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Curso de Genómica - UAT (VHIR) 2012 - RT-qPCR
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Curso de Genómica - UAT (VHIR) 2012 - RT-qPCR

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  • 1. Programa del Seminario RTqPCR- 2012 Definición de la técnica Terminología asociada a qPCR qPCR Workflow Validación de un ensayo de qPCR Servicio de qPCR en la UCTS Bibliografía muy recomendada
  • 2. Definición de la TécnicaPCR en tiempo real o qPCR o RT-qPCR UNG A G CU T (opciona Taq Ácido Tampón de l)polimeras nucléico Cebadores dNTPs reacción a ROX Agentes Sonda R Q Termociclador intercalantes con sistema de detecciónhttp://www.appliedbiosystems.com/support/apptech/#rt_pcr
  • 3. Definición de la Técnica PCR Convencional RT-qPCR Semi-cuantitativa:  Cualitativa y cuantitativa. Rango dinámico pequeño ›2 logs Cuantificación Absoluta Baja Precisión; baja resolución y A tiempo real (fase exponencial) Cuantificación Relativa poco Sensible. Manipulación post-PCR . A tiempo final Plus/Minus Baja Resolución (fase plató) Discriminación Alélica No-automatización Discriminación basada sólo en tamaño  Elevado rango dinámico de Los resultados no están detección expresados en números.  Capaz de detectar cambios 2-fold. El BrET no es muy cuantitativo  No requiere procesado post-PCR
  • 4. Programa del Seminario RTqPCR-2012 Definición de la técnica Terminología asociada a qPCR qPCR Workflow Validación de un ensayo de qPCR Servicio de qPCR en la UCTS Bibliografía muy recomendada
  • 5. Terminología asociada a qPCR Escala semi- logarítmica a l Plató Line ial Fluorescence nc neRn Log po Threshold Ex Baseline Ct value= 15.5 Cycle Number
  • 6. Terminología asociada a qPCR ROX (6-carboxy-X-rhodamine) como referente pasivo + ROX - ROX Desv St= ± 0.306 Desv St= ± 0.059Δ Rn Ciclos Ciclos Fluoróforo referente pasivo más comúnmente utilizadopara normalizar la fluorescencia específica en instrumentos de ABI y Stratagene.
  • 7. Terminología asociada a qPCR Aplicaciones 3´oligo 5´oligo RTqPCR Proteína Tejido Target mRNA miRNCélula RNA AEucariota ncRN A siRNAAnálisis en Células Stem Validación Microarrays saRNAnálisis en célula Única A CNA SNP DNA Bacteria CNV Micoplasma Mutaciones Patógenos en la comida Virus Análisis Metilación
  • 8. Programa del Seminario RTqPCR-2012 Definición de la técnica Terminología asociada a qPCR qPCR Workflow Validación de un ensayo de qPCR Servicio de qPCR en la UCTS Bibliografía muy recomendada
  • 9. qPCR WorkflowSlope= -1.365Slope= -2.276
  • 10. qPCR Workflow
  • 11. qPCR Workflow DNA Muestra Producto RNA cDNA Amplifica do Diseño Preparación Extracción Transcripción Estrategia Análisis qPCRExperimental Muestra Ác. Nucléicos Reversa (RT) Cuantif. Estadístico
  • 12. qPCR Workflow: Diseño experimental DNA Muestra Producto RNA cDNA Amplifica do Diseño Preparación Extracción Transcripción Estrategia Análisis qPCR Experimental Muestra Ác. Nucléicos Reversa (RT) Cuantif. Estadístico Definir el experimento y los grupos control Número muestras de cada grupo Réplicas Experimentales (Biológicas y Técnicas) Distribución de placa (genes vs muestras)
  • 13. qPCR Workflow: Diseño experimentalDiseño experimental
  • 14. qPCR Workflow: Diseño experimental RÉPLICASBIOLÓGICASTÉCNICAS
  • 15. qPCR Workflow: Preparación de la muestra DNA Muestra Producto RNA cDNA Amplifica do Diseño Preparación Extracción Transcripción Estrategia Análisis qPCRExperimental Muestra Ác. Nucléicos Reversa (RT) Cuantif. Estadístico Descripción de la muestra (Microdisección o macrodisección) Manipulación (si congelación o FFPE; cómo, que y cuando) Condiciones de almacenamiento
  • 16. qPCR Workflow: extracción de ác. nucléicos DNA Muestra Producto RNA cDNA Amplifica do Diseño Preparación Extracción Transcripción Estrategia Análisis qPCRExperimental Muestra Ác. Nucléicos Reversa (RT) Cuantif. Estadístico  Método de extracción  Tratamiento con DNasa  Calidad (Pureza & Integridad) & Cantidad  Almacenamiento (-80ºC)
  • 17. qPCR Workflow: extracción de ác. nucléicosComo afecta el método de extracción de RNA a los resultados qPCR
  • 18. qPCR Workflow: extracción ác. nucléicos  PUREZA: Libre de contaminación por:  Proteínas, sales caotrópicas y fenoles (Absobancia A260/A280 >1.8-2.0; A260/A230=2)  gDNA (Tratamiento con DNAsa  Inhibidores (SPUD assay (Nolan, 2006)  INTEGRIDAD: No degradado  rRNA (28S:18S=2:1)  RIN (Fleige & Pfaffl, Mol. Aspects Med. 27(2006): RIN › 5)  PCR test: Ensayo 3´:5´(alrededor de 1 indica elevada integridad; ›5 degradado)  CANTIDAD: Usar el mismo método de cuantificación en muestras que se quieren comparar. (Expert Rev. Mol. Diagn. 5, 493-498 (2005)) do da t o ra cDeg Inta 28S 18S2:1
  • 19. qPCR Workflow: extracción ác. nucléico RT FT-80ºC -20ºC4ºC FT-20ºC 4ºC RT -20ºC FT-80ºC FT-20ºC
  • 20. qPCR Workflow: extracción ác. nucléicos Inhibición de la RT-qPCR en qué muestras Material de partida:  Muestras fecales  Cartílago, hígado. Córnea, etc...  Sangre total: heme  Anticoagulante: Heparina Causada por el método de extracción/protocolo erróneo:  Etanol en el eluido por una insufiente centrifugación en el segundo lavado puede inhibir las reacciones de RT y qPCR cDNA o gDNA demasiado concentrado:  Más del 10% de cDNA, gDNA en la qPCR inhibe la reacción.
  • 21. qPCR Workflow: extracción ác. nucléicosComo afecta la calidad del RNA a los resultados qPCR:
  • 22. qPCR Workflow: extracción de ác. nucléicoshttp://biomedicalgenomics.org/RNA_quality_control.html
  • 23. qPCR Workflow: Transcripción Reversa DNA Muestra Producto RNA cDNA Amplifica do Diseño Preparación Extracción Transcripción Estrategia Análisis qPCRExperimental Muestra Ác. Nucléicos Reversa (RT) Cuantif. Estadístico Es la etapa mas variable de todo el proceso  One-Step vs Two Step  Cantidad de RNA y vol de reacción  CDNA Priming  Transcriptasa Reversa y concentración  Pérfil Térmico  Controles  Réplicas
  • 24. qPCR Workflow: Transcripción Reversa One-Step RT- Two-Step RT-PCR PCR RT Descripción RNA cDNA RT qPCR RNA cDNA Amplicón qPCR cDNA Amplicón Minimiza tiempo de preparación y el Posibilidad de almacenar cDNA para la riesgo de contaminación. cuantificación de varios tragets. Pros Menos Background en ensayos  Más eficiente porque se pueden usar SYBRGreen Random primers y oligo(dT) a la vez. Más flexible (Permite la optimización por separado de ambas reacciones. No es posible la optimización por separado de ambas reacciones Contras AmpErase UNG, para prevenir contaminación, no se puede usar Elevado Background en ensayos Menos sensible debido a la menor SYBRGreen eficiencia de la actividad RT de la polimerasaNATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
  • 25. qPCR Workflow: Transcripción ReversacDNA Priming
  • 26. qPCR Workflow: qPCR DNA Muestra Producto RNA cDNA Amplifica do Diseño Preparación Extracción Transcripción Estrategia Análisis qPCRExperimental Muestra Ác. Nucléicos Reversa (RT) Cuantif. Estadístico  Diseño Amplicón y Oligonts.  Reactivos, Instrumento, Perfil Térmico .  Validación (Especificidad, Eficiencia, Reproducibilidad, Rango dinámico lineal).  Controles  Estrategia de Normalización
  • 27. qPCR Workflow: qPCR MFOLD Las secuencias de los oligonts y del amplicón tienen que ser únicas. No deben tener estructuras secundarias. Los oligonts no deben amplificar DNA Efecto de la Tª de anillamiento sobre la estructura secundaria del amplicón: El análisis de la secuencia del (diseño en la zona exon/exon) amplicón mediante el MFOLD predice elevada estructura secundaria a 60ºC y baja a 65ºC. Idealmente, deberían testarse dos Amplicón parejas de oligonts.  75-150 bp.  50-60% contenido en GC. Oligonts  TM= 55-65ºC.  50-60% contenido en GC.  Evitar homopolímeros, sobretodo de G.  Los 5 nts en el extr3¨no deben ser más de 2 G y/o C.
  • 28. qPCR Workflow: qPCR Aplicación Método de Normalización Química de detección:  Sondas específicas marcadas con fluorocromos  Agentes Intercalantes  Fluorocromos unidos a primers Reactivos:  Core kit vs Master Mix  dNTPs/dUTPs y UNG enzyme  ROX como referente pasivo Termociclador:  Formato  Número de canales de detección  Software de análisis  Duración del programa  Precio y flexibilidad de la oferta
  • 29. qPCR Workflow: qPCRPerfil térmico qPCR que incluye paso de Activación UNG 1.- Activación UNG 2.- Activación Taq y desnaturalización UNG 3.- Desnaturalización del dsDNA 4.- Anillamiento y extensión primers
  • 30. qPCR Workflow: qPC Estrategias de Normalización qPCR  Normalización respecto a la masa total de RNA exraído (chequeo calidad –RIN, moleculas/ng RNA)  Normalización respecto al volumen/masa de la muestra ( moléculas/mg tejido; moléculas/ml sangre)  Normalización respecto al número de células ( moléculas/célula)  Normalización respecto a un gen endógeno no regulable (GAPDH, tubulina, actina, albúmina, ciclofilina, micro-globulina, histonas, rRNA, ……)  Normalización respecto a más de un gen endógeno (›3)  geNorm (Vandesompele et al. 2002. Genome Biology)  BestKeeper (Pfaffl et. Al. 2004; Biotechnology Letters 2004)  Normfinder  Statistical modeling for selecting houskeeper genes (Szabo et al.2004, Genome Biology) Genes and Immunity (2005) 6, 279-284. ReviewBMC Bioinformatics 2009, 10:110
  • 31. qPCR Workflow: qPC Genes de Referencia Los genes de referencia tienen que:  ser de expresión constante  No ser regulados por las diferentes condiciones experimentales  Suficientemente abundantes entre los diferentes tejidos y tipos celulares. Se recomienda el uso de al menos 3 genes de referencia para la normalización de datos de qPCR. EL gen de referencia “Perfecto” NO existe. Softwares: genNorm Normfinder
  • 32. qPCR Workflow: qPC Cuando se procesan múltiples muestras en diferentes placas, la inclusión de una muestra calibradora o curva estándar en cada placa es un control importante para medir la variabilidad inter-ensayo. Duplicados técnicos son generalmente suficientes (Triplicados si Cts›35). Si las réplicas difieren ›0.5 Ct, las reacciones deberían repetirse. Son más importantes los duplicados biológicos. Incluir Controles negativo (NTC) y positivos. Cargar el NTC en el pocillo que esté más distanciado de aquel que contenga mayor concentración de cDNA para evitar contaminación cruzada. Preparar mezcla de reacción de pcr en laboratorio diferente de donde se manipule el cDNA. Es siempre mejor no esperar demasiado en correr un run de qPCR después de la preparación de la placa. Si necesitas comparar dos placas idénticas con diferente ciclo de temperaturas, es mejor prepararlas al mismo tiempo, y guardar una de ellas a 4ºC protegido de la luz hasta 10 horas. Especial atención en el sellado de la placa para evitar evaporaciones y evitar marcas y huellas en la parte superior del cobertor/tapa. NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006 Real-Time PCR Aplications Guide from Bio-Rad
  • 33. Programa del Seminario RTqPCR-2012 Definición de la técnica Terminología asociada a qPCR qPCR Workflow Validación de un ensayo de qPCR Servicio de qPCR en la UCTS Bibliografía muy recomendada
  • 34. qPCR Workflow: Validación de un ensayo de qP Reproducibilidad (viene indicada por las réplicas) Controles qPCR NEGATIVOS  NTC (Non Template Control) Detección de dímeros de primers y contaminación  NAC (Non Amplif. Control) Detección de degradación de sondas  No RT (No RT control) Detección de contaminación por DNA genómico POSITIVOS  Control Endógeno Testado de la calidad de los reactivos. Usado también para normalizar.  Control Exógeno Testado de la calidad de los reactivos  Spiking Control Detecta presencia de inhibidores Curva de Disociación (SYBR Green) Curva Estándar  Linealidad de los datos  Distancia entre las curvas de amplificación  Eficiencia de amplificación
  • 35. qPCR Workflow: Validación de un ensayo de qP Eficiencia Convertir E en Pendient Amplificación PorcentajeCurva e (E= 10-1/slope) %E= (E-1)100%Estándard: -3,0 2,2 115 R2 ›0.98 o r › 0.99 -3,1 2,1 110 Slope= -3.73 -3,2 2,1 105 -3,3 2,0 101 -3,32 2,0 100 OK -3,4 2,0 97 -3,6 1,9 90 -3,7 1,9 86 -4 1,8 78 2n=Factor de dilución Factor n=LG(Factor Dilució Dil.)/LG(2) n 2 1,00 5 2,32 10 3,32
  • 36. qPCR Workflow: Validación de un ensayo de qP Eficiencias del Gen Target vs Eficiencia gen EC Slope R2(Ct gen Target – Ct gen Endógeno) Y = 0.0471x + 3.0178 R2 = 0.2315 ΔCt= Log Diluciones
  • 37. qPCR Workflow DNA Muestra Producto RNA cDNA Amplifica do Diseño Preparación Extracción Transcripción Estrategia Análisis qPCRExperimental Muestra Ác. Nucléicos Reversa (RT) Cuantif. Estadístico UEB
  • 38. Programa del Seminario RTqPCR-2012 Definición de la técnica Terminología asociada a qPCR qPCR Workflow Validación de un ensayo de qPCR Servicio de qPCR en la UCTS Bibliografía muy recomendada
  • 39. Servicio de RTqPCR en la UCTS 7000 SDS 7900HT Fast SDS LightCycler 480 Tiras de 8 TubosFormato Microfluidicas Placas-384 White Plates-384 Placas-96 (Arrays de baja densidad)Ref. Pasivo ROX Ninguno ROX Formato 384-p: FAM, TAMRA, Filtros/canales detección:Química FAM, TAMRA, VIC, VIC, JOE, NED, SYBR, ROX, TET. JOE, NED, SYBR, ROX 500, 533, 568, 610, 640, 670 Formato LDA: FAM, VIC, ROX. nmmode 9600 Emulation/Standard Fast 9600 Emulation /Standard FastSoftwares V1.2.3f2 con RQ study SDS 2.4.1 RQ Manager 1.2 SW 1.5 Primer Express 2.0
  • 40. Servicio de RTqPCR en la UCTS Elección en el software del ensayo a realizarSoftware qPCR Plantilla para el Run Análisis 1.-Absolute Quantification Absolute Quantification (Standard curve) (Standard curve)7000 SDS de ABI 2.-Relative Quantification Relative Quantification7000 SDS 1.1 RQ Study (ddCt) Plate (ddCt) Study7900 SDS de ABI 1.- Standard Curve (AQ) 2.- ΔΔCtLighCycler480
  • 41. Servicio de RTqPCR en la UCTSLightCycler 480 II
  • 42. Programa del Seminario RTqPCR-2012 Definición de la técnica Terminología asociada a qPCR qPCR Workflow Validación de un ensayo de qPCR Servicio de qPCR en la UCTS Bibliografía muy recomendada
  • 43. Direcciones de interés relacionadas con qPCR http://qpcr.gene-quantification.info/ http://genex.gene-quantification.info/ http://www.horizonpress.com/pcr/qPCR- machines.htmlqPCR-Technical-Guide.pdf (Sigma Life Science)http://www.eurogentec.comhttp://www.dorak.info/genetics/glosrt.html
  • 44. Gracias

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