2. Сверху: строение фотосинтетических
мембран цианобактерии
Synechocystis sp. PCC6803. PC –
фикоцианин, APC –
аллофикоцианин, D1, D2, – белки
комплекса ФС2, OCP – orange
carotenoid protein.
В центре: схематическое
представление структуры тримеров
аллофикоцианина по данным
рентгеноструктурного анализа.
Показано расположение
хромофоров и элементы вторичной
структуры.
Снизу: химическое строение
хромофора - фикоцианобилина.
Пиррольные кольца пронумерованы
от A до D.
Уровни организации фикобилипротеинов
7. -250 -200 -150 -100 -50 0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200
Temperature (K)
Fluorescencelifetime(ps)
Temperature (°C)
APC
PE
PC
0 50 100 150 200 250 300
Аномальная температурная зависимость
времени жизни флуоресценции
фикобилипротеинов
Температурная зависимость фикобилипротеинов,
аллофикоцианин (APC, красная кривая),фикоэритрин (PE
,черная кривая), фикоцианин (PC, синяя кривая).
8. Аномальная температурная зависимость
времени жизни флуоресценции
аллофикоцианина с D2O
-200 -150 -100 -50 0 50
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
2500
Fluorescencelifetime(ps)
Temperature (°С)
D2
O
H2
O ps
Медленное замораживание аллофикоцианина в
воде (красная кривая) и в дейтерированной воде
(черная кривая)
12. Измерение размера частиц фикоэритрина
10 100 1000
0
5
10
15
20
25
30
Числочастицданногоразмера,%
Гидродинамический диаметр, нм
pH=7.0
pH=3.0
pH=2.3
М
Т
А
А
Зависимость числа частиц фикоэритрина одного размера в % от
гидродинамического диаметра, нм, при различных рН раствора.
М-мономер, Т-тример, А-агрегаты
12
15. -200 -150 -100 -50 0 50
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
APC, slow, ex 635 nm
APC, slow, ex 405 nm
Fluorescencelifetime(ps)
Temperature, °C
123
Среднее время жизни флуоресценции аллофикоцианина при медленном
замораживании . Красная кривая возбуждение 635нм (красный лазер), синяя
кривая 405нм (синий лазер).
Аномальная температурная зависимость
времени жизни флуоресценции
аллофикоцианина
16. Фотоизомеризация фикоэритрцианина
Marius Schmidt,§ Anamika Patel, Yi Zhao and Wolfgang Reuter, Structural Basis for the
Photochemistry of R-Phycoerythrocyanin, Biochemistry 2007, 46, 416-423
Изменение конформации хромофора
приводит к изменению спектральных
характеристик.
18. Выводы
1. Аномальные температурные зависимости времени жизни
флуоресценции характерны для всех типов
фикобилипротеинов и зависят от наличия воды.
2. Визуализация эквипотенциальных поверхностей фикоэритрина
показала, что мономеры в тримере удерживаются за счет
специфических электростатических взаимодействий.
3. Изменение конформации белка приводит к изменению
конформации флуорофора, что можно оценить по
сокращению времен жизни и квантового выхода.
4. Фикобилипротеины являются удобным модельным объектом
для изучения донорно-акцепторных механизмов миграции
энергии.
18
Функцию дополнительного светосборщика у цианобактерий выполняют фикобилисомы, которые представляют собой внемембранные водорастворимые комплексы.
Фикобилисомы состоят из фикобилипротеинов. РЕ, РС, АРС. Молекулы всех фикобилипротеинов состоят из α и β полипептидных субъединиц – мономеров, которые объединены в тримеры, хромофорные группы, фикобилины, пришиты ковалентно через цистеин.
Фикобилины относятся к незамкнутым или линейным тетрапирролам, в основе химического строения которых лежат четыре пиррольных кольца, соединенных тремя моноуглеродными мостиками, обозначаемыми как α-, β- и γ-мостики.
Исследования температурных зависимостей проводились на кафедре. В ходе этих исследования было установлено, что при быстром замораживании времена жизни флуоресценции аллофикоцианина плавно увеличиваются, при медленном – наоборот, наблюдается резкое сокращение времен жизни флуоресценции. Данная аномалия при понижении температуры объясняется тем, что при быстром замораживании образуются мелкие кристаллы льда, которые не оказывают влияния на конформацию белка, а при медленном замораживании образуются большие кристаллы льда, которые вызывают изменение конформации белка, а следовательно и хромофорной группы. При понижении температуры до температуры жидкого азота времена жизни флуоресценции увеличиваются это объясняется вырождением колебательных уровней. Данная проблема является интересной и не до конца изученной. Дальнейшие исследования этой проблемы нашли отражение в данной дипломной работе.
Измерения проводились методом счета фотонов. Суть этого метода заключается в том, что в качестве источника возбуждения объекта был использован синий пикосекундный лазер с длиной волны 405нм, далее с помощью многоканального детектора регистрировались отдельные фотоны флуоресцеции образца, сигнал накапливался и составлялась гистограмма, огибающая, которой является кинетикой затухания флуоресценции. Кинетики аппроксимировались суммой 2х экспонент и мы получали среднее время затухания флуоресценции.
Образец также замораживался несколькими способами. Для исследования точки фазового перехода при 0С, сотрудниками кафедры была разработана и сконструирована термостатируемая ячейка с элементом Пельтье таким образом, образец исследовался в области температур от 25С до -20С. При этом скорость замораживания была 15 градусов в минуту (быстрая заморозка) и 0,5 градуса в минуту медленное замораживание.
Глубокое замораживание осуществлялось жидким азотом 77К
Установлено, что при быстром замораживании длительность флуоресценции (а полуширина спектра сокращается) аллофикоцианина плавно увеличивается, при медленном – наоборот, наблюдается резкое сокращение длительности флуоресценции аллофикоцианина (сопровождающееся резким увеличение полуширины спектра флуоресценции).
Установлено, что при быстром замораживании длительность флуоресценции (а полуширина спектра сокращается) аллофикоцианина плавно увеличивается, при медленном – наоборот, наблюдается резкое сокращение длительности флуоресценции аллофикоцианина (сопровождающееся резким увеличение полуширины спектра флуоресценции).
Установлено, что при быстром замораживании длительность флуоресценции (а полуширина спектра сокращается) аллофикоцианина плавно увеличивается, при медленном – наоборот, наблюдается резкое сокращение длительности флуоресценции аллофикоцианина (сопровождающееся резким увеличение полуширины спектра флуоресценции).
Различие в спектрах кругового дихроизма говорит о конформационных изменениях фикоэритрина. Их можно объяснить экситонной теорией Тиноко, по которой происходит экситонное расщепление уровней при переходе от мономера к тримеру. Вероятно, при рН 2,3 происходит переход от тримера к мономеру, при этом увеличивается расстояние между хромофорами и прекращается диполь-дипольное взаимодействие, что отражается на структуре спектра КД, в котором у мономера отсутствуют пики при 533нм и 562нм, а наблюдается только широкий пик при 552нм. То есть:
Чтобы подтвердить, наше предположение использовали метод динамического светорассеяния. он используется для измерения размеров наночастиц, в частности, для измерения размеров макромолекул в водных растворах. В результате измерений мы получили, что при рН 7 размер равен 43,82 нм. При рН=3 мы видим 2 пика, которые соответствуют размерам 28 нм и 68,06 нм. Мы предположили, что при таком рН в образце присутствуют как мономерные, так и тримерные формы Основной пик 68 нм соответствует тримерному состоянию, а 28,21 нм, соответственно, мономерному. При дальнейшем снижении рН (рН=2), молекулы фикоэритрина начинают агрегировать, образуя комплексы размером 164,2 нм. Так же при изменении рН в щелочную область наблюдается тенденция к увеличению размера. Эти результаты согласуются с результатами КД. Взаимодейсвие между мономерами в тримере осуществляется за счет электростатических, гидрофобных/гидрофильных взаимодействий, а так же специальные взаимодействия при физиологических рН. Для этого использовав метод многочастичной броуновской динамики в применении к визуализации эквипотенциальных поверхностей белков. Были визуализированы эквипотенциальные поверхности.
Полученные эффекты объясняются расстоянием между хромофорными группами, увеличение расстояния при кислых рН между хромофорными группами приводит к снижению их взаимодействия и приводит к расщеплению уровней . Происходит экситонное расщепление колебательных подуровней. Как известно из литературных данных при рН 7, фикоэритрин находится в тримерном состоянии. При экстремальных значениях рН возможен переход тример-мономер. Для того чтобы подробнее изучить этот переход из одной формы в другую использовался метод динамического светорассеяния
Сравнивая эквипотенциальные поверхности аллофикоцианина в мономерной и тримерной формах.
При рН=7 белок отрицательно заряжен, это согласуется с литературными данными.
При рН=4 отрицательно заряженными становятся аминокислоты белка и кофакторы, таким образом увеличивается суммарный отрицательный заряд, который локализуется в основном на стыках между субъединицами. Общий заряд белка становится положительным.
При рН =2 эквипотенциальная поверхность имеет положительный суммарный заряд, отрицательно заряженными остаются только кофакторы.
Это говорит о том, что специальное взаимодействие между субъединицами осуществляется только при физиологических рН.
На этом слайде показано как происходит фотоизомеризация хромофоров фикоэритроцианина. Переход из линейной (Е) конформации в скрученную (Z) сопровождается изменениями спектра поглощения.
То есть при изменении конформации белка при воздействии различными факторами изменяется конформация флуорофора.
Известно, что в нативной конформации, когда хромофор линеен, обеспечивается большое время затухания флуоресценции порядка 1,8 нс и большой квантовый выход.
По итогам работы были седланы следующие выводы:
Сдвиг на спектрах поглощения и фл является результатом нарушения диполь-дипольного взаимодействия хромофоров из-за увеличения расстояния и изменения конформации белка
Было показано для других фикобилипротеинов высокая стабльность к изменениям рН
С помощью кругового дихроизма было исследовано экситонное взаимодействие, результаты согласуются с динамическим светорассеянием, где был оценен переход тример-мономер.