1. Disediakan oleh;
Norhafilda Binti Ismail (P48549)
Penyelia Utama;
Dr. Md. Sharom Md. Yusof
The 12th
Postgraduate Colloquium (4-5 July 2012)
Fakulti Sains & Teknologi, Universiti Kebangsaan Malaysia

2. PENGENALAN;
Jamu Ratus
• Jamu Ratus merupakan ubatan tradisional poliherba
daripada tumbuhan yang digunakan oleh masyarakat
Melayu dalam rawatan pos-partum untuk ibu selepas
bersalin.
• Servei farmakognosi (Yusof , 1992) terhadap juzuk
herba mengesahkan kehadiran pelbagai komponen
bioaktif dalam Jamu Ratus seperti komponen fenolik
asid , terpenoid (lipofilik) , alkaloid dan flavonoid
(bersifat berkhutub ) seperti kaempferol dan quersetin

3. Kerentanan neonat susuan
terhadap cabaran xenobiotik
• Penggunaan Jamu Ratus dalam rawatan post partum yang
meluas dan pengawalaturan yang kurang berkesan di Malaysia
boleh menimbulkan risiko terhadap bayi susuan sekiranya
komponen Jamu Ratus berupaya terserap ke dalam susu.
• Pada peringkat awal hayatnya, fungsi metabolisme neonat
susuan masih belum mencapai tahap kematangan yang boleh
menjurus kepada ketoksikan aruhan xenobiotik.

4. • Kerentanan neonat susuan terhadap perlakuan xenobiotik
adalah diakibatkan oleh enzim –enzim hepar dan usus yang
berperanan dalam proses penyahaktifan komponen toksik
(Parke 1984) seperti sitokrom P450 dan sistem sawar darah
otak neonat juga belum berkembang dengan baik ketika awal
hayat.
• Ini menyebabkan ketelapan sistem sawar otak yang tinggi
untuk membenarkan penyerapan masuk dadah ke dalam otak
yang seterusnya mungkin menjejaskan perkembangan otak
terutama dari segi fungsi kongnitif neonat tanpa menunjukkan
kesan ketoksikan yang ketara.

5. Objektif Kajian;
• Mencirikan komponen Jamu Ratus (JEC)
berupaya terserap susu tikus berlaktasi dan otak
neonat susuan dengan menggunakan analisis
kromatografi lapisan nipis (KLN) dan
kromatografi cecair spektrometri jisim (LC-MS)

6. Metodologi
• JEC (Jamu Ratus Ekstrak Kloform fraksi etanol )
diekstrakkan dengan kaedah pengestrakan pelarut
terubahsuai Harbone (1967)
Perlakuan JEC terhadap 4 kumpulan berbeza
tikus berlaktasi dan neonat susuan (dos relatif
terapi perlakuan JEC)
(9 hari tempoh perlakuan JEC)
0x
(kawalan)
3x
(150mg/kg/hari)
10x
(900mg/kg/hari)
30x
(1500mg/kg/hari)

7. Cont…
• Persampelan tisu tikus berlaktasi dan otak susu neonat
susuan (hari ke-3, hari ke-5 dan ke-9 tempoh perlakuan
JEC)
• Kaedah pengestrakan lipid tisu sampel bagi
mendapatkan fasa akuas & organik ( Folch et. al 1957)
• Analisis Kromatografi lapisan nipis (KLN) dan seterusnya
analisis LC-MS (Fang et. al 2007 )

8. Analisis kromatografi
lapisan nipis (KLN)
Kromatogram JEC piawai ,fraksi akuas ekstrak hati (a) dan otak (b) neonat susuan
haiwan perlakuan dos relatif terapi JEC rendah (150mg/kg/hari) dengan pengesanan
sistem pelarut kloroform: asid asetik (9:1) di bawah cahaya ultralembayung 365nm .
(kajian kronik)
0.68
0.28
0.85
(a) (b)

9. Analisis kromatografi
lapisan nipis (KLN)
Kromatogram JEC piawai ,fraksi akuas ekstrak susu(a) dan hati(b) tikus berlaktasi
haiwan perlakuan dos relatif terapi JEC dengan pengesanan sistem pelarut
kloroform: asid asetik (9:1) di bawah cahaya ultralembayung 365nm .(kajian kronik)
0.85
0.68
0.68
0.28

10. Pengesanan kehadiran kaempferol dengan
analisis KLN
Kromatogram JEC piawai, Quercetin
piawai ,Rutin Piawai dan Kaempferol
piawai dengan pengesanan di bawah
cahaya nampak (Rf 0.86)
-dengan sistem pelarut yang sama
(kloroform : asid asetik (9:1))

12. Analisis LC-MS
Kaempferol
(Fasa Akuas Otak
Neonat susuan
Dos Relatif Terapi JEC
(150mg/kg/hari)
+Kaempferol)
JEC
(Fasa Akuas Otak Neonat
Dos Relatif Terapi JEC
(150mg/kg/hari)
(Fasa Akuas Otak Neonat
Kawalan (omg.kg/hari)

13. Analisis LC-MS
Kaempferol
(Fasa Akuas susu
Kawalan (omg.kg/hari)
(Fasa Akuas susu
Dos Relatif Terapi
(150mg.kg/hari)
(Fasa Akuas susu
Dos Relatif Terapi
(150mg.kg/hari +
Kaempferol)

14. Analisis LC-MS/TOF bagi sampel otak akuas neonat hari ke-5 dan diikuti
piawaian dalaman kaempferol
Bilangan
puncak analisis LC-MS/TOF
(jalur unik yang tiada pada
sampel kawalan)
Sampel JEC (1mg/ml) Sampel Kaempferol (1mg/ml) Sampel otak kawalan Sampel otak neonat akuas hari ke-5 (3x) Sampel otak neonat akuas hari ke-5
(3x)+ 100ul Kaempferol
Masa pemisahan, Rt
(min)
Jisim molekul
(max m/z)
Masa pemisahan, Rt
(min)
Jisim molekul
(max m/z)
Masa
Pemisahan,RT (min)
Jisim molekul
(max m/z)
Masa pemisahan, Rt
(min)
Jisim molekul
(max m/z)
Masa pemisahan,
Rt (min)
Jisim molekul
(max m/z)
JEC (1mg/ml) 25
7.7 222.1086 14.1 298.0963 14.9 188.0716
8.3 222.1181 16.5 260.1856 22.1 233.0785 14.7 188.0721
19.5 436.1187 20.5 475.3251 23.9 475.3237
Kaempferol (1mg/ml) 2 19.7 436.1187 21.0 251.1259 25.0 449.0979 21.9 233.0740
22.0 273.0347 22.7 701.4938 25.4 245.0783 22.3 227.1058
23.2 457.1537 24.9 449.1094 23.3 243.0888 26.0 255.1665 22.6 340.2595
Otak neonat akuas h5
(3x)
20 24.0 387.0635 25.2 449.1067 23.9 927.6598 26.7 285.2889 24.9 449.0979
25.2 245.0808 24.4 251.1264 27.6 286.1435 25.2 245.0735
Quercetin 1 26.2 351.1561 31.1 287.0561 25.4 245.0798 28.0 381.1320 26.3 285.1460
26.6 209.1146 26.0 313.1775 28.1 337.1062 27.4 286.1450
26.8 497.1917 26.4 214.2536 29.2 365.1376 28.0 381.1287
27.4 286.1405 26.8 288.2896 29.6 365.1381 29.0 365.1286
27.7 286.1405 27.1 244.2636 29.4 365.1286
28.0 161.0616 27.3 288.2896 31.1 287.0481
29.1 421.2291 27.6 244.2637 32.3 350.2081
29.3 303.0494 27.9 437.1977 32.6 256.2579
29.8 439.2933 28.4 243.1364 33.2 383.2144
30.1 295.1831 28.8 316.3209 34.1 393.2901
30.9 321.2401 29.1 331.1896 37.4 360.3248
31.0 801.6751 29.4 259.1670
34.0 393.2983

15. Perbincangan…
• ANALISIS KROMATOGRAFI LAPISAN NIPIS
(KLN)
1) Pengesanan kehadiran komponen berpendafluor terserap JEC dengan
-nilai elusi Rf 0.28 (warna biru),
-nilai elusi Rf 0.68 dan Rf 0.85 (hijau)
masing-masing yang ketara dan konsisten dalam hampir kebanyakan kromatogram sampel tisu terserap
komponen JEC fasa akuas (susu, hati, otak neonat) kajian akut mahupun kronik dalam haiwan
perlakuan JEC bagi analisis (KLN) yang menyamai profil JEC rujukan dan tiada pada haiwan kawalan.
2) Ini mengambarkan komponen JEC asal berupaya menelapi sistem sawar darah
otak neonat, hati serta tisu susu tikus berlaktasi tanpa mengalami proses
biotransformasi berdasarkan warna dan nilai elusi Rf yang terhasil menyamai
profil JEC rujukan.

16. • Analisis KLN mendapati komponen kaempferol bukan
merupakan komponen sama yang berpendafluor
berwarna hijau (Rf 0.68, Rf 0.86, Rf 0.97) atau biru (Rf
0.28) yang terhasil pada kromatogram tisu sampel susu,
hati, otak neonat susuan serta profil JEC rujukan di
bawah pengesanan cahaya ultralembayung (366nm)
dengan sistem pelarut kloroform: asid asetik (9:1).
• Komponen kaemferol hanya dikesan kehadirannya di
bawah cahaya nampak dengan nilai elusi Rf 0.86
dengan sistem pelarut yang sama.

17. • Komponen kaempferol dikesan sebagai salah satu komponen JEC terserap
ke dalam tisu neonat susuan melalui susu tikus berlaktasi dan berupaya
menelapi sistem sawar darah otak neonat susuan menerusi analisis LCMS
yang lebih jitu dan sensitif.
• Pencirian secara kuantitatif komponen JEC bagi kajian sub-akut dan kronik
mendapati komponen kaempferol berupaya terserap dalam tisu setelah
disahkan hadir dengan kaedah penambahan piawaian dalaman kaempferol
(0.1µg/ml) dalam sampel otak dan susu neonat susuan perlakuan JEC dos
(150mg/kg/hari dan 1500mg/kg/hari) relatif terapi dengan analisis yang lebih
sensitif iaitu LC-MS.
Analisis Kromatografi Cecair Spektrometri
Jisim (LC-MS)

18. • Analisis LC-MS telah dilakukan menggunakan;
1) sampel susu tikus = dos perlakuan JEC (1500mg/kg/hari) iaitu 30x
dos relatif terapi JEC
-sejumlah 17 puncak -tiada pada sampel haiwan kawalan.
-15 puncak unik ≠ profil JEC (perbezaan nilai elusi RT)
-2 puncak lain = profil JEC.
2) Analisis = tisu otak neonat (150mg/kg/hari) iaitu 3x dos
relatif JEC terapi pada hari kelima perlakuan JEC
-16 puncak jumlah
-12 puncak unik terhasil (tiada pada kawalan dan profil JEC)
berkemungkinan produk metabolit sekunder JEC
-2 puncak = profil JEC.
-dipersamaan nilai Rt (24.9min) =dengan profil kaempferol piawai.
Kajian
Kronik

19. • Seterusnya, pengesanan kaempferol secara kuantitatif;
- inkorporasi piawaian dalaman kaempferol (0.1mg/ml) ke dalam (n=3)
sampel tisu otak neonat susuan dos terapi JEC yang rendah
(150mg/kg/hari) yang diuji.
• Analisis kuantitatif mendapati komponen kaempferol dikesan hadir
dengan anggaran
-0.6µg dalam setiap tisu otak neonat susuan yang turut mempunyai
persamaan nilai nisbah jisim molekul per cas ion (287.1) dengan nilai
jisim /cas ion (287. 0561 dan 449.1094 max. m/z) pada profil kaempferol
piawai.

20. 1) Analisis LC-MS, untuk sampel susu tikus (150mg/kg/hari) iaitu dos rendah
-sejumlah 30 puncak terhasil
• -24 daripadanya adalah puncak unik (mungkin merupakan produk metabolit sekunder JEC
• -6 puncak lain = profil JEC.
2) Analisis terhadap tisu otak neonat (150mg/kg/hari)
• -sejumlah 24 puncak terhasil
• -mendapati hanya 17 puncak unik tiada pada profil JEC
• 7 puncak lain = profil JEC.
3) Ujian kuantitatif pencirian komponen JEC terserap tisu
• - sampel otak tikus (n=6) dos relatif terapi (150mg/kg/hari), dan mendapati puncak terhasil
mempunyai kesamaan dengan nilai RT (13.2 dan 13.0min) dan jisim molekul (287.1) dengan
profil kaempferol piawai setelah masa elusi diperpanjangkan selama 32 minit.
• ≈1.2957 X 10-4
µg kaempferol hadir dalam (6n) sampel iaitu dianggarkan hadir sebanyak 2.2 x
10-5
µg dalam setiap sampel.
.
Kajian Sub Akut

21. Kesimpulan;;
• Kaempferol berupaya menelapi sistem sawar otak neonat walaupun
daripada dos perlakuan JEC ibu yang amat rendah (150mg/kg/hari) .
• Puncak unik lain yang berjaya dikesan mengimplikasikan bahawa
kemungkinan majoriti komponen JEC terserap yang lain merupakan
produk metabolit sekunder dadah yang mengalami proses
biotransformasi di hepar tikus haiwan kajian berdasarkan perbezaan
nilai RT (min) terhasil yang tiada pada profil JEC rujukan dan haiwan
kawalan.
• .Menerusi servei farmakognisis Jamu Ratus, kaempferol didapati
merupakan konstitusi Alpinia sp. iaitu salah satu komponen dalam
juzuk herba terlibat.

22. • Ini memberikan gambaran kesan ketoksikan yang mungkin berlaku
terhadap neonat susuan sekiranya diberikan pendedahan dos terapi
relatif dadah yang berterusan berikutan proses metabolisma
xenobiotik dan sistem sawar darah otak neonat sepertimana
diketahui umum adalah belum matang di peringkat awal hayatnya.
• Justeru, kajian lanjutan berterusan terhadap pengenalpastian
komponen JEC lain terserap tisu dan kesan farmakokinetiknya
terhadap sistem biokimia neonat susuan dengan lebih mendalam
perlu dijalankan.

23. Rujukan
• Fang F., Jing-Ming L., Qui-Hong P., & Wei Dong H. 2007. Analytical, Nutritional and
Clinical Methods: Determination of red wine flavonoids by HPLC effet of aging. Food
Chemistry. 101: 428-433.
• Folch, J., Lees, M. & Sloane Stanley, G. H. 1957. A simple method for the isolation and
purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226, 497-509.
• Harborne, J. B. 1989. Methods in Plant Biochemistry. London : Academic Press Limited
• Parke, D. V. 1984. The biochemistry of foreign compunds. New York: PergamonPress.
• Yusof, S. 1992. The Bochemical and Toxicological Effects Of Jamu Ratus in Rats and Mice.
Phd. Thesis submitted to the University of London.