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Reptes per a una ciència més ètica: mètodes innovadors per reemplaçar l'experimentació animal
30 setembre – 1 d’octubre 2019
Alternatives a estudis de
sensibilització dèrmica
Dra. Montse Mitjans Arnal
Professora Agregada, Dt. Bioquímica i Fisiologia, Facultat de
Farmàcia i Ciències de l’Alimentació, UB
• Dermatitis de contacto alérgica i identificación de alérgenos
• Mecanismo fisiológico de la DCA
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Peiser et al., Cell Mol Life Sci, 69:763–781, 2012
• Dermatitis de contacto alérgica: problema de Salud Pública
• Prevalencia 20% Europa, aumentando en todo el mundo
• Consumidores, trabajadores (Salud laboral)
Los alérgenos de contacto son cotidianos
• Fragancias: ~ 3.000, productos químicos y extractes naturales.
30% DCA cosméticos
• Metales: Cr, Ni
• Conservantes: isotiazolinas, formaldehído
• Tintes. DCA severas
• Otros ingredientes:
• Filtros solares (foto alergia)
• Resinas epoxi
• Gomas
• Acrilatos
Scientific Committee on Consumer Safety (SCCS)
https://ec.europa.eu/health/scientific_committees/consumer_safety_en
ρ-Phenylenediamine
(Hydroxyethyl)methacrylate
Cananga Odorata
(Ylang-ylang oil)
Cinnamal
Maio et al., Dermatology Online
Journal 18 (2): 13, 2012
Garantizar la seguridad: identificar alérgenos
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Sensibilización dérmica
Saito et al., Int J Mol Sci , 17, 202, 2016
• Hipersensibilidad retardada o tipo IV
Sensibilización: ID + tópica con/o sin adjuvante (5-8)
Tópica parche oclusivo (0, 6, 8)
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Estructura y propiedades del alérgeno
• Biodisponibilidad dérmica (hapteno, prohapteno, prehapteno
• Absorción cutánea
• Metabolismo
• Propiedades reactivas: QSAR (OECD QSAR Toolbox, VEGA, TOPKAT, …).
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SENS-IS
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Membrana celular
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Activación de las células dendríticas
• Expresión de moléculas de superficie: h-CLAT y U-SENS™ OECD TG 442E,
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• Secreción de IL: IL-8 Luc, OECD TG 442E
• Activación (huella) genética: GARD
Ryan et al., Toxicol Appl Pharmacol 221 (3): 384-394, 2007 Forreryd et al., Toxicol in Vitro 37: 178–188, 2016
• Loose-fit Coculture-based Sensitization Assay (LCSA): cocultivo
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Wong et al., Frontiers in Pharmacology, 6: 94, 2015 Adaptado de S. Gibbs et al., Toxicol in Vitro 27: 1170–1179, 2013
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Martin et al., Cell Mol Life Sci 67:4171–4184, 2010
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• Elevada variabilidad: donantes linfocitos T
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• Propiedades del alérgeno: reactividad
• Formación de complejo hapteno-proteína
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Martin et al., Contact Derm , 72, 2-10, 2014
Activació i proliferació de limfòcits T
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SENS-IS
Ezendam et al., Arch Toxicol 90:2861–2883, 2016
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SENS-IS
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30 setembre – 1 d’octubre 2019
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Montse Mitjans

  • 1. Reptes per a una ciència més ètica: mètodes innovadors per reemplaçar l'experimentació animal 30 setembre – 1 d’octubre 2019 Alternatives a estudis de sensibilització dèrmica Dra. Montse Mitjans Arnal Professora Agregada, Dt. Bioquímica i Fisiologia, Facultat de Farmàcia i Ciències de l’Alimentació, UB
  • 2. • Dermatitis de contacto alérgica i identificación de alérgenos • Mecanismo fisiológico de la DCA • Estudios preclínicos tradicionales • Alternativas in vitro: presente y futuro. Temas que se trataran Murphy et al., Allergy and Hypersensitivity, 2008
  • 3. Dermatitis y salud: impacto sobre población 22% Estética 17% Hostelería A partir de Subiabre-Ferrer et al., Med Segur Trab (Internet) , 62 (245), 2016 Peiser et al., Cell Mol Life Sci, 69:763–781, 2012 • Dermatitis de contacto alérgica: problema de Salud Pública • Prevalencia 20% Europa, aumentando en todo el mundo • Consumidores, trabajadores (Salud laboral)
  • 4. Los alérgenos de contacto son cotidianos • Fragancias: ~ 3.000, productos químicos y extractes naturales. 30% DCA cosméticos • Metales: Cr, Ni • Conservantes: isotiazolinas, formaldehído • Tintes. DCA severas • Otros ingredientes: • Filtros solares (foto alergia) • Resinas epoxi • Gomas • Acrilatos Scientific Committee on Consumer Safety (SCCS) https://ec.europa.eu/health/scientific_committees/consumer_safety_en ρ-Phenylenediamine (Hydroxyethyl)methacrylate Cananga Odorata (Ylang-ylang oil) Cinnamal Maio et al., Dermatology Online Journal 18 (2): 13, 2012
  • 5. Garantizar la seguridad: identificar alérgenos Identificar Ensayo(s) positivo(s) Caracterizar Potencia Gestionar Etiquetaje Valorar Patrones Límites de exposición
  • 6. Sensibilización dérmica Saito et al., Int J Mol Sci , 17, 202, 2016 • Hipersensibilidad retardada o tipo IV
  • 7. Sensibilización: ID + tópica con/o sin adjuvante (5-8) Tópica parche oclusivo (0, 6, 8) Criterio de clasificación: > 30% o 15% Provocación: Aplicación tópica (20-22 o 27-28) Valoración: Observación 21h a 72 h, según método Maximización - Buehler; OECD 406, 1992 Evaluación tradicional: in vivo Local Lymph Node Assay; OECD 429, 2010 Nombre animales10 x 2 grupos 4 x 5 grupos 0, 1, 2d 3H-timidina Día 5 5 h Proliferación celular Índice de estimulación: SI Concentración EC3 Nódulos linfáticos 24-30 días Subjetiva 5-6 días Objetiva Tiempo de ensayo Valoración resultado Daicel-ATP (OECD 442A, 2010) BrdU-ELISA/FCM (OECD 442B, 2018)
  • 8. Estrategias in vitro: Adverse Outcome Pathway LLNA y modificaciones (OECD 429) Ezendam et al., Arch Toxicol 90:2861–2883, 2016 Maximización y Buehler (OECD 406) PC.1 PC.2 PC.3 PC.4 AO
  • 9. Estructura y propiedades del alérgeno • Biodisponibilidad dérmica (hapteno, prohapteno, prehapteno • Absorción cutánea • Metabolismo • Propiedades reactivas: QSAR (OECD QSAR Toolbox, VEGA, TOPKAT, …). Modelos in silico Necesario pero no determinante https://www.lhasalimited.org/products/Derek-Nexus-for-skin- sensitisation.htm https://www.123rf.com/photo_17432855_epidermis -of-the-skin.html
  • 10. MIE: reacción molecular inicial https://www.creative-diagnostics.com/blog/index.php/immunogen-antigen-hapten-epitope-and-adjuvant/ prohapteno prehapteno Oxidación UV Hapteno Interacción nucleófila - electrófila Proteína Ag completo
  • 11. Métodos basados en la iniciación molecular DPRA, OECD 442C, 2015 Unión covalente de electrófilos a proteínas cutáneas Cor1C420 Natsch et al. 2015 ADRA-DM Yamamoto et al. 2015 PPRA Peroxidasa, prohaptenos LC-MS, adductes ↓ AA otros
  • 12. Respuesta inflamatoria de los queratinocitos Keap1 ROS Nrf2 p38MAPK NF-ҡB IL-1β IL-18 TLR Caspasa-1 My088 Haptè HMOX1 NQO1 Altres gens Citocinas proinflamatorias SENS-IS EpisensA Keratinosens™, OECD 442D LuSENS KC cell lines RhE IL-18 potency assaymRNA Membrana celular ARE
  • 13. Activación de las células dendríticas • Expresión de moléculas de superficie: h-CLAT y U-SENS™ OECD TG 442E, mMUSST • Secreción de IL: IL-8 Luc, OECD TG 442E • Activación (huella) genética: GARD Ryan et al., Toxicol Appl Pharmacol 221 (3): 384-394, 2007 Forreryd et al., Toxicol in Vitro 37: 178–188, 2016
  • 14. • Loose-fit Coculture-based Sensitization Assay (LCSA): cocultivo • Migración de DC Wong et al., Frontiers in Pharmacology, 6: 94, 2015 Adaptado de S. Gibbs et al., Toxicol in Vitro 27: 1170–1179, 2013 alérgeno irritante IL-1-α TNF-α ↑CXCR4 mLC ↑CXCL12 ↑CCL2 ↑CCL5 iLC Activación de células dendríticas
  • 15. Activación y proliferación de linfocitos T Martin et al., Cell Mol Life Sci 67:4171–4184, 2010 Moser et al., J Immunol methods. (2010) 353: 8–194 • Elevada variabilidad: donantes linfocitos T • Presencia de Treg • Propiedades del alérgeno: reactividad • Formación de complejo hapteno-proteína • Protocolos a perfeccionar
  • 16. Martin et al., Contact Derm , 72, 2-10, 2014 Activació i proliferació de limfòcits T
  • 17. hCLAT U-Sens/MUSST IL-8 Luc Assay SENS-IS Ezendam et al., Arch Toxicol 90:2861–2883, 2016 Keratinosens/Lusens SENS-IS PC.1 PC.2 PC.3 PC.4 AO Resumen: disponibilidad actual DPRA/PPRA
  • 18. Integración de los datos: el reto Identificación y potencia del alérgeno (NESIL) para evaluación del riesgo Integración de datos Linfocitos T: Activación Reguladores NK Metabolismo SAR Linfocitos B ? Mastocitos? Integrada ITS Secuencial STS Iterativa IATA (WoE) Estrategias modelos de predicción
  • 19. Noves técnicas y métodos: Impresión 3D? • Combinación de diferentes células y materiales • Fabricación automatizada • Validación para ensayo toxicológico? • Elevada relación coste/rendimento • Células del sistema inmune Wei Long Ng et al, Biofabrication 10 025005, 2018
  • 20. Noves técnicas y métodos: skin-on-chip? Ramadan Q Ting Lab on a Chip, 16: 1899–1908, 2016 • Cultivo celular basado en la tecnología de los microfluidos • Interacciones intercelulares y matriz extracelular • Cocultivo queratinocitos – células inmunitarias • Tiempos más largos
  • 21. Reptes per a una ciència més ètica: mètodes innovadors per reemplaçar l'experimentació animal 30 setembre – 1 d’octubre 2019 Gràcies per la vostra atenció!