la capacit` di un enzima di riconoscere uno specifico substrato a e a e promuoverne la trasformazione desiderata; • enantioselettivit`: un enzima ` in grado di discriminare un particolare a e enantiomero in una miscela racemica e catalizzarne la reazione voluta; • diastereoselettivit`: un enzima ` capace di selezionare un diastereoisome- a e ro in una miscela distereoisomerica e di favorire la sua trasformazione; • chemoselettivit`: un enzima riesce ad agire selettivamente su un gruppo a funzionale, in presenza di altri gruppi in una molecola, con reattivit` uguale a o superiore; • regioselettivit`: ` la capacit` di un enzima di riconoscere un particolare a e a gruppo funzionale tra gruppi uguali o simili presenti in un reagente e di catalizzarne la trasformazione desiderata; 17
  25. 25. 2.1 La catalisi enzimatica • utilizzo di materie prime grezze: l’alta selettivit` di un enzima permette a spesso l’utilizzo di materie prime non purificate: miscele racemiche, soluzioni proteiche, di zuccheri, brodi di fermentazione e intermedi ottenuti da processi chimici; • basso impatto ambientale: la possibilit` di eseguire reazioni in condizioni a blande e in mezzo acquoso permette la progettazione di processi con ridotto impatto ambientale in termini di consumo di solventi, trattamento degli scarichi e consumi energetici ridotti.2.1 La catalisi enzimaticaGli enzimi hanno una straordinaria forza catalitica, generalmente maggiore rispet-to ai catalizzatori di sintesi, ed un’elevata specificit` per i substrati che permette aloro di promuovere reazioni chimiche evitando la formazione di sottoprodotti. Ilprocesso di catalisi indotto da un enzima consiste nell’aumentare la velocit` di areazione e nel velocizzare il raggiungimento dello stato di equilibrio termodinami-co senza alterare il punto di equilibrio della reazione a cui partecipa.L’enzima facilita la reazione attraverso l’interazione del proprio sito attivo (sitocatalitico) con il substrato formando il complesso ES e abbassando l’energia di at-tivazione della reazione ma senza modificare la variazione di energia libera totale(Figura 2.1). Avvenuta la reazione il prodotto si stacca dall’enzima e la proteinaritorna nel ciclo catalitico.In un processo enzimatico, in generale, ` possibile distinguere tre differenti stadi: e • uno stadio pre-stazionario in cui si ha la formazione del complesso ES e la scomparsa della proteina libera e del substrato con successiva formazione del prodotto; • un secondo stadio, stazionario, con ulteriore formazione del complesso e aumento della concentrazione del prodotto; 18
  26. 26. 2.1 La catalisi enzimatica • il terzo stadio in cui il substrato ` stato completamente trasformato nel e prodotto di reazione e diminuisce la concentrazione del complesso ES. Figura 2.1: Profilo energetico di una reazione.Partendo da questa osservazione Leonor Michaelis e Maud Menten nel 1913, osser-varono che a concentrazione costante di enzima l’aumento della velocit` di reazione a` proporzionale all’aumento della concentrazione del substrato fino a quando nonesi raggiunge un valore di velocit` massima che non viene superato nemmeno au- amentando in modo significativo la quantit` di substrato. aRaggiunta la condizione di saturazione la proteina non ` pi` in grado di aumentare e ula velocit` di reazione. Il modello di Michaelis-Menten prevede il raggiungimento adi una condizione di equilibrio tra l’enzima, il substrato e il complesso ES: 1k k E + S −− ES −2 E + P −− → k−1Nel primo step, regolato dalla costante di velocit` k1 , si forma il complesso ES in amaniera reversibile. Nel secondo stadio il complesso si scinde e viene rilasciato ilprodotto di reazione e l’enzima libero (costante di velocit` k2 ). aLa velocit` massima della reazione viene raggiunta quando tutto l’enzima ` pre- a e 19
  27. 27. 2.1 La catalisi enzimaticasente in soluzione come complesso ES, condizione possibile solo a concentrazionidi substrato molto elevate.L’equazione elaborata da Michaelis-Menten ` un’espressione algebrica dell’anda- emento iperbolico che si ottiene graficando la la velocit` di reazione sperimentale ain funzione della concentrazione del substrato.L’elaborazione dell’equazione presuppone che negli istanti iniziali ci sia proporzio-nalit` tra la velocit` e la concentrazione di substrato e che sia esclusa la reazione a ainversa del secondo stadio del processo catalitico. Quindi la velocit` pu` essere a oespressa come: v = k2 [ES] (2.1)Applicando il principio dello stato stazionario, la velocit` di formazione e scom- aparsa del complesso si eguagliano: k1 [E][S] = (k−1 + k2 )[ES] (2.2) k1 [E][S] [ES] = (2.3) k−1 + k2Introducendo la costante di Michaelis-Menten come: k−1 + k2 KM = (2.4) k1l’equazione 2.3 diventa: [E][S] [ES] = (2.5) KM 20
  28. 28. 2.1 La catalisi enzimaticaConsiderando che l’enzima sia presente in concentrazioni catalitiche rispetto alsubstrato e che la sua concentrazione in soluzione sia: [E] = [ET ] − [ES] (2.6)Sostituendo la 2.6 nella 2.5 si ottiene: [ET ][S] [ES] = (2.7) [S] + KMSostituendo la 2.7 nella 2.1 si ottiene: k2 [ET ][S] v= (2.8) [S] + KMConsiderando che la velocit` massima vM AX viene raggiunta quando tutti i siti acatalitici dell’enzima sono saturi di substrato, cio` quando [S] e KM , si ottienel’equazione di Michaelis-Menten 2.10: vM AX = k2 [ET ] (2.9) vM AX [S] v= (2.10) [S] + KMLa KM , parametro fondamentale dell’equazione 2.10, ` caratteristica di ogni enzi- ema per un determinato substrato, in determinate condizioni di pH e di tempera-tura. La KM rappresenta la quantit` di substrato necessaria affinch´ la reazione a eabbia velocit` pari alla met` della velocit` massima (vM AX ). Questa costante a a adefinisce quantitativamente l’affinit` di un enzima per un substrato: pi` basso ` a u e 21
  29. 29. 2.2 Le emeproteineil suo valore, maggiore ` l’affinit` enzima-substrato e quindi minore ` la concen- e a etrazione di substrato necessaria per raggiungere un valore di velocit` che sia met` a adella velocit` massima. Viceversa, maggiore ` il valore di KM minore ` l’affinit` a e e adell’enzima per il substrato.L’altra costante importante nell’equazione di Michaelis-Menten ` kcat (= k2 ) o enumero di turnover, definita come il numero di molecole di substrato convertiteper secondo. Il rapporto kcat /KM ` un indice della capacit` catalitica dell’enzi- e ama a basse concentrazioni di substrato e spesso viene utilizzato per confrontarel’efficienza di diversi enzimi o quella di un enzima con differenti substrati. Un va-lore elevato di tale rapporto indica una buona efficienza dell’enzima in condizionifisiologicamente rilevanti.2.2 Le emeproteineLe emeproteine sono enzimi che svolgono un ruolo essenziale in molti dei processifisiologici. A questa famiglia appartengono proteine come l’Hb e la Mb, implicatenel trasporto dell’ossigeno molecolare, ma anche ossidasi, catalasi, perossidasi ecitocromi, tutte legate a processi di attivazione dell’ossigeno molecolare, alla di-stribuzione e attivazione del perossido di idrogeno e al trasferimento di elettroniall’interno della cellula. Le emeproteine sono caratterizzate dalla presenza di ungruppo eme come gruppo prostetico (piccola molecola di natura non proteica ouno ione metallico che si associa all’enzima e ne rende possibile l’attivit` catalitica atipica dell’enzima stesso), costituito da un anello porfirinico al quale ` legato un eatomo di ferro. Tale metallo, insieme al rame, ` impiegato in molti enzimi ossi- edativi data l’ampia modulabilit` della propria reattivit` al variare dello stato di a aossidazione e di coordinazione. I gruppi eme sono distinti in tipo a (farnesileme),tipo b (protoeme IX) e tipo c (mesoeme) in base ai diversi sostituenti perifericidell’anello porfirinico. L’eme b ` il pi` diffuso in natura mentre l’eme di tipo e uc ` l’unico ad essere legato covalentemente alla struttura proteica tramite ponti etioetere con i gruppi tiolici di due cisteine presenti nella proteina. 22
  30. 30. 2.2 Le emeproteineLe propriet` delle emeproteine sono fortemente influenzate dalla struttura pro- ateica; l’intorno amminoacidico del sito attivo ne determina l’attivit`, imponendo ala natura e le dimensioni della sacca in cui ` inserito l’eme stesso e del canale ed’accesso al sito stesso dall’esterno dell’enzima.2.2.1 MioglobinaLa Mb ` la prima proteina di cui sia stata risolta la struttura ai raggi X grazie eal lavoro di John Kendrew [20]; ` piccola (dimensioni approssimate di 4.5∗3.5∗2.5 enm3 , peso = 17800 Da) e costituita da una catena polipeptidica singola e dalgruppo eme di tipo b.L’apoproteina della Mb, denominata globina, ` costituita da 153 amminoacidi or- eganizzati in una struttura secondaria in cui sono individuabili otto regioni con con-formazione α-elica (A-H), cinque segmenti non elicali che uniscono α-eliche adia-centi e due frammenti terminali, uno ammino-terminale (N-A) ed uno carbossil-terminale (H-C). Figura 2.2: Struttura della mioglobina.L’eme ` costituito da un anello tetrapirrolico chiamato protoporfirina IX che lega e 23
  31. 31. 2.2 Le emeproteinelo ione Fe2+ . I quattro anelli pirrolici sono legati da ponti -CH= cos` che l’in- ıtera struttura della porfirina risulta insatura e planare. Quattro gruppi metilici,due gruppi vinilici e due propionilici ionizzati sono legati all’anello tetrapirrolico.L’Fe2+ sostituisce due protoni della porfirina IX. Il complesso Fe-protoporfirinaIX ` un ibrido di risonanza in cui il ferro risulta legato ai quattro atomi di azoto edella protoporfirina IX.L’interno della Mb ` caratterizzato dalla presenza di residui altamente idrofobici e(Val, Ile, Phe e Met) mentre in superficie si trovano sia residui idrofili che idrofo-bici. Le molecole di acqua sono, in generale, escluse dalla porzione interna dellaproteina e la maggior parte dei residui ionizzabili ` localizzata sulla superficie; etuttavia alcuni amminoacidi ionizzabili si possono trovare in corrispondenza ditasche accessibili a molecole che si legano in modo specifico alla proteina stessa.La propriet` principale di questo enzima (nella forma Fe2+ ) ` la capacit` di le- a e agare reversibilmente l’ossigeno molecolare, svolgendo la funzione di deposito neltessuto muscolare e aiutando la diffusione dell’ossigeno dai capillari all’ambien-te intracellulare, dove viene utilizzato per produrre energia. La formazione dellegame reversibile tra la Mb e l’ossigeno ` denominata ossigenazione: l’accessibi- elit` dell’eme dipende dal movimento di catene laterali di amminoacidi situati in aprossimit` dell’eme stesso. L’His 64, detta distale, ` un residuo non legato covalen- a etemente all’eme che svolge un ruolo cruciale per l’attivit` di trasporto dell’ossigeno ada parte della Mb in quanto assiste la coordinazione dell’ossigeno al ferro eminico;l’His 93, detta prossimale, contribuisce a trattenere il ferro all’interno dell’eme(Figura 2.3).Il sito attivo della Mb presenta molte analogie strutturali con quello di alcuneperossidasi, sia per la presenza del gruppo prostetico che delle due istidine: essa` quindi in grado di catalizzare anche reazioni ossidative di substrati micro e ma-ecromolecolari da parte di perossidi come il perossido di idrogeno o alchilperossidi. 24
  32. 32. 2.2 Le emeproteineFigura 2.3: Struttura dell’eme e di alcuni residui presenti nel sito catalitico dellamioglobina.2.2.2 Citocromo CIl CytC ` una piccola proteina globulare le cui dimensioni sono 2.6∗3.0∗3.2 nm3 e eil cui peso ` 12360 Da. eL’atomo di ferro legato all’eme ` esacoordinato, con i residui His 23 e Met 80 ad eoccupare la quinta e sesta posizione di coordinazione del metallo.Il gruppo eme (tipo c) ` legato covalentemente, attraverso due legami tioetere, ealla catena polipeptidica ed esattamente ai residui 14 e 17. Un legame di questotipo fa si che l’eme si trovi pi` vicino alla parte N-terminale della catena rispetto ua quanto accade per l’eme non covalentemente legato della Hb e Mb. Ci` non o` inaspettato in virt` delle diverse funzioni del CytC rispetto alle proteine chee utrasportano ossigeno.Una estremit` del gruppo eme ` quindi esposta verso l’esterno e numerosi residui a edi Lys sono posizionati vicino o attorno alla tasca eminica, che risulta essere unaregione carica positivamente. Questa carica positiva intorno al sito catalitico ` eimplicata nell’interazione tra il CytC e i suoi partner redox nei processi di trasfe-rimento elettronico. 25
  33. 33. 2.2 Le emeproteine Figura 2.4: Struttura del citocromo C.In generale quando si parla di CytC ci si riferisce alla proteina mitocondriale, re-sponsabile del trasporto di elettroni dalla citocromo C reduttasi alla citocromo Cossidasi nel processo di respirazione cellulare. Durante quest’ultimo il CytC vieneridotto e si sposta nella membrana interna del mitocondrio, dove interagisce conla citocromo C ossidasi cedendole un elettrone.Come biocatalizzatore [21] il Cytc presenta alcuni vantaggi: • l’eme legato covalentemente alla proteina pu` costituire un vantaggio nel caso o in cui la catalisi avvenga in solvente organico in quanto la perdita dell’eme ` impedita; e • ` uno dei pochi enzimi attivo in un range di pH molto ampio; e • il CytC ` in grado di catalizzare reazioni fino a temperature di 120 ◦ C, con e un massimo di attivit` raggiunto a 80 ◦ C; a • il basso costo e l’elevata stabilit` sono due dei principali fattori per il suo a possibile impiego in biocatalisi su larga scala.Il CytC mostra attivit` di tipo perossidasico, essendo in grado di catalizzare rea- azioni di ossidazione di molecole ricche di elettroni in presenza di H2 O2 . 26
  34. 34. 2.2 Le emeproteineLa Met 80, che occupa la sesta posizione di coordinazione del ferro dell’eme, haun ruolo importante nel determinare la capacit` catalitica dell’enzima: la presen- aza di questo residuo amminoacidico nel sito attivo determina la minore efficienzacome perossidasi del CytC rispetto a una vera perossidasi. Tuttavia, la rotturadel legame Fe-S (Met) pu` facilitare l’accesso del substrato (H2 O2 ) nel sito attivo odell’enzima e migliorarne l’attivit` perossidasica. a2.2.3 Interazione di emeproteine con materiali nanostrutturatiMolti gruppi di ricerca hanno posto l’attenzione sull’effetto che i nanomaterialiposso avere sulla struttura, sulla stabilit` e attivit` di emeproteine, quali la Mb e a ail CytC.L’adsorbimento di queste proteine su nanoparticelle di silice ` stato indagato dal e `punto di vista strutturale tramite dicroismo circolare e spettroscopia UV. E statovisto che la Mb, proteina soft, tende a legarsi alla superficie modificando lievemen-te la sua struttura secondaria e terziaria; mentre il CytC, proteina hard, si legasenza subire alterazioni significative della configurazione nativa [22].Dal punto di vista della funzionalit` biologica di tali molecole, i dati di letteratura asono in genere di tipo qualitativo e comunque carenti.Per quanto riguarda la Mb, ci sono soltanto studi condotti su materiali silicei ditipo mesoporoso, i quali riportano una ritenzione di attivit` catalitica della pro- ateina immobilizzata.Nel caso del CytC, studi riguardanti l’interazione con derivati silicei mesoporosiriportano un aumento dell’attivit` perossidasica della proteina dovuta a cambia- amenti dello stato di spin del ferro dell’eme [23].I dati di letteratura riguardanti l’attivit` catalitica del CytC adsorbito su nano- aparticelle di silice sono piuttosto controversi [24] [25].L’interazione della Mb e del CytC con fosfati e fosfonati di zirconio ` stata indagata eutilizzando essenzialmente materiali di tipo lamellare e di dimensioni micrometri- 27
  35. 35. 2.3 Attivit` perossidasica e studi cinetici ache.I dati disponibili sulla Mb riportano di solito una diminuzione dell’attivit` catali- atica della proteina adsorbita su fosfati e fosfonati di zirconio [26].Studi riguardanti la struttura e l’attivit` perossidasica del CytC adsorbito su aα-ZrP evidenziano un aumento dell’attivit` catalitica della proteina come conse- aguenza di modifiche dello stato di coordinazione del ferro dell’eme [17].In conclusione, nonostante l’adsorbimento di proteine sia un argomento di ricercamolto indagato, sono ancora pochi i risultati ottenuti in termini di modulazionedell’attivit` catalitica con materiali nanostrutturati. a2.3 Attivit` perossidasica e studi cinetici aLe perossidasi sono enzimi che, sulla base della loro sequenza amminoacidica edella struttura ai raggi X, possono essere raggruppati in due grandi famiglie aseconda che siano di origine vegetale o animale.Nelle piante esse svolgono molte funzioni tra le quali quella di difesa da agentipatogeni, contribuendo alla sintesi della parete cellulare grazie alla loro capacit` adi produrre composti polimerici.Negli animali le perossidasi svolgono funzioni di tipo antibatterico (lattoperossi-dasi nel latte, nella saliva e nelle lacrime), biosintetico (tiroide perossidasi nellasintesi di ormoni tiroidei, prostaglandina H sintasi nel metabolismo dei lipidi) e dieliminazione di agenti nocivi per la cellula.Le perossidasi catalizzano reazioni di ossidazione di substrati da parte di perossidicome il perossido di idrogeno: 2SH + H2 O2 → 2S + 2H2 OIl ciclo catalitico prevede la formazione di due intermedi enzimatici, chiamatiComposto I e Composto II, con elevato potere ossidativo e l’ossidazione monoe-lettronica dei substrati (Figura 2.5). Gli intermedi sono stati caratterizzati grazieall’utilizzo di diverse tecniche spettrofotometriche quali UV-Vis e RAMAN. 28
  36. 36. 2.3 Attivit` perossidasica e studi cinetici a Figura 2.5: Meccanismo di reazione delle perossidasi.Nella prima fase del ciclo catalitico il perossido di idrogeno si coordina al ferro(Fe3+ ) dell’eme nella forma nativa con formazione di un perosso-composto del ferroa basso spin. L’His presente in prossimit` dell’eme nella cavit` distale promuove a ala coordinazione appena descritta.Il perosso-composto ha un tempo di vita estremamente limitato e subisce la rot-tura eterolitica del legame O-O. L’intermedio che si forma, il composto I, ` un eradicale catione porfirinico ed ha il ferro, in stato d’ossidazione IV, legato ad unatomo di ossigeno. 29
  37. 37. 2.3 Attivit` perossidasica e studi cinetici aIl Composto I ha un’elevata tendenza ad estrarre un elettrone da substrati che nesono ricchi trasformandosi nel Composto II, che ha perso la caratteristica di radi-cale catione ma presenta il ferro ancora nello stato IV legato all’ossigeno. Questaspecie ha un elevato potere ossidativo, anche se minore del Composto I, ed inte-ragisce con un’altra molecola di substrato trasformandolo in radicale. L’enzimaritorna quindi nella forma nativa (Fe3+ ) e l’ossigeno ferrilico viene rilasciato sottoforma di una molecola di acqua.Lo stadio lento dell’intero ciclo ` solitamente il terzo, ovvero l’ossidazione della se- econda molecola di substrato. Durante il ciclo catalitico si pu` avere la formazione odi altri intermedi: il pi` importante tra questi ` il Composto III, specie poco attiva u edal punto di vista dell’attivit` perossidasica, che si forma a partire dal Composto aII per eccesso di H2 O2 .Non essendoci selettivit` per i substrati alcune proteine con attivit` perossidasica a apossono catalizzare reazioni diverse come solfonazioni di solfuri, epossidazioni distireni, N-dealchilazioni di ammine ed anche ossidazioni di substrati inorganicicome I− e SCN− .I substrati tipici per le perossidasi sono i composti fenolici che rappresentano unadelle principali famiglie di sostanze inquinanti nel settore agroindustriale. Da quiil crescente interesse riguardo le perossidasi in ambito biotecnologico per il loroutilizzo in processi di decontaminazione ambientale. L’attivit` perossidasica pu` a oanche essere sfruttata per produrre sostanze ad azione antibatterica o antimicro-bica.Il substrato utilizzato in questo lavoro per studiare l’attivit` catalitica della Mb e adel CytC ` il 2-metossifenolo o guaiacolo (Figura 2.6). eIl substrato nel ciclo catalitico delle perossidasi reagisce nel secondo e terzo stadio `in una sorta di meccanismo tipo ping-pong trimolecolare. E per` possibile ridurlo oa bimolecolare in quanto il Composto I, che ha un potere ossidativo elevato, ` epresente in concentrazioni cosi basse da poter essere trascurato. 30
  38. 38. 2.3 Attivit` perossidasica e studi cinetici a Figura 2.6: Reazione di ossidazione del guaiacolo.L’equazione cinetica che descrive il processo ` la seguente: e kcat [E] V = KM 1 KM 2 (2.11) 1+ H2 O2 + [S]dove kcat ` la costante di velocit` della reazione globale, KM 1 e KM 2 sono le e acostanti di Michaelis-Menten dei processi 1 e 3 e [E] ` la concentrazione totale di eenzima.Utilizzando un elevata concentrazione di perossido di idrogeno si pu` trascurare il osecondo termine a denominatore e l’equazione cinetica acquista una forma similea quella di Michaelis-Menten: kcat [E] kcat [E][S] V = KM 2 = (2.12) 1 + [S] [S] + KM 2L’equazione 2.12 pu` assumere la forma seguente: o VM AX [S] V = (2.13) [S] + KM 2dove VM AX = kcat [E]. Durante il turnover la specie enzimatica presente nel sistemain forma maggioritaria ` il Composto II e la velocit` di reazione registrata ` quella e a erelativa allo step 3: 31
  39. 39. 2.3 Attivit` perossidasica e studi cinetici a CompostoII + SH → E(F e3+ ) + S·In condizioni di saturazione di perossido di idrogeno il processo enzimatico si pu` oassimilare al seguente: k1 k2 CompostoII + SH −− CompostoII − SH −−E + P −− k−1 k−1 + k2 kcat k1 k2 kcat = k2 KM = = (2.14) k1 KM k−1 + k2Nel caso in cui k2 k−1 si ha che KM = k−1 /k1 , espressione che rappresenta lacostante di dissociazione del complesso CompostoII-S per cui si pu` affermare che ola KM ` una misura dell’affinit` dell’enzima per il substrato. Il valore di questo e aparametro ` legato all’energia del complesso substrato-specie attiva e tanto pi` ` e uepiccolo il suo valore pi` ` favorita la formazione del complesso. Il valore di KM ueper un enzima ` specifico per ogni substrato, in determinate condizioni di pH e etemperatura.Il termine kcat ` legato al trasferimento elettronico dal substrato alla specie atti- eva; un valore elevato di questo parametro ` indice di un pi` facile trasferimento e uelettronico.Il rapporto kcat /KM tiene conto di tutti i fattori prima considerati ed ` utilizzato ecome indice della capacit` catalitica dell’enzima in condizioni di basse concentra- azioni di substrato: un valore elevato di questo rapporto indice di buona efficienzanel processo catalitico.In condizioni di forte eccesso di H2 O2 si pu` avere l’inattivazione della proteina o `per formazione del Composto III non pi` attivo. E necessario ottimizzare la quan- utit` di perossido di idrogeno, studiando l’andamento della velocit` di reazione in a afunzione della concentrazione di perossido e scegliendo quella a saturazione, cor-rispondente a un punto sul plateau, prima che la curva inizi la fase discendente,indice di inibizione (formazione del Composto III) o inattivazione dell’enzima.Per seguire l’andamento della velocit` in funzione della concentrazione di perossido a 32
  40. 40. 2.3 Attivit` perossidasica e studi cinetici adi idrogeno occorre operare con forte eccesso di substrato, cos` da poter trascu- ırare il termine KM2 /[S] nella equazione 2.11. Tuttavia, per evitare inibizione dasubstrato, anche la concentrazione di quest’ultimo deve essere ottimizzata. L’ot-timizzazione delle condizioni di reazione avviene pertanto con processo iterativo.Per gli studi cinetici si seguono gli istanti iniziali della reazione in modo da conside-rare le concentrazioni istantanee pari a quelle iniziali e da mettersi nelle condizionidi pseudo ordine zero. Questa scelta permette anche di trascurare l’eventuale for-mazione di derivati, ottenuti dalla ricombinazione dei prodotti di reazione, che sisuppone non si verifichi negli istanti iniziali del processo.Le reazioni vengono seguite per mezzo di uno spettrofotometro UV-Vis osservan-do l’andamento nel tempo dell’assorbanza nella regione delle bande caratteristichedel prodotto.Negli istanti iniziali si osserva un andamento lineare dell’assorbanza in funzio-ne del tempo, la cui pendenza (dA/dt) fornisce la velocit` di reazione secondo al’equazione: dA d[P ] =l·ε· (2.15) dt dtdove l ` il cammino ottico della cuvetta utilizzata, ε ` il coefficiente di estinzione e emolare del prodotto e d[P ]/dt ` la velocit`. e aI parametri cinetici vengono ricavati riportando i dati relativi alla velocit` in afunzione della concentrazione di substrato e interpolando la curva con l’equazione2.12 (Figura 2.7). 33
  41. 41. 2.4 Equilibri di formazione di complessi proteina- ligandoFigura 2.7: Profilo della velocit` di reazione in funzione della concentrazione di asubstrato.2.4 Equilibri di formazione di complessi proteina- ligandoLe funzioni di molte proteine richiedono il legame con altre molecole dette ligandi.L’interazione proteina-ligando ` reversibile e dipende dalla struttura della protei- ena; inoltre si associa spesso a modificazioni conformazionali che ne influenzanol’attivit` e la specificit`. a aIl legame tra una proteina (E) ed un ligando (L) determina la formazione delcomplesso EL: E+L EL [EL] KB = = costante di associazione (2.16) [E][L] 1 KD = = costante di dissociazione (2.17) KBLa KD esprime l’affinit` dei una proteina per il ligando (pi` basso ` il suo valore, a u epi` l’interazione proteina-ligando ` forte). u e 34
  42. 42. 2.4 Equilibri di formazione di complessi proteina- ligandoNel caso della Mb, la coordinazione del ferro nel gruppo eme determina la possi-bilit` di legame con molecole quali l’imidazolo e l’azide [27] [28]. aQueste sono infatti in grado di penetrare all’interno del sito attivo e coordinarsiall’atomo di ferro, prendendo il posto della molecola di acqua che si trova debol-mente legata, occupando la sesta posizione di coordinazione.Dato che questi ligandi instaurano un legame forte con il ferro, al contrario del-l’acqua, la proteina passa da uno stato esa-coordinato ad alto spin (6c-HS) ad unostato esa-coordinato a basso spin (6c-LS).Queste due forme possiedono assorbimenti nella regione Soret differenti tra loro.Durante la formazione del complesso per aggiunte successive di ligando, le speciepresenti in soluzione sono due ed in equilibrio fra di loro. Pertanto l’assorbanzadella soluzione, per ciascun valore di λ, ` dato dalla somma delle assorbanze delle edue specie: A = AE(6c−HS) + AEL(6c−LS) = εE ∗ cE + εEL ∗ cEL (2.18)Sapendo che [E0 ] = [EL] + [E] e [L0 ] = [EL] + [L], si pu` ricavare, unitamente oalla 2.16, un’espressione matematica per [EL].Sperimentalmente si misura la variazione di assorbanza di soluzioni a concentra-zione fissa di enzima a cui sono aggiunti volumi fissati di soluzioni di legando atitolo noto; essa dipende direttamente dalla frazione di enzima legata al legando,in accordo con l’equazione 2.19: [EL] ∆A = ∆A∞ (2.19) [E0 ]dove ∆A indica la variazione di assorbanza dopo ogni aggiunta rispetto al valoreottenuto per la proteina non complessata e ∆A∞ ` la variazione di assorbanza equando tutto l’enzima ` legato. eSostituendo la [EL] precedentemente trovata nell’equazione 2.19 si ottiene l’equa- 35
  43. 43. 2.4 Equilibri di formazione di complessi proteina- ligandozione 2.20: ∆A∞ 2∆A = KB ([E0 ] + [L0 ]) + 1 − KB ([L0 ] − [E0 ])2 + 2KB ([L0 ] + [E0 ]) + 1 2[E0 ]KB (2.20)Riportando in grafico ∆A in funzione [L0 ] e fittando la curva ottenuta con l’equa-zione precedente, si possono ottenere i valoti di KB e ∆A∞ . 36
  44. 44. Capitolo 3Scopo del lavoroLo scopo di questo lavoro di tesi ` studiare il comportamento di sistemi proteici enel momento in cui vengono a contatto con materiali di dimensioni nanometriche.Le proteine scelte, quali la Mb e il CytC, sono comuni enzimi presenti nel nostroorganismo, dove svolgono un ruolo cruciale in processi biologici vitali.I materiali nanostrutturati scelti, la silice e il fosfato di zirconio, appartengonoalla classe di materiali inorganici aventi caratteristiche superficiali di tipo idrofi-lico. Entrambi possiedono dimensioni comprese tra 20 e 40 nm e gruppi ossidrilein superficie con carattere acido.Vista l’enorme diffusione delle nanotecnologie in numerosi ambiti pu` risultare ofacile per materiali nanostrutturati di tal genere venire a contatto con sistemi di `natura biologica. E quindi fondamentale capire che tipo di risposta danno sistemiche sovrintendono a processi vitali per l’organismo, quali proteine ed enzimi, inpresenza di materiali di questo tipo.Il primo passo da fare per seguire tale obiettivo ` cercare di capire se la presenza edi nanoparticelle modifica la propriet` principale che un enzima possiede, ovvero al’attivit` catalitica. Se c’` un cambiamento della velocit` del processo preso in a e aesame significa che le nanoparticelle in qualche modo interferiscono con il normaledecorso reattivo e quindi si `, molto probabilmente, in presenza di un’interazione etra la proteina e la superficie del materiale nanometrico. L’assenza di modifichenell’attivit` catalitica di un enzima non necessariamente esclude l’interazione tra a 37
  45. 45. 3. Scopo del lavorola proteina e il materiale, poich´ potrebbe comunque essere avvenuta senza com- eportare variazioni nella funzionalit` del sistema. aL’instaurarsi di interazioni proteina-materiali si pu` in genere verificare tramite orecupero del biocomposito, ovvero della proteina adsorbita, dal mezzo di reazionetramite centrifugazione. Tale procedura consente inoltre di quantificare la protei-na adsorbita per differenza con quella ritrovata nel surnatante. Il biocompositocosi ottenuto pu` essere utilizzato in biocatalisi ma si ` visto che molto spesso o ein questo modo si altera in maniera negativa l’attivit` catalitica della proteina in aseguito alla centrifugazione.In questo lavoro, la scelta di utilizzare materiali sotto forma di nanoparticelle haconsentito di testare direttamente l’attivit` catalitica delle proteine, senza bisogno adi recuperare il biocompostito per centrifugazione. Questo perch´ le sospensioni edi nanoparticelle sono otticamente semi-trasparenti e consentono di limitare alminimo il fenomeno dello scattering.Una volta stabilito che si instaura una interazione proteina-nanoparticelle il pas-so successivo ` capire se l’interazione ha portato come conseguenza cambiamenti econformazionali, i quali a loro volta potrebbero essere la causa della modificazionedell’attivit` catalitica osservata. aTramite studi di tipo spettroscopico ` possibile stabilire se l’interazione provoca ecambiamenti a livello della struttura secondaria e terziaria della proteina e, in par-ticolare per le emeproteine, se la regione del sito attivo e il gruppo eme subisconomodifiche.Successivamente, sulla base di informazioni strutturali che si hanno a disposizionesia per il materiale che per la proteina, ` possibile fare delle ipotesi sulla natura edell’interazione e condurre esperimenti mirati a confermare tale ipotesi. Ad esem-pio, in presenza di interazioni elettrostatiche si ha una significativa dipendenzadell’adsorbimento dalla forza ionica. Un aumento di tale parametro comporta ilrilascio della proteina dalla superficie, confermando la natura elettrostatica del-l’interazione. 38
  46. 46. 3. Scopo del lavoroLa possibilit` di derivatizzare superficialmente la silice ha inoltre consentito di avariare le cariche presenti, passando da gruppi ossidrili a gruppi amminici, al fi-ne di vedere l’effetto sull’adsorbimento delle proteine in esame ed eventualmenteconfermare ulteriormente la natura elettrostatica dell’interazione.Un altro punto molto importante da chiarire ` in quale zona della superficie pro- eteica ` avvenuta l’interazione con il nanomateriale. In questo modo ` possibile e ecapire se ci possono essere delle ripercussioni sul sito attivo della proteina stessa.Questo aspetto ` stato affrontato tramite studi riguardanti la complessazione della eMb con ligandi carichi quali ad esempio l’azide.Una eventuale interazione coinvolgente la zona del sito attivo comporterebbe infat-ti ripercussioni non solo sull’attivit` catalitica ma anche sulle costanti di equilibrio aper la formazione del complesso proteina-ligando. 39
  47. 47. Capitolo 4Risultati e discussioneIn questo lavoro di tesi si ` voluto indagare il comportamento di due emeproteine, ela Mb e il CytC, in presenza di materiali nanostrutturati.Dati i punti isoelettrici delle proteine, 7.2 per la Mb e 10.2 per il CytC, il ma-teriale che meglio si adatta ad un’interazione di tipo elettrostatico deve possede-re una superficie carica negativamente a pH fisiologico. Per questo motivo si ` escelta inizialmente la silice colloidale commercialmente nota come Ludox TM-40.La sospensione Ludox TM-40 ha tutte le caratteristiche richieste per il tipo diproblematica che si vuole affrontare: • sospensione colloidale in H2 O (40% in peso di silice); • densit` 1,3 g/mL a 25 ◦ C; a • dimensione delle nanoparticelle 20-30 nm; • area superficiale 140 m2 /g; • pH ∼ 9; • pI ∼ 2.La gran parte dei lavori di letteratura riportano l’utilizzo di nanoparticelle di si-lice, o suoi derivati, di dimensioni micrometriche o dell’ordine dei 100 nm. Perquesto lavoro si ` utilizzata silice con dimensioni pi` piccole, 20-nm, confrontabili e u 40
  48. 48. 4.1 Interazione della mioglobina con nanoparticelle di silice Ludox TM-40con quelle degli enzimi di interesse (4-5 nm). Ci` garantisce infatti un’ampia area osuperficiale e quindi la possibilit` di interazione per un elevato numero di moleco- ale.Inoltre, un punto isoelettrico di due assicura che, a pH sperimentale (pH 7), lasuperficie delle nanoparticelle ` carica negativamente e quindi potenzialmente in egrado di interagire con Mb e CytC.I gruppi OH della silice possono essere facilmente sostituiti con funzionalit` di va- ario tipo: ammine, aldeidi, gruppi carbossilici, tioli, epossidi e gruppi etero-atomici.Esistono vari metodi per ottenere nanoparticelle di silice funzionalizzate. Ad esem-pio, si pu` effettuare la condensazione del TEOS con appropriati silani contenenti oi gruppi funzionali desiderati oppure derivatizzare successivamente la silice con ilsilano.Nel nostro caso, ` stata utilizzata la seconda procedura per introdurre gruppi am- eminici sulla superficie.La silice Ludox TM-40 ` stata fatta reagire con l’amminopropiltrietossisilano e(APTES) secondo lo schema riportato in Figura 4.1 [29]. Figura 4.1: Sintesi di nanoparticelle di SiO2 -APTES.4.1 Interazione della mioglobina con nanoparticelle di silice Ludox TM-404.1.1 Attivit` catalitica della mioglobina in presenza di SiO2 aNella prima fase di questo lavoro si ` studiato il comportamento della Mb in pre- esenza di nanoparticelle di silice Ludox TM-40.Il primo punto affrontato ` stato lo studio dell’attivit` catalitica della Mb al variare e a 41
  49. 49. 4.1 Interazione della mioglobina con nanoparticelle di silice Ludox TM-40della concentrazione di nanoparticelle di Ludox TM-40: ` stata seguita la reazione edi ossidazione del guaiacolo catalizzata dalla Mb e mediata da H2 O2 in tamponefosfato 10 mM e pH 7, in presenza di concentrazioni variabili di nanoparticelle.La reazione che porta alla formazione di un tetramero colorato ` stata seguita allo espettrofotometro UV-Vis alla lunghezza d’onda di 470 nm. La velocit` iniziale arilevata per ogni esperimento ` stata confrontata con quella riscontrata con la Mb enativa.I dati ottenuti evidenziano che la velocit` della reazione di ossidazione aumen- ata al crescere della concentrazione di nanoparticelle in soluzione (Figura 4.2 eFigura 4.3). Questo risultato indica che mettendo a contatto nanoparticelle consuperficie carica negativamente con la proteina (globalmente neutra nelle condizio-ni sperimentali) si stabilisce un’interazione che ha un effetto positivo sull’attivit` acatalitica della Mb.Per avere la conferma che la Mb interagisce con la superficie del nanomateriale,la proteina ` stata messa a contatto con campioni contenenti concentrazioni cre- escenti di nanoparticelle (sono state usate le stesse concentrazioni relative di Mb edi nanoparticelle utilizzate per gli esperimenti di attivit` catalitica). Dopo aver acentrifugato i campioni, ` stata misurata la concentrazione residua di Mb nel sur- enatante ed ` stato verificato che oltre il 90 % della proteina totale si adsorbe sulla esuperficie della silice. 42
  50. 50. 4.1 Interazione della mioglobina con nanoparticelle di silice Ludox TM-40Figura 4.2: Variazione di assorbanza (λ = 470 nnm) in funzione del tempo perla reazione di ossidazione del guaiacolo catalizzata dalla mioglobina, in presenzadi nanoparticelle di SiO2 .Figura 4.3: Attivit` catalitica della mioglobina nella reazione di ossidazione del aguaiacolo, mediata da H2 O2 , in funzione della concentrazione di Ludox TM-40. Ulteriori informazioni sull’effetto che le nanoparticelle hanno sulla Mb si pos- 43

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