Course VHIR-UCTS-UEB - Session 1 - Microarrays

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High throughput technologies in Genomics - Tecnologías de alto rendimiento en genómica.

Session 1: Microarrays

Course held at Vall d'Hebron Research Institute (VHIR), in Barcelona, Catalonia, Spain, on October 5th, 2011.

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Course VHIR-UCTS-UEB - Session 1 - Microarrays

  1. 1. 5 de Octubre de 2011
  2. 2. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICADIA 1. 5 de Octubre Microarrays (Ricardo Gonzalo) RTqPCR (Paqui Gallego) Diseño experimental y análisis de resultados (Alex Sánchez)DIA 2. 30 de Noviembre Ultrasecuenciación (Paqui Gallego y Alex Sánchez)
  3. 3. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICAPre-Experimento… UCTS UEB INVESTIGADOR
  4. 4. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICAMICROARRAYS TIPOS DE ARRAYS •Según su tecnología •Según objetivo del estudio (Affymetrix/UCTS) MATERIAL DE PARTIDA: RNA •Calidad (Bioanalyzer/RIN) •Cantidad (Kits amplificación) EXPERIMENTO DE MICROARRAYS •Procedimiento de amplificación / detección •GeneTitan •Controles de calidad
  5. 5. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICAMICROARRAYS TIPOS DE ARRAYS •Según su tecnología •Según objetivo del estudio (Affymetrix/UCTS) MATERIAL DE PARTIDA: RNA •Calidad (Bioanalyzer/RIN) •Cantidad (Kits amplificación) EXPERIMENTO DE MICROARRAYS •Procedimiento de amplificación / detección •GeneTitan •Controles de calidad
  6. 6. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICATipos de arrays de expresión según su tecnología (I) Arrays de cDNA – 2 colores Arrays de oligos – 1 color Impresión de la sonda síntesis de la sonda “in situ” 2 dyes fluorescentes (Cy3/5) 1 dye fluorescente (FE) 2 muestras / slide 1 muestra / slide 1 gen = pocos spots/replicados 1 gen = representado por muchas sondas diferentes Longitud (nt) elevada oligos de 20-25 nt Medidas relativas medidas absolutas
  7. 7. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICATipos de arrays de expresión según su tecnología (II) Arrays de cDNA (2 colores) Arrays de oligos (1 color) • Más económicos p •Chips de alta densidad • Alta flexibilidad en el diseño r •Muy reproducibles o •Medidas absolutas s •Manejo de clones c • Precio elevado •Posibles hibridaciones cruzadas o • Falta de flexibilidad en algunos •Baja reproducibilidad n formatos s • Equipamiento especializado
  8. 8. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICATipos de microarrays (Plataforma de Affymetrix) (I)DNA ANALYSIS ARRAYS •Genome-Wide SNP Analysis GW Human SNP array 6.0 ? 1.8 M marcadores genéticos (900.000 SNP + 900.000 CNV) •Resequencing Arrays Human Mitochondrial array “Custom” resequencing arrays • Citogenética GW Human SNP array 6.0
  9. 9. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICATipos de microarrays (Plataforma de Affymetrix) (II)GENE REGULATION ANALYSIS ARRAYS • ChiP-on-Chip: Estudio de interacciones entre DNA y proteínas y modificaciones del DNA, ej.  Sitios de unión de factores de transcripción  Sitios de unión de histonas  Metilación del ADN
  10. 10. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICATipos de microarrays (Plataforma de Affymetrix) (III)EXPRESSION ANALYSIS ARRAYS (I) 3’ Expression Human U133 Plus 2.0 array Human U219 array plate Rat, Mouse, Porcine, Zebrafish, … 5’ 3’
  11. 11. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICATipos de microarrays (Plataforma de Affymetrix) (IV)EXPRESSION ANALYSIS ARRAYS (II) Gene Arrays Human, Mouse, Rat Gene 1.0 ST Array Exon Arrays Human, Mouse, Rat Gene 1.0 ST Array Exon Arrays 5’ 3’ Gene Arrays
  12. 12. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICATipos de microarrays (Plataforma de Affymetrix) (V) miRNA GeneChip miRNA 2.0 Array •131 organisms in the array (human, mouse, rat, canine, ….) •100% miRBase v115 •2.334 snoRNAs and scaRNAs (human small nuclear RNAs) •Low inputs amounts (0.1 to 1 ug total RNA) •2.202 probe sets unique to pre-miRNA hairpins • Según el método de purificación se enriquece una fracción u otra.
  13. 13. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICATipos de microarrays (Plataforma de Affymetrix) (VI). Resumen RNA - 3’IVT Expression Hg U133 Plus 2.0 Formato individual o formato placa (16, 24 ó 96) Hg U219 Formato placa - WT-Expression Human Gene Array Formato individual o formato placa Human Exon Array Formato individual - miRNA miRNA Array Formato individual DNA - Resequencing Mitochip Formato individual “Custom” Formato individual
  14. 14. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA¿Cómo están hechos? (I). Fotolitografía
  15. 15. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA¿Cómo están hechos? (II)
  16. 16. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICAMICROARRAYS TIPOS DE ARRAYS •Según su tecnología •Según objetivo del estudio (Affymetrix/UCTS) MATERIAL DE PARTIDA: RNA •Calidad (Bioanalyzer/RIN) •Cantidad (Kits amplificación) EXPERIMENTO DE MICROARRAYS •Procedimiento de amplificación / detección •GeneTitan •Controles de calidad
  17. 17. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICAMATERIAL DE PARTIDA RNA TOTAL Poli A mRNA Células eucariótas QIAGEN EXTRACCIÓN Tejido TRIZOL CALIDAD BIOANALYZER CANTIDAD
  18. 18. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICACALIDAD RNA (I): BIOANALYZER
  19. 19. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICACALIDAD RNA (II): BIOANALYZER
  20. 20. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICACALIDAD RNA (III): BIOANALYZER. Cálculo de la concentración RNA Area: 192.0 RNA Concentration: 150 ng/µl Result Flagging Color: 255 Result Flagging Label: Bad RNA quality RNA Area: 155.7 RNA Concentration: 122 ng/µl rRNA Ratio [28s / 18s]: 1.6 RNA Integrity Number (RIN): 8.5 (B.02.08) Result Flagging Color: 65280 Result Flagging Label
  21. 21. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICACALIDAD RNA (IV): BIOANALYZER. Cálculo de la concentración Not all expected ladder peaks have been found. You should try to modify peak find settings or add peaks using manual integration. Issue with ladder peak detection. Please check ladder. RNA Area: 1,653.2 RNA Concentration: 50,101 pg/µl rRNA Ratio [28s / 18s]: 1.3 RNA Integrity Number (RIN): 7.7 (B.02.08) Result Flagging Color: 65280 Result Flagging Label: Good RNA quality
  22. 22. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICABIOANALYZER Chips disponibles: RNA Agilent RNA 6000 Nano Kit Agilent RNA 6000 Pico Kit Agilent 2100 Small RNA Kit DNA Agilent DNA 1000 Kit Agilent DNA 7500 Kit Agilent DNA 12000 Kit Agilent High Sensitivity DNA Kit PROTEINAS Agilent Protein 80 Kit Agilent Protein 230 Kit High Sensitivity Protein 250 Kit CÉLULAS Agilent Cell Kit
  23. 23. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICACALIDAD RNA (III): RNA INTEGRITY NUMBER 0 ≤ RIN ≤ 10
  24. 24. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICACALIDAD RNA (IV): RNA INTEGRITY NUMBER
  25. 25. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA ?CALIDAD RNA (V): RNA INTEGRITY NUMBER ¿qué RIN es el más adecuado? ¿hasta que RIN se puede utilizar? ¿se pueden mezclar diferentes RIN? RIN 5.0 RIN 8.0
  26. 26. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICACALIDAD RNA (VI): TIPO DE MUESTRA • kits especiales extracción RNA • extracción “genes globina” • no trabajar con sangre total • HABLAR CON NOSOTROS ANTES
  27. 27. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICACANTIDAD RNA • 3’ IVT ARRAYS 200 ng / 3 µL • Exon/Gene ARRAYS 200 ng / 3 µL • NUGEN 500 pg / 5 µL • miRNA 1 µg / 8 µL
  28. 28. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICAMICROARRAYS TIPOS DE ARRAYS •Según su tecnología •Según objetivo del estudio (Affymetrix/UCTS) MATERIAL DE PARTIDA: RNA •Calidad (Bioanalyzer/RIN) •Cantidad (Kits amplificación) •EXPERIMENTO DE MICROARRAYS •Procedimiento de amplificación / detección •GeneTitan •Controles de calidad
  29. 29. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICAPROCEDIMIENTO (I) 3’IVT EXPRESS TTTTT AAAAAA IVT AAAAAA TTTTTTTRNA (150 ng) O/N cRNA (≈ 40 µg) RNA-cDNA dscDNA EXON/GENE NNNNN IVT NNNNN RNA (150 ng) O/N RNA-cDNA dscDNA cRNA ssDNA (7 µg)
  30. 30. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICAPROCEDIMIENTO (II) NUGEN NNNNN SPIA TTTTT RNA (500 pg) RNA-cDNA dscDNA ssDNA (8 µg) miRNA Biotin-labeled 3DNA ATP AAAAAA AAAAAA RNA (1 µg) Biotin-labeled RNA
  31. 31. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICAPROCEDIMIENTO (III)3’IVT EXPRESS EXON/GENE NUGEN miRNA Resequencing Fragmentación O/N
  32. 32. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
  33. 33. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICAY ESTO SOLO ACABA DE EMPEZAR… .CEL UEB
  34. 34. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICADIFERENCIAS ENTRE LOS KITS 3’ IVT Exon/Gene NUGEN Oligo dT NNN oligo dT + NNN cRNA ssDNA ssDNA 15 µg 5.5 µg 5 µg NO MEZCLAR DIFERENTES PROTOCOLOS DE AMPLIFICACIÓN EN UN MISMO PROYECTO…
  35. 35. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICAGENETITAN (I)
  36. 36. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICAGENETITAN(II) • Formato placa: 16, 24, 96 arrays
  37. 37. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICAGENETITAN(III) • Formato placa: 16, 24, 96 arrays  mayor high throughtput reducción del tiempo de procesado  disminución de costes  mayor reproducibilidad (disminución de efecto batch)  Formato cerrado (16, 24, 96)  No todos los tipos de especies, tipo de array representados
  38. 38. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICACONTROL DE CALIDAD (I)
  39. 39. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICACONTROL DE CALIDAD (II)
  40. 40. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICACONTROL DE CALIDAD (III). cRNA Puricado
  41. 41. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICACONTROL DE CALIDAD (III). cRNA Fragmentado

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