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PCR Cuantitativa

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PCR en Tiempo Real. Real Time PCR

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  1. 1. www.aleidavillaespinosa.com Dra. A. Villa Espinosa PCR La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ha sido la técnica más revolucionaria de la biotecnología en los últimos 28 años y se ha convertido en una importante plataforma analítica en la biología molecular. La PCR se extendió rápidamente a miles de laboratorios, de investigación básica, y de diagnóstico clínico ya que permitió producir in vitro grandes cantidades de una secuencia de ADN concreta, y la amplificación selectiva de cualquier segmento de ADN, conociendo las secuencias que lo flanquean. Esta técnica permite amplificar" pequeñas cantidades de ADN entre cientos de miles y millones de veces. Kary Banks Mullis 67 años Bioquímico. Científico de Cetus Premio Nobel de Química 1993 Lenoir, Carolina del norte, Estado Unidos, Conocido por la invención de la técnica PCR para amplificar secuencias de ADN en 1985 La PCR es una técnica que consigue encontrar la aguja en el pajar, al tiempo que produce un pajar de agujas por amplificación selectiva".
  2. 2. www.aleidavillaespinosa.com También en 1985, Cetus se asoció con la corporación Perkin-Elmer e introdujo la DNA Termal Cycler. En 1989, Cetus anunció acuerda colaborar con Hoffman-LaRoche en el desarrollo y la comercialización de productos de diagnóstico humanos in vitro y de servicios basados en tecnología de PCR. En 1990, los científicos alcanzan la primera amplificación y detección simultánea de las secuencias específicas de DNA usando un colorante fluorescente, creando los principios de la PCR en tiempo real o PCR "cinético" y en 1991 Hoffmann-La Roche Inc. adquiere los derechos y las patentes mundiales de la PCR. Una de las características más atractivas de la PCR es que la cantidad y calidad de las muestras de DNA sujeta a amplificación no necesitan ser alta. Una sola célula o un lisado celular crudo o especímenes con una longitud promedio de unos pocos cientos de pares de bases son usualmente adecuadas para una amplificación exitosa. El criterio esencial es que la muestra contenga al menos una cadena de DNA intacta que abarque la región que va a ser amplificada y que las impurezas sean suficientemente diluidas como para no inhibir la polimerización. PCR EN TIEMPO REAL O PCR CUANTITATIVA La PCR cuantitativa (en inglés, quantitative polymerase chain reaction; qPCR o PCR en tiempo real (en inglés real time PCR; RT-qPCR o RT-Q-PCR) es una variante de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación del los ácidos nucleícos Para ello emplea, del mismo modo que la PCR convencional, un molde de ADN, al menos un par de cebadores específicos dNTPs, un tampón de reacción adecuado y una ADN polimerasa termoestable; a dicha mezcla se le adiciona una sonda marcada con un fluoróforo que, en un termociclador con sensores para medir fluorescencia, y capaz de excitar el fluoróforo a la longitud de onda apropiada, permitirá medir la tasa de generación de uno o más productos específicos. Dicha medición, se realiza luego de cada ciclo de amplificación y es por esto que también se le denomina PCR EN TIEMPO REAL, es decir, PCR inmediata, simultánea. En muchos casos el molde que se emplea para la PCR cuantitativa no es desde el principio ADN, sino que puede ser ADN complementario (cADN), de hebra simple, obtenido por retrotranscripción del ácido ribonucleico (ARN); en este caso, la técnica es una RT-PCR cuantitativa o en tiempo real, o RT-qPCR. (RT-PCR, del inglés reverse transcriptase PCR). Con esta técnica se consigue alta precisión y exactitud. También hay la posibilidad de PCR múltiplex. No requiere de análisis posterior a la PCR (electroforesis, etc.), lo que reduce la posibilidad de contaminación eliminando
  3. 3. www.aleidavillaespinosa.com así fuentes potenciales de error. Se puede realizar un mayor número de reacciones por día, pero el diseño de primers y sondas es más exigente. El ciclo en el cual cantidad de producto de PCR es detectada o alcanza un umbral preestablecido se denomina Cq La cuantificación relativa puede determinarse en comparando el valor Cq del control de cuantificación, el valor de los controles internos, con el de las muestras desconocidas. La cantidad de gDNA y cDNA en las muestras, se puede evaluar con un grado razonable de exactitud usando un buen control de cuantificación. Aunque la determinación de la cantidad relativa es ampliamente aceptada como un medio fiable de medir las diferencias entre las muestras, la qPCR tiene la ventaja de determinar el número absoluto de copias de una diana determinada. El método para la cuantificación absoluta se basa en la construcción de una curva estándar y precisa empleando concentraciones conocidas de controles externos. Para determinar el número de copias absolutas que requiere el control de cuantificación, la cantidad conocida ha de ser evaluada varias veces en el mismo ensayo. Los valores Cq obtenidos de las diluciones pueden ser utilizados para generar una curva estándar a partir de la cual la cantidad de DNA o RNA en las muestras desconocidas pueden ser calculados. Se requieren varios experimentos intra ensayos e inter ensayos para determinar los coeficientes de variación y el patrón estadístico. El uso de controles negativos y positivo de cuantificación, no excluye la necesidad de controles de referencias endógenos apropiados, que supervisen los aspectos de la preparación de la muestra, tales como el aislamiento de DNA y RNA y eficiencia de la RT. La incorporación de fluoróforos útiles para los sistemas de detección en tiempo real, el desarrollo de instrumentos PCR que permiten la detección cinética del producto acumulado, le ha proporcionando a la qPCR una mayor sensibilidad en comparación con las PCR convencionales a tiempo final.
  4. 4. www.aleidavillaespinosa.com La qPCR requiere el diseño de primer y sondas específicas que produzcan amplificaciones de alta eficiencia: la eficiencia de la amplificación puede determinarse E % = (10 (-- 1 / pendiente) -- 1) × 100 %, utilizando la pendiente de una curva estándar (Cq versus log número de copias). Una eficiencia de 100%, es definida por una pendiente de -3,32. Normalmente hay que utilizar pares de primers que generen curvas de calibración con pendientes entre -2,92 y -3,92 (Eficiencia = 100 ± 10%) Y un coeficiente de correlación R 2 cercano a 1. La eficiencia de la qPCR se puede ver afectada por la complejidad del material de partida que se amplifica. Esto incluye tanto la cantidad, como la composición del fondo de ADN. PCR en tiempo real se inhibe a altas concentraciones de fondo gDNA y / o en presencia de largas hebras de ADN estructuralmente complejas. Los plots de disociación se generan lentamente al final de la qPCR, por el aumento de la temperatura de reacción y la disminución de la fluorescencia. La disociación debe constar de un solo pico para indicar un solo producto, y el pico de la curva debe corresponder a la temperatura de fusión esperada para el amplicón. La fluorescencia que se produce es específica a la amplificación que estemos estudiando, aunque se usen varios fluoróforos en la misma reacción para detectar varios DNA o RNA al mismo tiempo. Campo de aplicaciones de la PCR - Permite muchos estudios de expresión génica - Secuenciación directa de secuencias amplificadas - Análisis de expresión diferencial de mRNA - Detección de mutaciones - Marcadores cuantitativos de cáncer - Seguimiento de la efectividad de tratamiento de enfermedades - Diagnósticos de enfermedades genéticas - Diagnósticos de enfermedades infecciosas - Cuantificación y genotipado de patógenos - Cuantificación de carga microbiana alimentos o en material vegetal, - La detección de OGM (organismos genéticamente modificados) - Calidad alimentaria y pureza de origen - Medio ambiente aguas residuales y profundas, aire, suelos, vectores - En ciencia forense: identificación de restos biológicos, - Determinación de paternidad, - Pruebas periciales en criminalística - En arqueología y paleontología - Museos - Agricultura, sanidad animal - etc

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