Bachelor's Degree Thesis in clinical chemistry by Dimitrios Livas and Petros Antoniou

1. ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ
Σύγκριση δύο ηλεκτροφορητικών τεχνικών για την ανάλυση πρωτεϊνών
σε δείγματα ορού
Πέτρος Αντωνίου
Δημήτρης Λιβάς
Επιβλέπουσα Καθηγήτρια: Δρ. Ευρύκλεια Λιανίδου,
Καθηγήτρια Αναλυτικής Χημείας - Κλινικής Χημείας

2. 2
Ευχαριστίες
Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε την κα. Ευρύκλεια Λιανίδου PhD, Καθηγήτρια Αναλυτικής Χημείας-
Κλινικής Χημείας του τμήματος Χημείας στο Πανεπιστήμιο Αθηνών για τον συντονισμό και την
υποστήριξη καθ’ όλη τη διάρκεια αυτής της εργασίας.
Θερμές ευχαριστίες στην κα. Ευδοξία Πουλάκη, Χημικό PhD, επιστημονικά υπεύθυνη του
Βιοχημικού Εργαστηρίου του Γενικού Αντικαρκινικού-Ογκολογικού Νοσοκομείου «Ο Άγιος Σάββας»
που μας έδωσε την δυνατότητα να πραγματοποιήσουμε το πειραματικό μέρος της εργασίας εντός
του εργαστηρίου του νοσοκομείου, για την επιστημονική καθοδήγηση, καθώς επίσης και για τις
πολύτιμες συμβουλές της.
Επίσης, ευχαριστούμε το σύνολο του προσωπικού του εργαστηρίου για την βοήθεια που μας
παρείχε και ιδιαίτερα τις κυρίες Κούρτη Αναστασία-Έλλη PhD και Παπανδρέου Αικατερίνη PhD, που
ήταν πάντα πρόθυμες να μας βοηθήσουν και να μας καθοδηγήσουν.

3. 3
Πίνακας Περιεχομένων
Ευχαριστίες.............................................................................................................................................2
1. Σκοπός της εργασίας...........................................................................................................................5
2. Δείγματα ορού....................................................................................................................................6
3. Οι πρωτεΐνες του πλάσματος .............................................................................................................8
3.1 Λειτουργίες, χαρακτηριστικά και δομή πρωτεϊνών πλάσματος ..................................................8
3.2 Μερικές από τις κυριότερες πρωτεΐνες......................................................................................12
3.2.1 Τρανσθυρετίνη (προαλβουμίνη) .........................................................................................13
3.2.2 Λευκωματίνη........................................................................................................................14
3.2.3α1-σφαιρίνες .........................................................................................................................16
3.2.4 α2-σφαιρίνες ........................................................................................................................17
3.2.5 β-σφαιρίνες..........................................................................................................................19
3.2.6 Ανοσοσφαιρίνες...................................................................................................................20
4. Ηλεκτροφόρηση Πρωτεϊνών.............................................................................................................24
4.1 Ιστορικά στοιχεία........................................................................................................................24
4.2 Θεωρητική βάση των ηλεκτροφορητικών τεχνικών...................................................................27
4.3 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή αγαρόζης.......................................................................29
4.4 Ηλεκτροφόρηση Τριχοειδούς.....................................................................................................33
4.4.1 Τυπική Οργανολογία............................................................................................................34
4.4.2 Χαρακτηριστικά και ιδιότητες της τριχοειδικής ηλεκτροφόρησης .....................................35
4.4.3 Εισαγωγή δείγματος ............................................................................................................38
4.4.4 Ανίχνευση.............................................................................................................................39
4.4.5 Εφαρμογές...........................................................................................................................40
4.5 Αξιολόγηση ηλεκτροφορημάτων πρωτεϊνών ορού....................................................................44
4.5.1 Προαναλυτικοί παράγοντες - χρόνος αποθήκευσης του δείγματος...................................46
4.5.2 Ύπαρξη Ινωδογόνου.............................................................................................................47
4.5.3 Νεφρωσικό σύνδρομο .........................................................................................................48
4.5.4 Αντίδραση οξείας φάσης και φλεγμονή..............................................................................49
4.5.5 Υπεργάμμασφαιριναιμία και παραπρωτεϊναιμία...............................................................50
4.5.6 Υπογαμμασφαιριναιμία.......................................................................................................51
5. Πειραματικό μέρος...........................................................................................................................52
5.1 Διαδικασία ηλεκτροφόρησης σε πηκτή αγαρόζης .....................................................................53
5.2 Διαδικασία ηλεκτροφόρησης τριχοειδούς.................................................................................59
5.3 Προσδιορισμός λόγου λευκωματίνης/σφαιρινών .....................................................................62

4. 4
5.4 Στατιστική επεξεργασία..............................................................................................................63
5.6 Κλινικές πληροφορίες από επιλεγμένα ηλεκτροφορήματα.......................................................71
5.6.1 Πιθανές περιπτώσεις παραπρωτεϊναιμίας..........................................................................71
5.6.2 Πιθανή περίπτωση αντίδρασης οξείας φάσης....................................................................72
5.6.3 Πιθανές περιπτώσεις κίρρωσης του ήπατος.......................................................................73
5.6.4 Πιθανή περίπτωση δισλευκωματιναιμίας...........................................................................74
6. Συμπεράσματα..................................................................................................................................75
Βιβλιογραφία........................................................................................................................................76

5. 5
1. Σκοπός της εργασίας
H πτυχιακή αυτή εργασία εκπονήθηκε στα πλαίσια του μαθήματος «Κλινική Χημεία». Σκοπός της
είναι η σύγκριση δύο διαφορετικών ηλεκτροφορητικών τεχνικών για την ανάλυση των πρωτεϊνών
σε δείγματα ανθρώπινου ορού.
Για τις ανάγκες της εργασίας, πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης όπως επίσης
και ηλεκτροφόρηση τριχοειδούς σε 97 δείγματα ανθρώπινου ορού. Οι αναλύσεις έλαβαν χώρα
κατά το διάστημα Μαΐου - Ιουλίου του 2016 εντός του Βιοχημικού Εργαστηρίου του Γενικού
Αντικαρκινικού-Ογκολογικού Νοσοκομείου «Ο Άγιος Σάββας», Επιστημονικά Υπεύθυνη του οποίου
είναι η κα. Ευδοξία Πουλάκη (Χημικός, PhD).
Τα αποτελέσματα των αναλύσεων έγιναν αντικείμενο στατιστικής επεξεργασίας.
Ακολούθησε βιβλιογραφική έρευνα πάνω στο αντικείμενο των πρωτεϊνών ορού και του
διαχωρισμού τους μέσω των δύο αυτών ηλεκτροφορητικών τεχνικών.

6. 6
2. Δείγματα ορού
Από το σύνολο των βιολογικών υγρών, το ολικό αίμα, ο ορός και το πλάσμα, αποτελούν τα πιο
συχνά δείγματα προς ανάλυση εντός των κλινικών εργαστηρίων. Πρόκειται για ένα ιξώδες μίγμα
που αποτελείται από ένα υγρό τμήμα, το πλάσμα, και από έμμορφα συστατικά (ερυθρά και λευκά
αιμοσφαίρια, αιμοπετάλια) τα κύτταρα δηλαδή που αιωρούνται μέσα στο πλάσμα. [1, 2]
Καθώς τα έμμορφα συστατικά του ολικού αίματος μπορούν να προκαλέσουν αρκετές
παρεμποδίσεις, οι περισσότεροι βιοχημικοί προσδιορισμοί γίνονται στο πλάσμα και στον ορό. Το
πλάσμα, που αποτελεί περίπου το 55% του όγκου του αίματος, περιέχει 90 με 92% νερό και
συστατικά απαραίτητα για τη διατήρηση της ζωής όπως είναι οι ηλεκτρολύτες και άλατα, ορμόνες,
σάκχαρα, λιπίδια, ρυθμιστικά πεπτίδια κ.ά. Το 6-8% του πλάσματος είναι πρωτεΐνες, μεταξύ των
οποίων περιλαμβάνονται πρωτεΐνες μεταφοράς, πρωτεΐνες του ανοσοποιητικού συστήματος,
ένζυμα, παράγοντες πήξης κ.ά. [3, 4] Από τους παράγοντες πήξης ο πιο σημαντικός είναι το
ινωδογόνο. Πρόκειται για μία γλυκοπρωτεΐνη που παράγεται στο ήπαρ και σε φυσιολογικά
δείγματα πλάσματος ανιχνεύεται σε συγκεντρώσεις 1,5 – 4,5 g/L. Κάτω από την επίδραση του
ενζύμου θρομβίνη, μαζί με αιμοπετάλια σχηματίζονται θρόμβοι. Η χρήση αντιπηκτικών ουσιών για
την αποφυγή της πήξης του αίματος όπως είναι το EDTA, αλλά και η ίδια η ύπαρξη του ινωδογόνου
μπορεί να προκαλέσει παρεμποδίσεις στις αναλύσεις και για αυτό το λόγο προτιμάται
παραδοσιακά η χρήση του ορού έναντι του πλάσματος. [5, 6]
Ο ορός είναι το διαυγές κίτρινο υγρό που λαμβάνεται από το ολικό αίμα με φυγοκέντρηση αφού
πρώτα έχει αφεθεί να πήξει το δείγμα για τον χρόνο που απαιτείται. Ο ορός περιέχει όλα τα
συστατικά και συνεπώς σχεδόν όλες τις πρωτεΐνες του πλάσματος, με εξαίρεση πρωτεΐνες που
συσχετίζονται με την διαδικασία πήξης και σχηματισμού των θρόμβων. [1]
Σε μερικές όμως συγκεκριμένες περιπτώσεις, όπως συμβαίνει σε ασθενείς με δυσινωδογοναιμία ή
επίκτητες διαταραχές πήξεως αίματος, παρατηρείται η ύπαρξη εναπομένοντος ινωδογόνου εντός
δειγμάτων ορού. Αυτό μπορεί να οδηγήσει σε εμφάνιση επιπρόσθετης ζώνης κατά την
ηλεκτροφόρηση ανάμεσα στις β και γ ζώνες και λανθασμένα να θεωρηθεί ότι πρόκειται για
παραπρωτεΐνη. [7] (βλ.κεφάλαιο 4.5)
Σχήμα 1: Σχηματική απεικόνιση προετοιμασίας πλάσματος και ορού [6]

7. 7
Αν και οι περισσότεροι παράγοντες πήξης του πλάσματος δεν περιέχονται στον ορό καθώς έχουν
αφαιρεθεί μετά την φυγοκέντρηση του θρόμβου, υπάρχουν κάποιες πρωτεΐνες πήξης που
παραμένουν. Για παράδειγμα ο παράγοντας πήξης IX, γνωστός και ως «παράγοντας Christmas» που
συσχετίζεται με την αιμοφιλία Β και oι παράγοντες πήξης Χ και ΧΙ, παραμένουν στον ορό. Σε κάθε
περίπτωση η πρωτεϊνική συγκέντρωση του ορού είναι μικρότερη από εκείνη του πλάσματος.
Σύμφωνα με μετρήσεις ο μέσος όρος της πρωτεΐνης πλάσματος με αντιπηκτικό παράγοντα ηπαρίνη
έχει βρεθεί 7.45 g/dL ενώ για τον ορό είναι 7.21 g/dL. Η διαφορά αυτή θεωρείται ότι οφείλεται
κυρίως στην απώλεια του ινωδογόνου. [8, 9]
Καθώς ο ορός, σε αντίθεση με το πλάσμα, δεν διαχωρίζεται άμεσα από τα έμμορφα συστατικά του
αίματος λόγω του χρονικού διαστήματος που απαιτείται για την πήξη του αίματος, υπάρχει
αυξημένος κίνδυνος αιμόλυσης. Ο όρος αυτός αναφέρεται στην in vivo ή in vitro διάρρηξη ερυθρών
αιμοσφαιρίων και την απελευθέρωση των ενδοκυττάριων συστατικών τους στο πλάσμα του
αίματος. Υπάρχουν πολλά πιθανά διαφορετικά αίτια καθώς η αιμόλυση μπορεί να προκληθεί από
σφάλματα κατά την λήψη του αίματος, κατά την επεξεργασία του δείγματος, κατά την μεταφορά
του και κατά την αποθήκευση. Σε κάθε περίπτωση, λόγω της αιμόλυσης εμφανίζονται
παρεμποδίσεις κατά τους βιοχημικούς προσδιορισμούς λόγω της ύπαρξης αιμοσφαιρίνης στον ορό,
όπως επίσης και αλλοιώσεις στις συγκεντρώσεις των προσδιοριζόμενων αναλυτών λόγω των
διαφορών των αρχικών συγκεντρώσεων ανάμεσα στο πλάσμα και στο εσωτερικό των ερυθρών
αιμοσφαιρίων. Για αυτό το λόγο τα αιμολυμένα δείγματα χαρακτηρίζονται συνήθως ως
ακατάλληλα για περαιτέρω ανάλυση. Έτσι, αν και η αυτοματοποίηση και η βελτίωση των
αναλυτικών τεχνικών έχει επεκταθεί σημαντικά τα τελευταία χρόνια, η ύπαρξη προαναλυτικών
σφαλμάτων είναι ακόμα σημαντική και για αυτό το λόγο η εμφάνιση αιμολυμένων δειγμάτων
παραμένει σχετικά συχνή στο εργαστήριο κλινικής χημείας. [10]
Σχήμα 2: Φυσιολογικό δείγμα ορού και αυξανόμενου βαθμού αιμολυμένα
(www.viracoribt.com/Client-Services/Preventing-Hemolysis, Οκτώβριος 2016)

8. 8
3. Οι πρωτεΐνες του πλάσματος
3.1 Λειτουργίες, χαρακτηριστικά και δομή πρωτεϊνών πλάσματος
Οι πρωτεΐνες είναι μεγάλα πολυδύναμα μακρομόρια που αποτελούνται από μία ή περισσότερες
αλυσίδες αμινοξέων ενωμένων με πεπτιδικό δεσμό. Έχουν ένα πολύ μεγάλο αριθμό λειτουργιών
για όλες σχεδόν τις βιολογικές διεργασίες και απαντώνται σε όλα τα υγρά του σώματος. Καθώς
όμως το αίμα και τα υγρά του κλάσματα είναι τα κύρια βιολογικά υγρά που χρησιμοποιούνται στα
κλινικά εργαστήρια χημείας, οι πρωτεΐνες του αίματος έχουν μεγάλη διαγνωστική σημασία.
Παράλληλα, η ανάλυση των πρωτεϊνών ενός ασθενούς, μας δίνει μία ευρεία εικόνα της παρούσας
κλινικής του κατάστασης (του φαινοτύπου του), κάτι που έρχεται σε αντίθεση με την στατική εικόνα
πιθανού ρίσκου που λαμβάνουμε από γονιδιακή ανάλυση του DNA. Προσδιορισμοί του mRNA του
πλάσματος ή ο προσδιορισμός κυττάρων ιστών στο πλάσμα όπως για παράδειγμα στην περίπτωση
του προσδιορισμού κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (circulating tumor cells, CTCs), αν και
είναι πολύτιμα διαγνωστικά εργαλεία ακόμα δεν έχουν καταφέρει να μπουν στα εργαστήρια
ρουτίνας. Τέλος, οι πληροφορίες που μπορούμε να πάρουμε από τους πολυάριθμους μικρούς
μεταβολίτες που υπάρχουν στο πλάσμα, είναι περιορισμένες καθώς συνιστούν το αποτέλεσμα των
διάφορων διεργασιών και όχι μέρος των μηχανισμών, όπως είναι πολλές πρωτεΐνες. Συνεπώς για
διαγνωστικούς σκοπούς, η ανάλυση των πρωτεϊνών του πλάσματος αποτελεί ένα πολύ χρήσιμο
εργαλείο. [11 - 13]
Ανάλογα με την δομή τους οι πρωτεΐνες μπορούν να ταξινομηθούν σε ινώδεις (όπως είναι το
ινωδογόνο) ή σφαιρικές πρωτεΐνες (όπως είναι η αλβουμίνη και τα ένζυμα). Οι περισσότερες
πρωτεΐνες πάντως που παρουσιάζουν κλινικό ενδιαφέρον είναι σφαιρικές και υδατοδιαλυτές. Οι
αναδιπλώσεις και οι σχηματισμοί των πρωτεϊνών είναι αποτέλεσμα των αλληλεπιδράσεων των R
πλευρικών ομάδων των αμινοξέων. Οι σφαιρικές πρωτεΐνες είναι συμπαγείς και δεν έχουν συνεπώς
πολύ χώρο στο εσωτερικό τους για να μπει νερό,
όπου και βρίσκονται εξάλλου και τα περισσότερα
αμινοξέα με υδροφοβική πλευρική ομάδα. Οι
πολικές πλευρικές ομάδες βρίσκονται κατά κύριο
λόγο στο εξωτερικό των σφαιρικών πρωτεϊνών
και ως εκ τούτου καθορίζουν πολλές από τις
ιδιότητες που συσχετίζονται με την
αλληλεπίδραση με το περιβάλλον τους. Αυτές
καθορίζουν την διαλυτότητα, την οξεοβασική
συμπεριφορά, αλλά και την ηλεκτροφορητική
τους κινητικότητα. Την ιδιότητα αυτή την
εκμεταλλευόμαστε σε μεθόδους όπως είναι η
ηλεκτροφόρηση και η ισοηλεκτρική εστίαση. [2]
Σχήμα 3: Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αμινοξέων και
το υδατικό περιβάλλον ευθύνονται για το σχήμα των
σφαιρικών πρωτεϊνών. (www.chem1.com, Σεπτέμβριος 2016)

9. 9
Όπως προαναφέρθηκε το 6-8% του πλάσματος αποτελείται από πρωτεΐνες. Μέχρι τις αρχές της
δεκαετίας του 90 είχαν προσδιορισθεί περίπου 60 πρωτεΐνες πλάσματος, κυρίως με την χρήση
δισδιάστατης ηλεκτροφόρησης. Σχεδόν όλες τους υπάρχουν σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες των
50mg/L. Με την έλευση όμως των πιο ευαίσθητων ανοσοχημικών μεθόδων βρέθηκαν έκτοτε
πρωτεΐνες σε συγκεντρώσεις χιλιάδες τάξεις μεγέθους μικρότερες. [14] Σήμερα, ο Αμερικανικός
Οργανισμός Ελέγχου Φαρμάκων και Τροφίμων (Food and Drug Administration, FDA) έχει
εγκεκριμένες μεθόδους προσδιορισμού για παραπάνω από 100 διαφορετικές πρωτεΐνες του
πλάσματος ή του ορού. Ταυτόχρονα, περισσότερες από 1000 πρωτεΐνες στο πλάσμα και τον ορό
έχουν μέχρι τώρα ανιχνευθεί, ένας αριθμός που αναμένεται να αυξηθεί. Το σύνολο όλων αυτών
των πρωτεϊνών ονομάζεται πρωτέωμα πλάσματος και η έρευνα γύρω από αυτό συντονίζεται από
τον Οργανισμό Ανθρώπινου Πρωτεώματος (Human Proteome Organization, HUPO). [12, 15]
Σχήμα 4: Οι κυριότερες πρωτεΐνες του πλάσματος (το 99% της συνολικής πρωτεϊνικής μάζας).
Το ινωδογόνο (fibrinogen) δεν υπάρχει στον ορό[16]
Αν και στον ορό και το πλάσμα κυκλοφορούν πολλές χιλιάδες πρωτεΐνες, γνωρίζουμε τη βιολογική
σημασία μόνο ενός μικρού ποσοστού αυτών. Οι πρωτεΐνες του πλάσματος μπορεί να έχουν
μεταφορικές λειτουργίες (όπως είναι η τρανσφερρίνη), να προσφέρουν χημική ανοσία
(ανοσοσφαιρίνες), να δρουν ως ένζυμα (όπως η ρενίνη και η θρομβίνη). Όλες οι πρωτεΐνες (αλλά
κυρίως η λευκωματίνη) διατηρούν την κολλοειδωσμωτική πίεση σταθερή. Oι περισσότερες
παράγονται στο ήπαρ με εξαίρεση τις ανοσοσφαιρίνες που παράγονται από τα λεμφοκύτταρα. Oι
πρωτεΐνες εισέρχονται στο αίμα μέσω του ηπατικού κολποειδούς και τις κεντρικές αρτηρίες του
ήπατος. [2] Πολλές πρωτεΐνες που βρίσκονται στο πλάσμα προέρχονται από την καταστροφή
κυττάρων των ιστών (όπως είναι τα ένζυμα κρεατινική φωσφοκινάση και τρανσαμινάση της
αλανίνης). [13] Αυτές οι πρωτεΐνες περνούν στην κυκλοφορία του αίματος και η ανίχνευσή τους μας
δίνει πληροφορίες για την λειτουργία των διάφορων οργάνων. Η πλειοψηφία των πρωτεϊνών του
πλάσματος είναι γλυκοπρωτεΐνες, με το σακχαρικό τους περιεχόμενο να κυμαίνεται μεταξύ του
10% και του 25%. Σημαντικές εξαιρέσεις είναι η λευκωματίνη και η C-αντιδρώσα πρωτεΐνη (C-
reactive protein, CRP), η οποία συσχετίζεται με την φλεγμονή και τα τραύματα (πρωτεΐνη οξείας
φάσης). Οι δύο αυτές πρωτεΐνες δεν περιέχουν υδατανθρακικές αλυσίδες. [16]

10. 10
Τα φυσιολογικά όρια διακύμανσης της ολικής πρωτεΐνης ορού είναι 6-8 g/dL. Από αυτές
περισσότερο από το 50% από τις πρωτεΐνες του πλάσματος και του ορού είναι λευκωματίνη (3,5-
5,0 g/dL). To 38% (2,0-2,5 g/dL) το αποτελούν οι πρωτεΐνες που ανήκουν στην οικογένεια των
σφαιρινών[17]. Στο πλάσμα το 7% των πρωτεϊνών είναι το ινωδογόνο (δεν υπάρχει στον ορό). Όλες
οι άλλες πρωτεΐνες που υπάρχουν έχουν ρυθμιστικό κυρίως ρόλο και είναι ορμόνες, πρωτεΐνες
πήξης αίματος, ένζυμα κλπ.[13]
Στον πίνακα που ακολουθεί φαίνονται μερικές από τις λειτουργίες των πρωτεϊνών του πλάσματος:
Πίνακας 1: Λειτουργίες πρωτεϊνών του πλάσματος [13]
Λειτουργία Παράδειγμα
Μεταφορά Δεσμευτική σφαιρίνη της θυροξίνης
(θυρεοειδείς ορμόνες)
Απολιποπρωτεΐνες (χοληστερόλη, τριγλυκερίδια)
Τρανσφερρίνη (σίδηρος)
Χυμική ανοσία Ανοσοσφαιρίνες
Διατήρηση της κολλοειδωσμωτικής πίεσης Όλες οι πρωτεΐνες (κυρίως η λευκωματίνη)
Ένζυμα Ρενίνη
Πρωτεΐνες συμπληρώματος
Πήξη του αίματος Ινωδογόνο
Παράγοντες πήξης
Αναστολείς πρωτεασών α1-αντιθρυψίνη (δρα στις πρωτεάσες)
Ρύθμιση της οξεοβασικής ισορροπίας Όλες οι πρωτεΐνες
Η μέτρηση της ολικής πρωτεΐνης ορού, αποτελεί μία εξέταση ρουτίνας που πραγματοποιείται στο
βιοχημικό εργαστήριο. Συνηθίζεται να παρουσιάζονται οι ευρεθείσες τιμές ολικής πρωτεΐνης,
λευκωματίνης, όπως επίσης και ο λόγος λευκωματίνης/σφαιρινών. Η τιμή των σφαιρινών δεν
προκύπτει από βιοχημικό προσδιορισμό αλλά πρόκειται απλώς για την διαφορά ολικής πρωτεΐνης
και λευκωματίνης.
Καθώς διάφορες ασθένειες επηρεάζουν τις σχετικές τιμές λευκωματίνης και σφαιρινών, ο λόγος
λευκωματίνης/σφαιρινών μπορεί να μας δώσει ορισμένες ενδείξεις ως προς το ποια είναι η αιτία
της αλλαγής της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών. Πρέπει να σημειωθεί πάντως ότι από μόνες τους
αυτές οι μετρήσεις δεν είναι αρκετές, και για να γίνει διάγνωση από τον ιατρό απαιτείται να
συνοδεύονται σε πρώτο στάδιο από περαιτέρω εξετάσεις όπως είναι αυτές που περιλαμβάνονται
στο Βασικό Μεταβολικό Προφίλ (μία σειρά από 14 βιοχημικούς προσδιορισμούς που μεταξύ άλλων
περιλαμβάνουν την μέτρηση σακχάρου, ηπατικών ενζύμων, ασβεστίου κ.ά.). Ένα πιθανό μη
φυσιολογικό αποτέλεσμα, ανάλογα με την περίπτωση, μπορεί να καταστήσει απαραίτητη την
διενέργεια ακόμα πιο εξειδικευμένων εξετάσεων.
Οι μεταβολές των συγκεντρώσεων των πρωτεϊνών μπορεί να οφείλονται σε διάφορες ασθένειες.
Γενικώς, όταν σε ένα δείγμα ορού έχουμε αύξηση της συγκέντρωσης της ολικής πρωτεΐνης, αυτό
συνήθως συσχετίζεται με μία αύξηση της συγκέντρωσης των σφαιρινών (παραπρωτεΐν–η), ενώ μία
ελάττωση της συγκέντρωσης της ολικής πρωτεΐνης οφείλεται συνήθως σε ελάττωση της
λευκωματίνης.[18, 19]

11. 11
Καθώς η σύνθεση των πρωτεϊνών είναι άμεσα συνυφασμένη με τη διατροφή, οι συγκεντρώσεις
τους μπορεί να μεταβληθούν ανάλογα. Η λευκωματίνη για παράδειγμα, με μέσο ημερήσιο
συνθετικό ρυθμό τα 10 g πρωτεΐνης ημερησίως, έχει χρόνο ημιζωής 19 ημέρες, και επηρεάζεται
συνεπώς άμεσα από τη διατροφή. [16]
Η αφυδάτωση προκαλεί επίσης αύξηση της συγκέντρωσης (αφού μειώνεται το ποσοστό του νερού
στο πλάσμα). Το αντίθετο συμβαίνει με την υπερυδάτωση.
Παράγοντες που συσχετίζονται με συνθήκες της αιμοληψίας μπορούν επίσης να επιδράσουν στη
συγκέντρωση των πρωτεϊνών. Για παράδειγμα η ορθοστασία για 30 min μπορεί να προκαλέσει
αύξηση της συγκέντρωσης κατά 10-20%. Σε κάθε περίπτωση, είναι προφανές ότι τέτοιου είδους
μεταβολές είναι περισσότερο έντονες στις πρωτεΐνες που βρίσκονται σε αφθονία στο πλάσμα
(παραδείγματος χάριν λευκωματίνη). Στον πίνακα που ακολουθεί παρουσιάζονται οι διάφορες
πιθανές αιτίες μεταβολής της ολικής συγκέντρωσης των πρωτεϊνών:
Πίνακας 2:Αιτίες μεταβολής της ολικής συγκέντρωσης πρωτεϊνών πλάσματος[13]
Αύξηση Μείωση
Αύξηση
πρωτεϊνοσύνθεσης
Υπεργαμμασφαιριναιμία
Παραπρωτεϊναιμία
Μείωση
πρωτεϊνοσύνθεσης
Υποσιτισμός και
δυσαπορρόφηση
Ηπατοπάθεια
Χυμική Ανοσοανεπάρκεια
Αποσυμπύκνωση
λόγω διακοπής
ροής του αίματος
κατά τη διάρκεια
της αιμοληψίας
Τεχνητή Αύξηση του όγκου
κατανομής
Υπερυδάτωση
Αυξημένη διαπερατότητα
τριχοειδών
Μείωση όγκου
κατανομής
Αφυδάτωση Αύξηση απέκκρισης ή
καταβολισμού
Καταστάσεις απώλειας
πρωτεΐνης
Καταβολικές καταστάσεις

12. 12
3.2 Μερικές από τις κυριότερες πρωτεΐνες
Όπως προαναφέρθηκε περισσότερη από τη μισή μάζα των πρωτεϊνών πλάσματος οφείλεται στην
λευκωματίνη και ακολουθεί η οικογένεια των σφαιρινών. Σε αυτές συμπεριλαμβάνονται
μεταφορικές πρωτεΐνες, λιποπρωτεΐνες, ανοσοσφαιρίνες κ.ά. Οι σφαιρίνες χωρίζονται σε α1-
σφαιρίνες, α2-σφαιρίνες, β-σφαιρίνες και γ-σφαιρίνες (οι ανοσοσφαιρίνες). Ο διαχωρισμός των
σφαιρινών σε αυτές τις επί μέρους κατηγορίες δεν έχει να κάνει με την λειτουργία τους αλλά με το
πώς διαχωρίζονται κατά την ηλεκτροφόρηση. Στην συνέχεια θα αναλυθούν ορισμένες από τις πιο
σημαντικές πρωτεΐνες που βρίσκονται σε κάθε ζώνη της ηλεκτροφόρησης.
Σχήμα 5: Οι ζώνες διαχωρισμού σε ηλεκτροφόρημα πρωτεϊνών ορού [18]

13. 13
Στον πίνακα που ακολουθεί παρουσιάζονται συνοπτικά μερικές από τις πιο σημαντικές πρωτεΐνες
που υπάρχουν στον ορό, με την σειρά που εμφανίζονται κατά την ηλεκτροφόρηση
(ηλεκτροφορητική κινητικότητα) μαζί με μερικές βιοχημικές πληροφορίες, καθώς και τη λειτουργία
τους. Όπου pI, το ισοηλεκτρικό σημείο σε ηλεκτροφόρηση ορού σε πηκτή αγαρόζης με pH 8.6:
Πίνακας 3: Μερικές από τις κυριότερες πρωτεΐνες του ορού [2, 11, 13]
3.2.1 Τρανσθυρετίνη (προαλβουμίνη)
Η τρανσθυρετίνη (transthyretin , TTR) εμφανίζεται κατά την ηλεκτροφόρηση πιο ανοδικά από
τηζώνη της αλβουμίνης, και γι’ αυτό το λόγο παλιότερα ονομαζόταν προαλβουμίνη. Πρόκειται για
μία τετραμερή μη γλυκοζυλιωμένη πρωτεΐνη που παράγεται στο ήπαρ, και έχει μάζα περίπου 55
kDa. Είναι μία μεταφορική πρωτεΐνη που μεταφέρει θυροξίνη (T4), τριιωδοθυρονίνη (T3) και έμμεσα
συμμετέχει στην μεταφορά ρετινόλης (βιταμίνη Α).
Μεταφέρει κατά προσέγγιση το 10% των δύο θυρεοειδικών ορμονών. Η δεσμευτική σφαιρίνη της
θυροξίνης (thyroxine-binding globulin , TBG) προσδένεται πολύ πιο ισχυρά στην Τ3 και Τ4 ορμόνες
από την τρανσθυρετίνη, αλλά βρίσκεται σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις στον ορό. Η συμμετοχή της
στην μεταφορά της ρετινόλης γίνεται μέσω της σύμπλεξης της τρασθυρετίνης με την δεσμευτική
πρωτεΐνη της ρετινόλης (retinol-binding protein, RBG). Στο αίμα η ρετινόλη προσδένεται στην RBG
η οποία με την σειρά της μεταφέρεται από την τρανσθυρετίνη. Το σύμπλοκο αυτό θεωρείται ότι
αλληλεπιδρά με συγκεκριμένους κυτταρικούς υποδοχείς για την εισαγωγή ρετινόλης στα κύτταρα
στα οποία αυτό απαιτείται. [2, 20]
Ηλεκτροφο-
ρητική
περιοχή
Πρωτεΐνη Λειτουργία
Μάζα
(kDa)
Χρόνος
ημι-ζωής
(μέρες)
pI Εύρος τιμών
αναφοράς
ορού (g/L)
Τρανσθυρετίνη γνωστή
και ως προλευκωματίνη
Μεταφορά ορμονών
θυρεοειδούς, ρετινόλης
54,98 1,5 4,7 0,5-1,2
λευκωματίνη Λευκωματίνη Μεταφορική, διατήρηση
ωσμωτική πίεσης
66,3 15-19 4-5,8 35-52
α1 σφαιρίνες α1-αντιθρυψίνη Αναστολέας πρωτεάσης 51 4 4,8 0,9-2
α1-όξινη γλυκοπρωτεΐνη ασαφής 40 5 2,7-4
α2-σφαιρίνες
Απτοσφαιρίνη Προσδένεται στην
αιμοσφαιρίνη
85 2 4,1 0,3-2
α2-μακροσφαιρίνη Αναστολέας πρωτεολυτικών
ενζύμων
720 5 5,4 1,3-3
Σερουλοπλασμίνη Μεταφέρει Cu, Οξειδώνει Fe 132 4,5 4,4 0,2-0,6
β1-σφαιρίνες Τρανσφερρίνη Μεταφέρει σίδηρο 79,6 7 5,7 2-3,6
Συστατικά συμπληρώματος C4 Παράγοντας συμπληρώματος 206 0,1-0,4
β2-σφαιρίνες Συστατικά συμπληρώματος C3 » 180 0,9-1,8
β2-μικροσφαιρίνη Μόρια MHC 11,8 <2 mg/L
C-αντιδρώσα πρωτεΐνη Ανταπόκριση σε φλεγμονή περ. 115 1,3 6,2 7.5 mg/L
γ-σφαιρίνες ΙgG Αντισώματα 144 – 150 24 6-7,3 7-16
IgA » περ. 160 6 0,7-4
IgM » 950 5 0,4-2,3
IgE » 175 περ. 0,1
IgD » 200 Ίχνη

14. 14
3.2.2 Λευκωματίνη
Η λευκωματίνη ή αλλιώς αλβουμίνη
(albumin, ALB) είναι μία σφαιρική πρωτεΐνη
μεγέθους 66,3 kDa. Πρόκειται για την
πρωτεΐνη που βρίσκεται σε μεγαλύτερη
αφθονία στο πλάσμα καθώς αποτελεί το 55%
του συνόλου της μάζας των πρωτεϊνών του.
Λόγω του μικρού της μεγέθους και της
υψηλής της συγκέντρωσης στο πλάσμα, η
λευκωματίνη είναι το κύριο πρωτεϊνικό
συστατικό των εξωαγγειακών υγρών
(εγκεφαλονωτιαίο υγρό, μεσοκυττάριο υγρό,
ούρα, αμνιακό υγρό). Περίπου το 60% της
λευκωματίνης του ανθρώπινου οργανισμού,
βρίσκεται στον εξωαγγειακό χώρο. [2] Η
αφθονία της λευκωματίνης στο αίμα, όπως
επίσης και η ευκολία της να απομονωθεί
συντέλεσαν στο να είναι μία από τις πρώτες
πρωτεΐνες που μελετήθηκε από τους
επιστήμονες. [21]
Όπως προαναφέρθηκε, σε αντίθεση με τις περισσότερες πρωτεΐνες του πλάσματος, δεν πρόκειται
για μία γλυκοπρωτεΐνη. Παρ’ όλα αυτά, είναι ευδιάλυτη στο νερό, κυρίως λόγω του υψηλού
αρνητικού της φορτίου σε ουδέτερο pH. Αποτελείται από τρεις ομόλογους τομείς (Ι-ΙΙΙ) που
σχηματίζουν ένα μακρομόριο σε σχήμα καρδιάς. Ο κάθε τομέας χωρίζεται στους υποτομείς Α και Β.
Παρά την εσωτερική της συμμετρία, ο κάθε τομέας έχει διαφορετική ισχύ πρόσδεσης στα λιπαρά
οξέα, τη θυροξίνη και τα φάρμακα. [22]
Η κύρια λειτουργία της είναι η διατήρηση της κολλοειδοσμωτικής πίεσης του αίματος. Πρόκειται
για την ωσμωτική πίεση που οφείλεται στην παρουσία πρωτεϊνών. Ρυθμίζει την κατανομή του
εξωκυττάριου υγρού ανάμεσα στον εξωαγγειακό και τον ενδοαγγειακό χώρο. Παράλληλα, δεσμεύει
και μεταφέρει μικρά υδρόφοβα μόρια αρκετά διαφορετικά μεταξύ τους: νερό, κατιόντα όπως είναι
το Ca2+
, το Na+
και το K+
, λιπαρά οξέα, φωσφολιπίδια, ορμόνες, αμινοξέα, φάρμακα, η μη
συζευγμένη χολερυθρίνη, θυροξίνη.[2, 13]
Η αύξηση της λευκωματίνης στον ορό (υπερλευκωματιναιμία) οφείλεται κατά κύριο λόγο σε
σφάλματα κατά την αιμοληψία, στην αφυδάτωση ή στην υπερβολική χορήγηση λευκωματίνης. Έχει
γενικώς μικρή διαγνωστική σημασία.
Αντίθετα, η μείωση της λευκωματίνης (υπολευκωματιναιμία) μπορεί να είναι ένδειξη αρκετών
παθολογικών καταστάσεων. Μείωση της συγκέντρωσης μπορεί να παρατηρηθεί σε περίπτωση
αραίωσης ως αποτέλεσμα της υπερενυδάτωσης. Επιπροσθέτως, κατά την φλεγμονή λόγω της
αύξησης της διαπερατότητας των αγγείων μπορεί να υπάρξει απώλεια αλβουμίνης. Απώλειες
λευκωματίνης μπορούν να υπάρξουν επίσης σε περιπτώσεις ανώμαλης απέκκρισης όπως είναι το
νεφρωσικό σύνδρομο (κατά το οποίο η λευκωματίνη χάνεται μέσω των ούρων λόγω βλάβης των
νεφρών) ή οι εντεροπάθειες με απώλεια πρωτεΐνης. Καταβολικές καταστάσεις όπως είναι η βαριά
σήψη, ο πυρετός και τα τραύματα μπορούν να οδηγήσουν σε ελάττωση της συγκέντρωσης της
λευκωματίνης. Ακόμα, κατά την διάρκεια αντίδρασης οξείας φάσης (διαδικασία που ακολουθεί την
φλεγμονή, την λοίμωξη, το τραύμα κλπ) η συγκέντρωσή της ελαττώνεται. Τέλος, μπορεί να
Σχήμα 6: Απεικόνιση μορίου λευκωματίνης καθώς
μεταφέρει δύο λιπαρά οξέα.
(https://pdb101.rcsb.org/motm/37, Οκτώβριος 2016)

15. 15
οφείλεται σε υποσιτισμό ή σε παθήσεις του ήπατος (αφού η αλβουμίνη συντίθεται στο ήπαρ).
Καθώς όμως ο χρόνος ημιζωής της λευκωματίνης είναι δύο εβδομάδες, δεν αποτελεί καλό
διαγνωστικό δείκτη για περιπτώσεις οξείας ηπατίτιδας και μόνο στις περιπτώσεις χρόνιας ηπατικής
ασθένειας η λευκωματίνη βρίσκεται σε χαμηλές συγκεντρώσεις. [13, 18] Συνηθίζεται, να
χρησιμοποιούνται οι τιμές τις λευκωματίνης ορού για παρακολούθηση ασθενών σε μακροχόνια
διατροφική υποστήριξη, οι τιμές αυτές όμως αν και μπορεί να είναι ενδεικτικές, δεν είναι ούτε
αρκετά αξιόπιστες ούτε αρκετά ευαίσθητες για αυτό το σκοπό. [18]
Η απώλεια πρωτεΐνης από το αίμα έχει σαν αποτέλεσμα την διατάραξη της κολλοειδωσμωτικής
πίεσης. Ως εκ τούτου ευνοείται η μετακίνηση νερού από το εσωτερικό των αιμοφόρων αγγείων
προς τον εξωαγγειακό χώρο. Έτσι, προκαλείται η συσσώρευση μεσοκυττάριου υγρού και η
συνεπακόλουθη εμφάνιση οιδήματος. Με τον ίδιο τρόπο μπορεί να υπάρξει εμφάνιση ασκίτη,
συσσώρευση υγρού στην περιτοναϊκή κοιλότητα.[2, 13]
Σχήμα 7: Παθογένεση οιδήματος στην υπολευκωματιναιμία [18]

16. 16
3.2.3α1-σφαιρίνες
3.2.3.1 a1-αντιθρυψίνη
H α1-αντιθρυψίνη (α1-antitrypsin , AAT) είναι μία σερπίνη. Οι πρωτεΐνες αυτής της οικογένειας
είναι αναστολείς ενζύμων σερινοπρωτεάσης, πρωτεολυτικών ενζύμων δηλαδή που στο ενεργό τους
κέντρο έχουν μία σερίνη η οποία λειτουργεί ως πυρηνόφιλο. Η σύνθεσή της α1-αντιθρυψίνης αλλά
και ο καταβολισμός της λαμβάνουν χώρα στα παρεγχυματικά κύτταρα του ήπατος. Αποτελεί τον
κυριότερο αναστολέα της ελαστάσης, ένα ένζυμο που εκκρίνουν τα πολυμορφοπύρηνα
λευκοκύτταρα κατά την φαγοκυττάρωση και στοχεύει την ελαστίνη, μία πρωτεΐνη των συνδετικών
ιστών. Η ελαστάση των λευκοκυττάρων επίσης αντιδρά με την ελαστίνη του τραχειοβρογχικού
δένδρου και του αγγειακού επιθηλίου. Καθώς η α1-αντιθρυψίνη είναι μικρή σε μέγεθος, διαχέεται
εύκολα στους ιστούς. Σε περίπτωση που υπάρχει έλλειψη α1-αντιθρυψίνης, η ελεύθερη
κυκλοφορία της ελαστάσης στο τραχειοβροχικό δένδρο έχει ως αποτέλεσμα την διάρρηξη των
ελαστικών ινών και την δημιουργία εμφυσήματος. Προβλήματα μπορούν να εμφανιστούν και στο
ήπαρ, καθώς η συσσώρευση μη φυσιολογικής πρωτεΐνης στο ήπαρ η οποία δεν μπορεί να εκκριθεί
από αυτό μπορεί να οδηγήσει στην σταδιακή καταστροφή.
Υπάρχουν 75 γνωστέςπαραλλαγές α1-αντιθρυψίνης που οφείλονται σε γενετικές μεταλλάξεις,
αρκετές από τις οποίες συσχετίζονται με χαμηλές συγκεντρώσεις στον ορό.Η φυσιολογική πρωτεΐνη
ονομάζεται PiMM (Pi για proteaseinhibitor). Οι φαινότυποι PiZZ και PiSZ έχουν την πιο μεγάλη
κλινική σημασία. Οι ομοζυγώτες του αλληλόμορφου Ζ (PiZZ) διατρέχουν τον περισσότερο κίνδυνο,
καθώς η ασθένεια εμφανίζεται πιο νωρίς απ’ ό,τι συμβαίνει σε άλλες μορφές πρωτεΐνης (ανάμεσα
στην δεύτερη και τέταρτη δεκαετία της ζωής των περισσότερων Pi ZZ ατόμων). Αν και η εμφάνιση
εμφυσήματος δεν είναι σίγουρη για τα PiZZ άτομα, η πιθανότητα αυξάνεται σημαντικά από
παράγοντες όπως είναι το κάπνισμα και η ατμοσφαιρική ρύπανση. [2, 13, 23]
Σχήμα 8: Η έλλειψη α1-αντιθρυψίνης. (http://learn.genetics.utah.edu, Νοέμβριος 2016)

17. 17
3.2.3.2 a1-όξινη γλυκοπρωτεΐνη
H α1-όξινη γλυκοπρωτεΐνη (α-1-acid glycoprotein , AAG) είναι μία γλυκοπρωτεΐνη μοριακού βάρους
40 kDa υψηλής περιεκτικότητας σε ολιγοσακχαρίτες (45%) οι οποίοι μάλιστα έχουν μεγάλο αριθμό
καταλοίπων σιαλικού οξέος. Γι’ αυτό το λόγο ηα1-όξινη γλυκοπρωτεΐνη έχει μεγάλο αρνητικό
φορτίο και είναι ιδιαίτερα ευδιάλυτη στο νερό. Είναι η κύρια πρωτεΐνη του κλάσματος του
γλυκοπρωτεϊνών του πλάσματος που καταβυθίζονται από HClO4 και άλλα ισχυρά οξέα
(seromucoid). Δεν είναι γνωστός ο βιολογικός της ρόλος στον οργανισμό, παρ’ όλα αυτά το γεγονός
ότι μπορεί και μεταφέρει λιπόφιλες ορμόνες κυρίως θετικά φορτισμένες (όπως είναι η
προγεστερόνη) είναι ιδιαίτερα χρήσιμο για την φαρμακοχημεία. Σε αυτήν μπορούν και
προσδένονται φάρμακα όπως είναι η προπανολόλη, και ενδογενή στεροειδή (κορτιζόλη), αλλά και
συνθετικά στεροειδή.Hικανότητά της να μεταφέρει στεροειδή φάρμακα έχει αποδειχθεί ήδη από
την δεκαετία του 60. Αποτελεί πρωτεΐνη οξείας φάσης, πράγμα που σημαίνει ότι η συγκέντρωσή
της αυξάνεται έπειτα από τραύμα, φλεγμονή ή λοίμωξη. [2, 24, 25]
3.2.4 α2-σφαιρίνες
3.2.4.1 Aπτοσφαιρίνη
Η απτοσφαιρίνη (haptoglobin, Hp) είναι μία γλυκοπρωτεΐνη μάζας 85 kDa που δεσμεύει ελεύθερη
αιμοσφαιρίνη με μη αναστρέψιμο τρόπο. Συντίθεται στο ήπαρ και αποτελείται από 4 πεπτιδικές
αλυσίδες (δύο α υπομονάδες και δύο β) που ενώνονται με δισουλφιδικούς δεσμούς. Υπάρχουν
διάφορες γενετικές παραλλαγές τόσο για την α όσο και την β υπομονάδα, όμως κατά κύριο λόγο
εμφανίζονται πολυμορφισμοί της α αλυσίδας.
Κατά την διάρκεια ενδοαγγειακής αιμόλυσης, παρουσιάζεται απελευθέρωση αιμοσφαιρίνης σε
μορφή διμερών. Τα διμερή αυτά, δεσμεύονται από την απτοσφαιρίνη. Άμεσα, τα σύμπλοκα
απτοσφαιρίνης-αιμοσφαιρίνης απομακρύνονται. Ειδικά μακροφάγα κύτταρα που βρίσκονται στο
ήπαρ (κύτταρα Kupffer), διασπούν το σύμπλοκο, και έπειτα τα αμινοξέα και ο σίδηρος μπορούν να
ξαναχρησιμοποιηθούν. Με αυτό τον τρόπο αποφεύγονται οι απώλειες αιμοσφαιρίνης και του
σιδήρου της μέσω των νεφρών. Η παρατεταμένη αιμόλυση θα έχει ως αποτέλεσμα να μειωθεί η
συγκέντρωση της απτοσφαιρίνης στον ορό.
Τα διμερή απτοσφαιρίνης-αιμοσφαιρίνης είναι σημαντικά και για τον έλεγχο της φλεγμονής, και
καθώς πρόκειται για πρωτεΐνη οξείας φάσης, η συγκέντρωσή της αυξάνεται κατά την φλεγμονή.
[2, 13]

18. 18
Σχήμα 9:Δομή του συμπλόκου απτοσφαιρίνης-αιμοσφαιρίνης θηλαστικού. Η απτοσφαιρίνη είναι με μπλε χρώμα, οι
υπομονάδες της αιμοσφαιρίνης με πορτοκαλί. Η αίμη φαίνεται με σκούρο γκρι χρώμα, ενώ οι κόκκινες σφαίρες
αντιπροσωπεύουν τον σίδηρο. Οι γλυκοζυλιώσεις φαίνονται με ανοιχτό γκρι χρώμα, ενώ οι δισουλφιδικές γέφυρες
φαίνονται με κίτρινο.[26]
3.2.4.2 α2-μακροσφαιρίνη
Το 1/3 της συνολικής συγκέντρωσης των α2-σφαιρινών οφείλεται στην α2-μακροσφαιρίνη (α2-
macroglobulin, AMG). Όπως φαίνεται και από το όνομά της πρόκειται για μία πρωτεΐνη μεγάλου
μοριακού βάρους (720 kDa) και είναι μάλιστα η μεγαλύτερη πρωτεΐνη πλάσματος πέρα από τις
ανοσοσφαιρίνες. Είναι ένας αναστολέας πρωτεασών ευρέος φάσματος, και λόγω του μεγέθους της,
σε αντίθεση με την α1-αντιθρυψίνη δεν μπορεί να διαχυθεί από το πλάσμα στον εξωαγγειακό χώρο
σε μεγάλες ποσότητες. Στο νεφρωσικό σύνδρομο είναι αυξημένη η συγκέντρωσή της, και λόγω του
μεγέθους της δεν μπορεί να αποβληθεί με τα ούρα όπως συμβαίνει στις μικρότερες πρωτεΐνες.
Κατά την ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών ορού η α2 ζώνη οφείλεται κατά κύριο λόγο στην α2-
μακροσφαιρίνη και την απτοσφαιρίνη. Στην περίπτωση in vivo αιμόλυσης και στα νεογνά, η α2-
μακροσφαιρίνη αποτελεί την κύρια πρωτεΐνη της ζώνης.[2, 13]
3.2.4.3 Σερουλοπλασμίνη
H σερουλοπλασμίνη (ceruloplasmin, Cp) είναι μία α2-σφαιρίνη που παράγεται στο ήπαρ και
περιέχει περίπου το 95% των ιόντων χαλκού Cu2+
που υπάρχουν στον ορό. Σε κάθε μόριο υπάρχουν
6 περίπου άτομα χαλκού. Συντίθεται κυρίως στα παρεγχυματικά κύτταρα του ήπατος. Ο κύριος
ρόλος της είναι η εκτέλεση οξειδωναγωγικών αντιδράσεων στο πλάσμα. Συμμετέχει άμεσα στον
μεταβολισμό του σιδήρου, καθώς μπορεί και οξειδώνει τα ιόντα Fe2+
σε Fe3+
, αυτό είναι απαραίτητο
για την εισαγωγή του σιδήρου στην τρανσφερρίνη.
Αν και πρόκειται για μία πρωτεΐνη οξείας φάσης, η συγκέντρωσή της αυξάνεται σχετικά αργά κατά
την φλεγμονή. Είναι αυξημένη κατά την εγκυμοσύνη. Στα άτομα με τη νόσο του Wilson, τα ιόντα
Cu2+
δεν μπορούν να ενσωματωθούν στα μόρια σερουλοπλασμίνης, και ως εκ τούτου έχουμε
εναπόθεση χαλκού στους ιστούς. Τα συμπτώματα εμφανίζονται στην δεύτερη με τρίτη ηλικία της
ζωής. [2]

19. 19
3.2.5 β-σφαιρίνες
3.2.5.1 Τρανσφερρίνη
Πρόκειται για την κύρια πρωτεΐνη μεταφοράς τους σιδήρου στο πλάσμα. Η τρανσφερρίνη
(transferrin , TRF) είναι μία γλυκοπρωτεΐνη που παράγεται στο ήπαρ, έχει μοριακό βάρος 79,6 kDa
και είναι μία β-σφαιρίνη. Το μόριό της αποτελείται από δύο λοβούς. Σε κάθε λοβό υπάρχει μία
θέση πρόσδεσης σιδήρου και τα ιόντα που μεταφέρει πρέπει να είναι στην οξειδωμένη μορφή
(Fe3+
). Μετά την σύνδεση της τρανσφερρίνης με τον υποδοχέα τρανσφερρίνης των κυττάρων, το
σύμπλοκο που δημιουργείται εγκολπώνεται και έχουμε σχηματισμό ενός ενδοσώματος. Ο σίδηρος
απελευθερώνεται εντός του κυττάρου και ανάγεται σε ιόντα Fe2+
. Όταν στην πρωτεΐνη δεν
υπάρχουν προσδεμένα ιόντα σιδήρου Fe3+
, ονομάζουμε την πρωτεΐνη αποτρανσφερρίνη. Στο
εσωτερικό των κυττάρων τα ιόντα Fe2+
οξειδώνονται ξανά σε Fe3+
κατά την αποθήκευσή τους εντός
ενός πρωτεϊνικού συμπλέγματος που ονομάζεται φερριτίνη (μία κενή σφαίρα που ο φλοιός της
αποτελείται από 24 πανομοιότυπες πρωτεϊνικές υπομονάδες).
Οι συγκεντρώσεις της εξαρτώνται κυρίως από την διαθεσιμότητα σιδήρου και ο προσδιορισμός της
είναι χρήσιμος για τον έλεγχο της ανταπόκρισης ασθενών σε τροφική υποστήριξη. Κατά την
αντίδραση οξείας φάσης, η συγκέντρωσή της μειώνεται. [2, 13, 27]
Σχήμα 10: Στο διάγραμμα αυτό φαίνονται οι συνδυαστικές λειτουργίες των πρωτεϊνών σερουλοπλασμίνη (Cp) και
Τρανσφερρίνη (Tf) κατά την μεταφορά ιόντων σιδήρου στο πλάσμα. [28]
3.2.5.2 Πρωτεΐνες συμπληρώματος
Οι πρωτεΐνες του συστήματος συμπληρώματος αποτελούν μία μεγάλη οικογένεια πρωτεϊνών και
αποτελούν μέρος του ανοσοποιητικού συστήματος. Το συγκροτούν τουλάχιστον 20 διαφορετικές
πρωτεΐνες του πλάσματος και των υγρών των ιστών. Ουσιαστικά αποτελούν το σύστημα το οποίο
ενισχύει την δράση των ανοσοσφαιρινών και των φαγοκυττάρων και λύει τις μεμβράνες των
παθογόνων μικροοργανισμών. H τρίτη πρωτεΐνη συμπληρώματος (C3) αποτελεί την κύρια
πρωτεΐνη που εμφανίζεται στην β2 ζώνη κατά την ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών ορού. Είναι μία
πρωτεΐνη μάζας 180 kDa και περιέχει 13 διαφορετικούς τομείς. Καθώς είναι πρωτεΐνη οξείας
φάσης, αυξάνεται κατά τη φλεγμονή και την λοίμωξη. [2, 29]

20. 20
3.2.6 Ανοσοσφαιρίνες
Οι ανοσοσφαιρίνες (immunoglobulins, Ig) ή αντισώματα (antibodies, Ab) είναι πρωτεΐνες των
ανοσοποιητικού συστήματος. Χρησιμεύουν στην αναγνώριση και εξουδετέρωση παθογόνων
μικροοργανισμών. Σε αντίθεση με τις υπόλοιπες πρωτεΐνες του ορού, οι ανοσοσφαιρίνες δεν
συντίθενται στο ήπαρ αλλά παράγονται από τα πλασματοκύτταρα του μυελού των οστών. Τα
κύτταρα αυτά είναι διαφοροποιημένα Β λεμφο-κύτταρα ως αποτέλεσμα της επαφής των Β
λεμφοκυττάρων με κάποιο συγκεκριμένο αντιγόνο.
Όλες οι ανοσοσφαιρίνες αποτελούνται από μία ή περισσότερες μονάδες σχήματος Υ, όπου η κάθε
μία αποτελείται από δύο ίδιες «βαριές» αλυσίδες και δύο ίδιες «ελαφριές» (Η και Lαντίστοιχα).
Κάθε ανοσοσφαιρίνη έχει μία σταθερή και μία μεταβλητή περιοχή. Η αναγνώριση και η πρόσδεση
του αντιγόνου γίνεται από την μεταβλητή περιοχή. Από την επεξεργασία ανέπαφων
ανοσοσφαιριών με την παπαΐνη (μία πρωτεάση) προκύπτουν τρία θραύσματα μοριακού βάρους 50
kDa δύο θραύσματα δέσμευσης αντιγόνου Fab και ένα θραύσμα που μπορεί να κρυσταλλωθεί (Fc),
τα ονόματα αυτών των θραυσμάτων έχουν δώσει τα ονόματα και στις αντίστοιχες περιοχές. [11]
Σχήμα 11: H δομή των ανοσοσφαιρινών [18]
Υπάρχουν δύο διαφορετικοί τύποι ελαφράς αλυσίδας (λ και κ) και 5 διαφορετικοί τύποι βαριάς
αλυσίδας (γ, α, μ, δ, και ε). Ο τύπος της βαριάς αλυσίδας καθορίζει την τάξη στην οποία ανήκει η
ανοσοσφαιρίνη. Έτσι, υπάρχουν οι τάξεις IgG, IgA, IgM, IgD και IgE αντίστοιχα. Η IgA είναι ένα
διμερές ενώ η ΙgM είναι ένα πενταμερές και περιέχουν αλυσίδες J που συνδέουν τα μόρια
ανοσοσφαιρίνης από τα οποία αποτελούνται.[11]
Η IgG, η IgA και η IgM αποτελούν τις κύριες ανοσοσφαιρίνες που βρίσκονται στο πλάσμα, καθώς οι
ανοσοσφαιρίνες αυτών των τάξεων αποτελούν περισσότερο από το 85% του συνόλου που
ανιχνεύεται. Κατά κύριο λόγο βρίσκονται στην ζώνη των γ-σφαιρινών κατά την ηλεκτροφόρηση, αν
και η IgA και IgM μπορεί να μετακινηθούν ανοδικότερα προς την ζώνη των β ή και α2-σφαιρινών. Σε
κάθε περίπτωση πάντως, η ζώνη των γ-σφαιρινών οφείλεται κυρίως στην τάξη των ΙgG. [13]

21. 21
Σχήμα 12: Οι τάξεις των ανοσοσφαιρινών (https://www.britannica.com/science/antibody, Οκτώβριος 2016)
Πίνακας 4: Τα χαρακτηριστικά των τάξεων των ανοσοσφαιρινών [2, 11, 13, 18]
Τάξη Σύσταση
αλυσίδων
Μάζα
(kDa)
%περιεκτικότητα
υδατάνθρακα
Εύρος τιμών
αναφοράς
ορού (mg/mL)
Λειτουργία
ΙgG κ2γ2 ή λ2γ2 150 3% 7-16 Εξουδετερώνει τοξίνες,
ενεργοποιεί συμπλήρωμα
IgA (κ2α2)2 ή (κ2α2)2 180-150 10% 0,7-4 Σε εξωτερικές εκκρίσεις
(σίελος, δάκρυα, εντερική
βλέννα)
IgM (κ2μ2)5 ή (λ2μ2)5 950 10% 0,4-2,3 Κύριο αντίσωμα που
παράγεται κατά την
απάντηση του
ανοσοποιητικού
IgD κ2δ2 ή λ2δ2 175 12% περ. 0,1 Στην επιφάνεια κυττάρων,
αναγνώριση αντιγόνου
IgE κ2ε2 ή λ2ε2 200 15% Ίχνη Προστασία από παράσιτα,
προκαλεί αλλεργίες
Η ελάττωση της συγκέντρωσης των γ-σφαιρινών του ορού ονομάζεται υπογαμμασφαιριναιμία. Όλα
τα νεογέννητα μωρά γεννιούνται χωρίς τις δικές τους ανοσοσφαιρίνες. Καθώς όμως η IgG
ανοσοσφαιρίνες μπορούν και περνούν μέσω του πλακούντα προς το έμβρυο, η συγκέντρωση των
IgG στον ορό του νεογνού είναι τελικώς ίση ή και μεγαλύτερη από αυτή των ενηλίκων, και είναι
μητρικής προέλευσης. Μετά την τρίτη με τέταρτη εβδομάδα της ζωής, αρχίζει η σύνθεσή τους στον
οργανισμό. Αντίθετα οι IgM και κυρίως οι IgA ανοσοσφαιρίνες (που δεν διαπερνούν τον πλακούντα)
είναι σε πολύ χαμηλή συγκέντρωση στο αίμα του νεογνού. Εντός των πρώτων χρόνων της ζωής τους
όμως, οι συγκεντρώσεις αυτές σταδιακά φτάνουν τις φυσιολογικές τιμές. [30]

22. 22
Σχήμα 13: Οι μεταβολές των συγκεντρώσεων ανοσοσφαιρινών ανάλογα με την ηλικία [13]
Υπάρχουν όμως και παθολογικές αιτίες που μπορούν να προκαλέσουν υπογαμμασφαιριναιμία.
Αυτές χωρίζονται σε γενετικές και επίκτητες και παρουσιάζονται στον πίνακα που ακολουθεί.
Πίνακας 5: Παθολογικές αιτίες υπογαμμασφαιριναιμίας [18]
Παθολογικές αιτίες υπογαμμασφαιριναιμίας
Τύπος Συγκεκριμένη αιτία
Γενετική, κληρονομική αιτία Χ-φυλοσύνδετη αγγαμασφαιριναιμία (νόσος Bruton)
Βαριά συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID)
Επίκτητη αιτία Δυσθρεψία
Κακοήθεια
Λοιμώξεις (πχ HIV, ιλαρά)
Ανοσοκατασταλτικά φάρμακα (πχ αζαθειοπρίνη, σικλοσπορίνη)
Απώλειες πρωτεΐνης (πχ νεφρωσικό σύνδρομο)
Πρέπει να σημειωθεί πάντως, ότι καθώς η IgG αποτελεί την κύρια τάξη ανοσοσφαιρίνης στον ορό
(70-75%), οποιαδήποτε ελάττωση ανοσοσφαιρίνης άλλης τάξης είναι δύσκολο να φανεί κατά την
ηλεκτροφόρηση, και έτσι η τεχνική αυτή δεν είναι αρκετή για να γίνει διάγνωση. [13]
Υπό φυσιολογικές συνθήκες, ο ορός περιέχει ένα ετερογενές μίγμα ανοσοσφαιρινών που
προέρχονται από διαφορετικούς κλώνους πλασματοκυττάρων. H αύξηση της συγκέντρωσής τους
λέγεται υπεργαμμασφαιριναιμία. Σε περιπτώσεις όπως είναι οι λοιμώξεις ή τα αυτοάνοσα
νοσήματα έχουμε αυξημένη παραγωγή ανοσοσφαιρινών από διαφορετικούς κλώνους
πλασματοκυττάρων, και η ανταπόκριση αυτή, ονομάζεται πολυκλωνική. (βλ. κεφάλαιο 4.5)
Όταν όμως έχουμε αυξημένη παραγωγή ανοσοσφαιρινών από έναν κλώνο πλασματο-κυττάρων
τότε έχουμε να κάνουμε με την σύνθεση πανομοιότυπων μορίων ανοσοσφαιρίνης, η οποία
ονομάζεται παραπρωτεΐνη. (βλ. κεφάλαιο 4.5)

23. 23
Παραπρωτεΐνη υπάρχει σε ασθενείς με πολλαπλό μυέλωμα, με την μακροσφαιριναιμία του
Waldenström, και με νόσους βαρέων αλυσίδων. Το πολλαπλό μυέλωμα είναι ο διάχυτος κακοήθης
πολλαπλασιασμός των πλασματοκυττάρων. Στο 50% των περιπτώσεων πολλαπλού μυελώματος
έχουμε μεγαλύτερη παραγωγή ελαφριών αλυσίδων από ό,τι βαρέων, και στο 15% έχουμε μονάχα
παραπρωτεΐνη ελαφριών αλυσιδών. Αυτές οι παραπρωτεΐνες, καθώς είναι μικρού μοριακού
βάρους, μπορούν και καθαρίζονται από την κυκλοφορία του αίματος και έτσι μπορεί να μην είναι
εφικτή η ανίχνευσή τους σε δείγματα ορού, αλλά μονάχα σε δείγματα ούρων (πρωτεΐνες
BenceJones). Η αυξημένη παραγωγή ανοσοσφαιρινών στους ασθενείς πολλαπλού μυελώματος
μπορεί να προκαλέσει απόφραξη των νεφρών με αποτέλεσμα το ένα τρίτο των ασθενών με
πολλαπλό μυέλωμα να πεθαίνουν από νεφρική ανεπάρκεια.
Παρ’ όλα αυτά, παραπρωτεΐνη μπορεί να υπάρξει και σε ανθρώπους (κυρίως μεγάλης ηλικίας)
χωρίς να εμφανίζεται κάποια άλλη παθολογική κατάσταση (καλοήθης παραπρωτεΐνη). Απαιτείται
μεθοδικός, προσεκτικός και τακτικός έλεγχος των ασθενών σε βάθος χρόνου για να αποκλεισθεί η
περίπτωση κακοήθους παραπρωτεΐνης.[2, 13, 18]

24. 24
4. Ηλεκτροφόρηση Πρωτεϊνών
4.1 Ιστορικά στοιχεία
Στις αρχές του 19ου
αιώνα, ο Γερμανός χημικός Φέρντιναντ Φρέντερικ Ρόις στο Κρατικό
Πανεπιστήμιο της Mόσχας δημοσίευσε τις παρατηρήσεις του σχετικά με την μετακίνηση
σωματιδίων αργίλλου εντός διαλύματος κατά την εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου. Στα πλαίσια του
ίδιου πειράματος παρατήρησε ότι ταυτόχρονα λάμβανε χώρα μετακίνηση νερού στην αντίθετη
κατεύθυνση (ηλεκτροώσμωση). Οι παρατηρήσεις αυτές, που τότε αποδίδονταν σε ένα φαινόμενο
που το ονόμασαν καταφόρηση, θεωρούνται ότι αποτελούν τις απαρχές της μεθόδου που σήμερα
ονομάζουμε ηλεκτροφόρηση. Η ηλεκτροφόρηση είναι μία τεχνική που μας επιτρέπει τον
διαχωρισμό φορτισμένων μορίων και είναι επομένως ιδανική για τον διαχωρισμό βιολογικών
μακρομορίων όπως είναι οι πρωτεΐνες. Όλο τον υπόλοιπο 19ο
αιώνα ακολούθησαν διάφορα άλλα
πειράματα όπως είναι η μετακίνηση έγχρωμων πρωτεϊνών όπως είναι η αιμοσφαιρίνη
Το πιο σημαντικό βήμα όμως, ήρθε από τον Σουηδό χημικό Άρνε
Τισέλιους ο οποίος το 1930 χρησιμοποίησε την ηλεκτροφόρηση για
τον διαχωρισμό πρωτεϊνών του ανθρώπινου ορού. Κατάφερε δε, να
ποσοτικοποιήσει τις συγκεντρώσεις των πρωτεϊνών του ορού σε
φυσιολογικές αλλά και σε παθολογικές καταστάσεις. Για την μελέτη
του πάνω στην ηλεκτροφόρηση και τις ανακαλύψεις του σχετικά με
την φύση των πρωτεϊνών του ορού, το 1948 βραβεύτηκε με το
βραβείο Νόμπελ Χημείας. [31, 32] Η ηλεκτροφόρηση κατά Τισέλιους
είναι μία ηλεκτροφορητική τεχνική που χρησιμοποιεί υδατικά
ρυθμιστικά διαλύματα χωρίς στερεό ή μήτρα σαν υπόβαθρο
στήριξης. Για να αποφευχθούν οι αναμείξεις διαλυμάτων, και για να
αυξηθεί η διαχωριστική ικανότητα των πρωτεϊνών, το σύστημα
ηλεκτροφόρησης που ανέπτυξε είχε σχήμα U και περιλάμβανε τη
χρήση συρόμενων διαφραγμάτων που καθόριζαν τα ακριβή όρια
ανάμεσα στα ρυθμιστικά διαλύματα και στα δείγματα. Στην επόμενη
σελίδα παρατίθεται η διάταξη του συστήματος ηλεκτροφόρησης που
ανέπτυξε. [33]
Αυτή η ηλεκτροφορητική τεχνική με τα συρόμενα διαφράγματα επέτρεψε στον Λέονορ Μικαέλις
(γνωστός από την εξίσωση Μικαέλις-Μέντεν) να προσδιορίσει τα ισοηλεκτρικά σημεία μερικώς
απομονωμένων ενζύμων, αλλά ήταν και καταλυτικής σημασίας για τον αρχικό ορισμό των πέντε
κλασμάτων των πρωτεϊνών του ανθρώπινου ορού (αλβουμίνη, α1-, α2-, β-, και γ- σφαιρίνες). [34]
Σχήμα 14 Ο βραβευμένος με
Νόμπελ Χημείας για το έργο του
στην ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών
ορού, Άρνε Τισέλιους
(https://www.nobelprize.org/nob
el_prizes/chemistry/laureates/19
48 , Νοέμβριος 2016)

25. 25
Σχήμα 15: Η ηλεκτροφόρηση κατά Τισέλιους[33]
Ένα από τα κυριότερα μειονεκτήματα της ηλεκτροφόρησης με τα κινούμενα διαφράγματα όπως
στην συσκευή του Τισέλιους ήταν η αδυναμία να γίνει πλήρης διαχωρισμός γειτονικών ζωνών
πρωτεϊνών. Τα προβλήματα των προηγούμενων τεχνικών άρχισαν να επιλύονται με την ανάπτυξη
τεχνικών κατά τις οποίες οι αναλύτες θα μπορούσαν να οδεύουν πάνω σε κάποιο υποστηρικτικό
υλικό. Οι τεχνικές αυτές ονομάζονται ηλεκτροφόρηση ζώνης. Η χρήση χαρτιού ως το πρώτο
υποστηρικτικό μέσο ως ένα βαθμό αντιμετώπισε κάποια από τα μειονεκτήματα. Παρ’ όλα αυτά
εμφανίστηκαν νέες δυσκολίες που συσχετίζονταν με την ίδια την φύση του μέσου υποστήριξης.
Παρατηρήθηκε ότι ανάλογα με το μέσο υποστήριξης, ακόμα και ανάλογα με την μάρκα
διαφορετικού διηθητικού χαρτιού η όδευση των πρωτεϊνών διέφερε. Αυτό οφείλεται στο
φαινόμενο της ηλεκτροενδοώσμωσης. To υλικό υποστήριξης (είτε πρόκειται για χαρτί είτε οξική
κυτταρίνη) περιέχει ανιόντα τα οποία έχουν αρνητικό φορτίο σε σχέση με το πιο θετικά φορτισμένο
ρυθμιστικό διάλυμα. Μεταβολές αυτής της ισορροπίας φορτίων (μέσω της αλλαγής του
ηλεκτροφορητικού υλικού) επηρεάζει την όδευση των μορίων με ασθενέστερο αρνητικό φορτίο
(όπως είναι οι γ-σφαιρίνες) αφού η ροή του θετικά φορτισμένου ρυθμιστικού διαλύματος είναι
προς την αρνητικά φορτισμένη κάθοδο και μπορεί να τα παρασύρει. [33, 34]
Σχήμα 16: Το φαινόμενο της ηλεκτροενδόωσμοσης. Το αρνητικό φορτίο του υλικού υποστήριξης και η ροή του
ρυθμιστικού διαλύματος προς την κάθοδο επηρεάζουν την όδευση πρωτεινών χαμηλού φορτίου προς την άνοδο.
(https://www.labce.com/spg206971_electroendosmosis.aspx, Δεκέμβριος 2016)
Από τον Δεύτερο Παγκόσμιο Πόλεμο μέχρι το τέλος της δεκαετίας του 60 η κύρια μέθοδος
διαχωρισμού ήταν η χρωματογραφία επί χάρτου για αναλύτες ουδέτερου φορτίου και η
ηλεκτροφόρηση επί χάρτου για φορτισμένους αναλύτες. Η ηλεκτροφόρηση χάρτου
ακολουθούμενη από χρώση με μπλε της βρωμοφαινόλης αποτελούσε την καθιερωμένη τεχνική
διαχωρισμού των πρωτεϊνών του ορού στα κλινικά εργαστήρια. Ακολούθησε η αντικατάσταση του
χαρτιού με οξική κυτταρίνη και αργότερα με νιτροκυτταρίνη.

26. 26
Ο διαχωρισμός των μικρών φορτισμένων μορίων κατά την επίπεδη ηλεκτροφόρηση περιορίζεται
από την θέρμανση Joule. Για το λόγο αυτό αναπτύχθηκαν περίπλοκα συστήματα ηλεκτροφόρησης
υψηλού δυναμικού με εξαναγκασμένη ψύξη. [31]
Οι περιορισμοί των πρώτων ηλεκτροφορητικών τεχνικών οδήγησε την έρευνα στην αναζήτηση
νέων υλικών υποστήριξης. Η πρώτη λύση ήρθε το 1955 όπου ο Αμερικανός γενετιστής Όλιβερ Σμίθιζ
(βραβευμένος με Νόμπελ Φυσιολογίας και Ιατρικής το 2007), απέδειξε ότι οι πρωτεΐνες μπορούσαν
να διαχωριστούν σε πλάκες πηκτής αμύλου, με βάση το μοριακό τους βάρος. Ακολούθησε η
ανάπτυξη της ηλεκτροφόρησης σε πηκτή αγαρόζης (κυρίως για τον διαχωρισμό μεγάλων
βιομορίων, όπως τα νουκλεϊκά οξέα) και η χρήση συνθετικών πηκτωμάτων πολυακρυλαμιδίου μαζί
με την επιφανειοδραστική ουσία δωδεκυλικό θειϊκό νάτριο (Sodium dodecyl sulfate, SDS). Η
τεχνική αυτή ονομάζεται SDS-PAGE και είναι χρήσιμη για τον διαχωρισμό των πρωτεϊνών και
μικρών μορίων νουκλεϊκών οξέων. Ειδικά ο συνδυασμός της SDS-PAGE σε δύο διαστάσεις με την
τεχνική της ισοηλεκτρικής εστίασης (isoelectric focusing, IEF) αποτέλεσε ένα πολύτιμο εργαλείο και
πρόκειται ουσιαστικά για την βάση της επιστήμης της Πρωτεωμικής. Αυτή η ηλεκτροφόρηση σε δύο
διαστάσεις σημαίνει ότι οι πρωτεΐνες μετακινούνται κατά μήκος του ενός άξονα ως προς το
μοριακό τους βάρος (SDS-PAGE) και κατά μήκος του άλλου άξονα ως προς το ισοηλεκτρικό τους
σημείο (IEF). Hταυτοποίηση των πρωτεϊνών μπορεί να γίνει με χρήση τεχνικών φασματομετρίας
μάζας (παραδείγματος χάριν MALDI-TOF).[11, 31]
Σχήμα 17: Το σύνολο της μιτοχονδριακής πρωτεΐνης του φυτού Αραβιδόψης (το πρώτο φυτό στο οποίο προσδιορίστηκε το
γονιδίωμά του). Ο διαχωρισμός έγινε από τρεις διαφορετικές τεχνικές ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου δύο
διαστάσεων. (a) 2D IEF/SDS PAGE. IEF (x άξονας), SDS PAGE (y άξονας). (b) 2D BN/SDS PAGE. BN PAGE (x άξονας), SDS
PAGE (y άξονας). (c) 2D BN/BN PAGE. BN PAGE (x axis), BN PAGE (y axis). [35]
Η ηλεκτροφόρηση πηκτής είναι η πιο συνηθισμένη τεχνική διαχωρισμού για τους τομείς της
βιοχημείας και της βιολογίας, και χρησιμοποιείται ακόμα και σήμερα για διαγνωστικούς σκοπούς
στα κλινικά εργαστήρια.[31, 36]
Επόμενος σταθμός αποτέλεσε η ανάπτυξη της ηλεκτροφόρησης τριχοειδούς, που επιτυχώς
αντιμετώπιζε το πρόβλημα της θέρμανσης Joule. Σε αντίθεση με τις προηγούμενες τεχνικές έχει
μεγάλη διαχωριστική ικανότητα, ταχύτητα, ευκολία χρήσης, και είναι κατάλληλη για
αυτοματοποιημένη χρήση και συνεπώς για την ανάλυση μεγάλου αριθμού δειγμάτων.[31, 36]
H ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή αγαρόζης όπως επίσης και η ηλεκτροφόρηση τριχοειδούς
θα αναλυθούν στα επόμενα κεφάλαια.

27. 27
4.2 Θεωρητική βάση των ηλεκτροφορητικών τεχνικών
Η ηλεκτροφόρηση αποτελεί μία τεχνική διαχωρισμού που μας επιτρέπει να εκμεταλλευτούμε την
διαφορά στην ταχύτητα μετανάστευσης/όδευσης φορτισμένων σωματιδίων σε ένα ρυθμιστικό
διάλυμα στο οποίο έχουμε εφαρμόσει ένα ηλεκτρικό πεδίο. H τάση που εφαρμόζεται οδηγεί στην
ελεύθερη μετακίνηση των φορτισμένων σωματιδίων προς το ηλεκτρόδιο αντίθετου φορτίου. Η
ταχύτητα με την οποία μετακινείται ο αναλύτης στο διάλυμα ονομάζεται ταχύτητα όδευσης
(migration velocity) 𝓋 (cms-1
) και ορίζεται ως εξής:
𝓋 = 𝜇 𝑒 𝛦
Είναι δηλαδή ίση με το γινόμενο της έντασης του ηλεκτρικού πεδίου 𝛦 (Vcm-1
) επί την
ηλεκτροφορητική ευκινησία 𝜇 𝑒 (electrophoreticmobility) (cm2
V-1
s-1
). Η ηλεκτροφορική ευκινησία
είναι χαρακτηριστική για κάθε αναλύτη και είναι ουσιαστικά το μέγεθος το οποίο περιλαμβάνει όλα
τα χαρακτηριστικά που επηρεάζουν την ταχύτητα όδευσης του αναλύτη όπως είναι το φορτίο, το
μέγεθος κλπ, και μπορεί να ορισθεί ως εξής:
𝜇 𝑒 =
𝑄
6𝜋𝜂𝛼
Όπου 𝑄 το φορτίο του αναλύτη, 𝜂 το ιξώδες του μέσου, και 𝛼 η ακτίνα Stokes ενός σφαιρικού
σωματιδίου. Παρατηρούμε ότι η ηλεκτροφορητική ευκινησία είναι ανάλογη του φορτίου του
σωματιδίου. Ο παρονομαστής δε, αποτελεί την σταθερά τριβής του Stokes για σφαιρικά σωματίδια.
Όσο αυξάνεται η ακτίνα 𝛼 τόσο αυξάνεται η τριβή που δέχεται το σφαιρικό σωματίδιο και άρα
υπάρχει αντίσταση ως προς την κίνηση του αναλύτη προς το ηλεκτρόδιο του αντίθετου φορτίου.
[11, 36]
Ουσιαστικά η ταχύτητα όδευσης είναι αποτέλεσμα της ισορροπίας ανάμεσα στην ηλεκτροστατική
έλξη την δύναμη τριβής και τις υπόλοιπες δυνάμεις που αντιστέκονται στην ηλεκτροστατική έλξη:
Σχήμα 18: Το σύνολο των δυνάμεων που υπάρχουν κατά την ηλεκτροφόρηση ενός φορτισμένου σωματιδίου σε έναν
ηλεκτρολύτη. Η γκρίζα ζώνη αντιπροσωπεύει την αντίθετης κατεύθυνσης δύναμη που οφείλεται στην ηλεκτρική
διπλοστιβάδα.( https://lcp.elis.ugent.be/research/electrophoresis, Νοέμβριος 2016)
Όπως φαίνεται από την σχέση της ταχύτητας όδευσης, η αύξηση της τάσης που εφαρμόζουμε
οδηγεί σε γρηγορότερο διαχωρισμό. Παρόλα αυτά, κάτι τέτοιο οδηγεί και σε παραγωγή
περισσότερης θερμότητας (θερμότητα Joule) κάτι που επηρεάζει αρνητικά την διαχωριστική
ικανότητα. H θερμότητα Joule εξαρτάται από τους εξής παράγοντες:

28. 28
𝜃𝜀𝜌𝜇ό𝜏𝜂𝜏𝛼 = (𝐸)(𝐼)(𝑡)
Όπου 𝐸 η ΗΕΔ μετρημένο σε V,I το ρεύμα σε A, και t ο χρόνος σε s. Η αύξηση της θερμότητας Joule
οδηγεί σε εξάτμιση του νερού του ρυθμιστικού διαλύματος και συνεπώς σε αύξηση της ιοντικής
συγκέντρωσης, τοπικές μεταβολές στο ιξώδες και την θερμότητα. Όλα αυτά οδηγούν σε διεύρυνση
των ηλεκτροφορητικών ζωνών και ελαττωμένο διαχωρισμό. [2]
Το pH του διαλύματος παίζει σημαντικό ρόλο στον διαχωρισμό των πρωτεϊνών. Κατά την
ηλεκτροφόρηση τα αρνητικά φορτισμένα ανιόντα οδεύουν προς τον θετικό πόλο του ηλεκτρικού
πεδίου (άνοδος) ενώ τα θετικά φορτισμένα κατιόντα προς τον αρνητικό πόλο (την κάθοδο). Το
φορτίο των αμινοξέων όμως, οι δομικές μονάδες των πρωτεϊνών, μεταβάλλεται και εξαρτάται τόσο
από την πλευρική ομάδα του κάθε αμινοξέος όσο και από το pH του διαλύματος στο οποίο
βρίσκονται. Μπορούν να συμπεριφερθούν ως οξέα ή ως βάσεις (είναι αμφολύτες).
Μεταβάλλοντας το pΗ ενός υδατικού διαλύματος μπορούμε να αλλάξουμε το φορτίο του
αμινοξέος. Αυτές οι διαφορές στο φορτίο των αμινοξέων είναι καθοριστικές για την όδευση των
πρωτεϊνών κατά την ηλεκτροφόρηση. [11] Μπορούμε να καταλάβουμε την σημασία που έχει η
περιεκτικότητα της πρωτεΐνης σε συγκεκριμένα αμινοξέα σε περιπτώσεις όπως είναι οι σημειακές
γενετικές μεταλλάξεις (για παράδειγμα στην περίπτωση της έλλειψης α1-αντιθρυψίνης) όπου ένα
φορτισμένο αμινοξύ αντικαθίσταται από ένα ουδέτερο ή το αντίστροφο, θα αλλάξει την όδευση της
μεταλλαγμένης πρωτεΐνης, κάτι που μπορεί να βοηθήσει στην ανίχνευση της.
Η τιμή του pH όπου το ολικό φορτίο μίας πρωτεΐνης είναι ουδέτερο, ονομάζεται ισοηλεκτρικό
σημείο (pI) η τιμή του οποίου εξαρτάται από τα αμινοξέα και τους υδατάνθρακες (αν είναι
γλυκοπρωτεΐνη) από τα οποία αποτελείται η πρωτεΐνη. Το Pi είναι σταθερό και συγκεκριμένο για
κάθε πρωτεΐνη. Για την ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών του ανθρώπινου ορού, του
εγκεφαλονωτιαίου υγρού, και των ούρων χρησιμοποιείται αλκαλικό ρυθμιστικό διάλυμα με pH
πάνω από 8. Σε αυτή την τιμή του pH όλες σχεδόν οι πρωτεΐνες του ορού έχουν αρνητικό φορτίο,
ακόμα και οι γ-σφαιρίνες, και συνεπώς οδεύουν προς την άνοδο. [34]
To ρυθμιστικό διάλυμα εξασφαλίζει την σταθερότητα του pH αλλά και την διάδοση του ηλεκτρικού
ρεύματος. Η ιοντική ισχύς του ρυθμιστικού διαλύματος όμως είναι ένας ακόμα σημαντικός
παράγοντας που πρέπει να ληφθεί υπ’ όψιν κατά την ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών. Η αύξηση της
συγκέντρωσης αλάτων (παραδείγματος χάριν NaCl) στο ρυθμιστικό διάλυμα μπορεί να περιορίσει
την όδευση μίας πρωτεΐνης. Για παράδειγμα κατά την ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών ορού με
ρυθμιστικό διάλυμα με pH 8.6 η λευκωματίνη έχει ένα ισχυρό αρνητικό φορτίο. Τα αυξημένα όμως
κατιόντα Na+
στο διάλυμα έλκονται από αυτήν και μπορεί να περιορίσουν την όδευσή της προς την
άνοδο. Αυτός είναι και ο λόγος που πρέπει να προσέχουμε κατά την ηλεκτροφόρηση την εξάτμιση,
ώστε να αποφευχθεί η αλλαγή της συγκέντρωσης των ιόντων στο διάλυμα:
Σχήμα 19: Η μεταβολή της ιοντικής ισχύος του ρυθμιστικού διαλύματος επηρεάζει την ηλεκτροφόρηση[34]

29. 29
4.3 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή αγαρόζης
Από τα κόκκινα φύκητης τάξης των Rhodophyceae γίνεται
η απομόνωση μίας ζελατινώδους ουσίας που ονομάζεται
άγαρ. Πρόκειται για ένα πολυσακχαρικό σύμπλεγμα που
αποτελείται από αγαρόζη (το κύριο συστατικό, περίπου
70%) και αγαροπηκτίνη (περίπου 30%). Η αγαρόζη είναι
ένας πολυσακχαρίτης που αποτελείται από τα
εναλλασσόμενα σάκχαρα D-γακακτόζη και 3,6-άνυδρο-L-
γαλακτόζη ενωμένα με α-1,3 και β-1,4 γλυκοζιτικούς
δεσμούς. Η αγαροπηκτίνη, σε αντίθεση με την αγαρόζη,
δεν έχει πηκτικές ιδιότητες ενώ έχει μεγάλη
περιεκτικότητα σε θειικές ομάδες και ομάδες
πυροσταφυλικού οξέος που μπορούν να συνεισφέρουν
σημαντικά στην ηλεκτροενδοωσμωτική ροή. Για αυτό το
λόγο συνήθως κατά την ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιείται
αγαρόζη υψηλής καθαρότητας. [2, 34]
Σχήμα 21: Οι δομικές μονάδες της αγαρόζης (αριστερά) και της αγαροπηκτίνης (δεξιά)
(https://www.sigmaaldrich.com, Νοέμβριος 2016)
Κάποιοι κατασκευαστές παρ’ όλα αυτά χρησιμοποιούν εσκεμμένα αυξημένες ποσότητες
αγαροπηκτίνης στις πλάκες πηκτής που πουλούν καθώς η ηλεκτροενδοώσμωση ως ένα βαθμό
μπορεί να βοηθήσει σε ορισμένους διαχωρισμούς όπως είναι αυτός της ηλεκτροφόρησης
πρωτεϊνών ορού, όπου οι γ-σφαιρίνες θα μετακινηθούν καθοδικά λόγω της ηλεκτροενδοωσμωτικής
ροής. [34]
Σχήμα 22: Η σύσταση της πηκτής μπορεί να ενισχύσει την ηλεκτροενδοώσμωση. Το φαινόμενο αυτό μπορεί να βοηθήσει
στον διαχωρισμό πρωτεϊνών ορού, καθώς οι γ-σφαιρίνες μετακινούνται πιο καθοδικά από το σημείο εφαρμογής. [34]
Σχήμα 20: Κόκκινα φύκη παράγουν το άγαρ
(http://www.greenprophet.com, Νοέμβριος
2016)