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转录组测序数据挖掘
- 6. Poly(A) select 或者 ’rRNA minus’, Why? 80% 15% 4% 1% rRNA tRNA mRNA others mRNA仅占全部RNA分子量的4%左右。有必要采取富集措 施提高其丰度，使mRNA-reads在测序结果中的比例显著增 加。
- 7. 随机打断+反转录+扩增 带来的损失 Huang R, Jaritz M, Guenzl P, et al. PLoS ONE. 2011;6:e27288 从reads在mRNA上的位置分布来看， 不论是RNA水解，还是cDNA打断，3’ 和5’端UTR均有损耗。这一类实验方 法的reads数据难以用于转录起始/终 止位置的研究…
- 8. 对应的解决方法 最后，添加新的测序接头，上机 测序 Pelechano V, Wei W, Steinmetz LM. Nature 2013, 497:127–131. 添加末端端接头+反转录扩增 合成双链+添加含生物素标记(5’) 环化双链产物+随机打断+富集含 生物素标记的片段
- 9. 链特异性测序的优势 Parkhomchuk D, Borodina T, Amstislavskiy V, Banaru M, Hallen L, et al. Nucleic Acids 2009, Res 37: e123. 链特异性测序可以很好的解决正负链overlapped- gene情况。据称，使用这一方法，约5%的基因的表 达定量将更为准确，同时对转录组的拼接也有帮 助。
- 11. 对RNA-Seq研究范围的进一步认识 转录本序列 SSR分析标记开发 基因/基因家族功能 与进化分析 系统发育分析 SNP/indel 群体进化分析 mRNA编辑分析 Gene, 多个样本 主成分分析（PCA ） 样本聚类分析 条件特异表达分 析 共表达分析 eQTL分析 Gene, 少量样本 差异表达分析 差异剪切分析 Allele, 多个样本 新的分析1？ 新的分析2？ Allele, 少量样本 Allele-specific 差异 表达分析 Allele-spedific差异 剪切分析 广 度 深度 基因表达、剪切数据 RNA-Seq
- 12. RNA-Seq用于SSR分析标记开发 Mono-nucleotide repeats 7,693 57.7% Di-nucleotide repeats 3,733 28.0% Tri-nucleotide repeats 1,538 11.5% Other repeats 363 2.8% Total repeats 13,327 100% Fu, B. & He, S. DNA research 2012,19, 131-142.
- 13. RNA-Seq用于系统发育分析 Hartmann S, Helm C, Nickel B, Meyer M, Struck TH, et al.PLoS ONE 2012, 7(1): e29843.
- 15. RNA-seq，差异表达分析 鉴定差异表达基因(e.g. DESeq)； 差异表达基因功能 (e.g. GO,KEGG pathway)富集分析；
- 16. RNA-Seq，可变剪切与差异剪切分析 Lalonde E, et al. Genome Res 2011,21(4):545–554. 上述基因的多种剪切形式(转录 本)； 一个基因(rs7911488)在两个不同的 样品中的reads mapping示意图，显 示使用了不同的外显子(存在剪切 差异)； 上述基因所有的剪切形式(转录本) 在不同样品中的相对含量出现变 化；
- 17. RNA-Seq，条件特异表达分析 狭义条件特异表达基因：只在特定的条件(e.g. 特定组织，特定时间点)下 正常表达的基因。 Schug J, Schuller WP, Kappen C, et al. Genome Biol 2005, 6: R33.
- 18. RNA-Seq，共表达分析 绿：纤维连接蛋白红：甲壳素 Zhang G, Fang X, Guo X, Li L, Luo R, et al. Nature 2012, 490: 49–54.
- 19. RNA-Seq，共表达分析 Xue Z, Huang K, Cai C, Cai L, Jiang CY, et al. Nature 2013,500: 593–597. 共表达基因模块 具有条件特异表 达性质的共表达 基因模块
- 20. RNA-Seq，样品聚类分析和主成分分析 (PCA) Xue Z, Huang K, Cai C, Cai L, Jiang CY, et al. Nature 2013,500: 593–597. 样品聚类分析 主成分分析(PCA)
- 21. RNA-Seq，eQTL分析
- 22. RNA-Seq，allele-specific expression (ASE)分析 Xue Z, Huang K, Cai C, Cai L, Jiang CY, et al. Nature 2013,500: 593–597.
- 23. RNA-Seq，allele specific splicing (ASS)分析 Montgomery SB, Sammeth M, et al. Nature 2010, 64:773-777
- 24. RNA-Seq用于群体进化分析 Varshney, R. K. et al. Nature biotechnology 2013,31, 240-246. a.遗传组成分析； b.主成分分析； c.系统发育分析；
- 25. RNA-Seq用于mRNA编辑分析 Peng Z, Cheng Y, B, Kang L, Tian Z, et al. Nature Biotechnology 2012, 30: 253–262. Ramaswami G, Lin W, Piskol R, Tan MH, Davis C, et al. Nat Methods 2012.
- 27. 关注表达量的置信区间 RSEM, eXpress, et al. 期望最大化(EM)算法 彻底排除了不确 定性； 相似程度高的基 因呈现低表达量 ； Unique-reads 有效利用好所有 数据，包括 unique-reads和 multi-reads； 引入了不确定性 ； Unique-reads Multi-reads
- 29. Novel transcripts的差异表达 Reads alignment1 Reference gene.gff Novel transcripts1.gff Reads counts1 of genes Reads alignment2 Reads counts2 of genes Novel transcripts2.gff Different expressed genes Old pipeline
- 30. Novel transcripts的差异表达 Reads alignment1 Reads alignment2 Reference gene.gff transcripts1.gff transcripts2.gff Novel transcripts.gff Reads alignment1 Reference gene.gff + Novel transcripts.g ff Reads counts1 of genes Reads alignment2 Reads counts2 of genes Different expressed genes New pipeline
- 31. 总结 RNA-Seq是运用高通量测序技术，对生物样本中的全部mRNA进行测序 +研究的过程，它包括实验(包括实验设计、取样)和信息分析两部分内 容。 RNA-Seq实验技术正持续发展。理解不同RNA-Seq实验技术的优缺点， 至少可以让我们明确特定RNA-Seq实验对于信息分析的影响。 RNA-Seq在基因表达研究中应用最广，研究不断深入(e.g. gene 到 allele)，研究广度不断拓展(e.g. 少量样品 到 大规模样本)上；而另一方 面，RNA-Seq也胜任于SSR标记开发、系统发育分析、群体进化分析、 mRNA编辑等多项其他研究。 关注表达量置信区间和novel transcripts的差异分析，两个例子，说明 我们更加准确、全面的RNA-Seq分析服务。
- 32. 谢谢！
- 34. Q：蚕的变态发育研究 细分成几个发育阶段？ 每个阶段取几个重复？ 每个重复测多少reads？
- 38. 1. 用户错误：如贴错标签。 2. 样品降解：如组织自溶，FFPE样品的交联。 3. 异源序列污染：如宿主。 4. DNA起始量低：会在PCR过程中产生更多的假突变 (GA)。 NGS中的实验误差：样品制备
- 39. 1. 用户错误：如样品残留。 2. PCR扩增错误：同前面第4点。 3. 引物偏向：如甲基化、错配、二级结构与熔解温度。 4. 3’端捕获偏向：poly(A)富集时。 5. 私有突变：如在重复区域或私有变异上引导错误。 6. 机器故障。 7. 嵌合reads。 8. 条形码和/或接头错误。 NGS中的实验误差：文库制备
- 40. 1. 用户错误：如流动槽过载引起的簇crosstalk。 2. 移相：如延伸过快或过慢。 3. “Dead”荧光团：受损核苷酸以及重叠信号。 4. 序列背景：如富含GC，低复杂度区域，及同聚物。 5. 机器故障：如激光器、硬盘、软件和流体系统。 6. 链的偏向。 NGS中的实验误差：测序成像
- 44. 转录组的复杂性 最简单情形：One Genome => Gene 1 copy => Single mRNA
- 50. 参考序列： 基因组 and/or 转录组 Can I use ______ as a reference? a different accession a different species in same genus a different species in same family 有无参考序列 使用Arabidopsis thaliana col. 作为参 考序列的reads mapping结果
- 52. How deep is deep enough？ 对人B-cell的一项研究称： 精确测量所有表达转录本，需要~500M reads；精确测量绝大多数转 录本，需要~100M reads（SE50）。 对大肠杆菌的一项研究表明，上述两个值为50M 和10M（76-101 PE）。 不过由于尚未达成转录组分析的金标准，对具体数值的确定仍存在争议。 Toung JM, Morley M, Li M, Cheung VG. Genome Res. 2011 Jun;21(6):991-8 Haas et al. BMC Genomics 2012 13:734.
- 53. 测序饱和现象
- 54. more sequence？ 对于测序深度来说，单位功效的成本在测序深度达到某个数 值D0后开始升高，即边际收益递减。 基因的差异表达研究: 哺乳动物的D0为~10M SE50 reads； 转录本的差异表达研究: 相应的D0为~30M SE50 reads； 差异可变剪接分析: 可能需要>400M的PE100 reads。
- 55. 随机化Randomization materials & order（required by random variable(s)） 重复Replication error estimate & more accurate parameter repeated measure differs from replication. 区组化Blocking（control(s)的推广） Reduce or eliminate variation introduced by nuisance factors. 实验设计三大统计学原则
- 57. 生物学差异是基因表达自身的特性，与检测技术的选择以及数据处理的方式无关。 Sequencing technology does not eliminate biological variability. Kasper D Hansen, Zhijin Wu, Rafael A Irizarry & Jeffrey T Leek. Nat Biotechnol., 2011. 29(7): 572–573 测序技术不能消除生物学差异
- 58. 从方差分解看重复的意义 Var(Expr) = Across Group Variability + Measurement Error + Biological Variability Var(Expr) : 表达的变异程度 Across Group Variability ：case(s)-control之间的差异 Measurement Error ：技术先进性、平台稳定性问题，技术重复 Biological Variability ：样本间差异、个体差异，生物学重复
- 59. 重复的意义 增加样本对研究对象空间的代表性 减少目标属性度量的误差 以增强结论的可靠性和适用范围 reproducibility研究结果的可再现性 repeatability研究过程的可重复性
- 66. 偏倚的度量和纠正 对测序数据进行测序偏倚的度量和校正是值得尝试的工作 seqbias from R/Bioconductor, Jones DC et al. 2012
- 69. 必不可少的步骤 目前还没有关于分析金标准的一致看法，典型的分析流程至少包含以下 步骤： mapping of the reads 【mismatch】 summarization of the reads per adopted gene model【multi-reads】 normalization【reads counts, FPKM, TPM，percellome】 testing for differential expression【GFOLD，edgeR，NOIseq】 eventually, system biological analysis(GO, pathway, network etc.)
- 71. 先验知识的影响 根据先验知识排除一些假阴假阳性，再次分析并进行两个结果的比较 如果先验知识争议较大，而对结果影响较小，则结果较有意义； 如果先验知识确信无疑，而对结果影响较大，则选择再次分析的结果。
- 72. Thank You ！
Editor's Notes
- RNA‐Seq is a general term to describe the process of high‐throughput sequencing of all messenger RNA (the ”transcriptome”) present in a specific condition.
- http://www.nature.com/ni/journal/v13/n9/fig_tab/ni.2407_F1.html
- 理解RNA-Seq实验，有助于我们了解不同的实验方法对于分析的影响，进而依据自身的研究目的，选择最佳的实验手段；在我个人理解，RNA-Seq在向着两个方向持续地发展：1.让我们能够高效地、有选择性地获取特定信息；2.使得我们获得的信息尽可能地准确和全面。
- 对应第一个发展方向：让我们能够高效地、有选择性地获取特定信息；
- 对应第二个发展方向：使得我们获得的信息尽可能地准确和全面。
- 对应第二个发展方向：使得我们获得的信息尽可能地准确和全面。另有一个重要的关注点，PCR反应的偏向性，即不同GC含量，不同长度的DNA分子在PCR反应过程中，扩增效率不一致。这显然会导致鉴定出的基因表达量出现偏差，进而影响差异表达基因鉴定及下游的诸多分析。早在2010年，一篇naturemethods文章已经实现了免扩增+链特异性RNA-Seq测序。时间有限，这里不作详细探讨。
- 如果群体可以合理的分为不同的亚群体，可以进行位点选择分析，鉴定收到特定选择作用的位点。