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Fundamentos de
Engenharia Genética
Prof. Dr. Eduardo Honda
Porto Velho
2008
Dogma Central da Biologia Molecular
O que é Engenharia Genética?
É um conjunto de tecnologias que permitem
a manipulação (modificação) de material
genético in vitro
Também conhecida como Tecnologia do
DNA Recombinante
Inclui o isolamento, cópia e multiplicação de
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diferentes espécies, e transferência de
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Clonagem Molecular
Para se estudar um determinado gene que
codifica uma proteína ou RNA é preciso isolá-
lo.
Clonagem = fazer várias cópias idênticas
Clonagem de DNA  isolar um fragmento
específico de DNA do cromossomo, introduzi-
lo num vetor capaz de replicá-lo, e fazer
milhões de cópias idênticas
Clonagem Molecular
Isolamento de Novos organismos que produzem
enzimas de interesse Biotecnológico.
Clonagem Molecular- Isolamento
Gênico
Isolamento do DNA: PCR, Banco de cDNA.
Isolamento do DNA- PCR
Desnaturação do DNA Fita-Dupla
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Após vários ciclos...
Amplificação do Fragmento gênico desejado !!!
Isolamento de DNA e Biblioteca
de cDNA
As bibliotecas de DNA representam, teoricamente,
todo o material genético de um organismo clonado
em um vetor
Tipos:
A) Genômica: - clonado diretamente do genoma.
B) cDNA:- feita a partir de mRNA .
Isolamento de DNA- Biblioteca
genômica
Extração do DNA Genômico;
Clivagem com enzimas de restrição;
Ligação dos Fragmentos nos vetores;
Transformação Celular;
Replicação do vetor.
Biblioteca de cDNA
- mRNA de um tipo
celular específico;
- “primer” de oligo dT e
transcriptase reversa;
- DNA Polimerase I e
dNTPs;
- Clonagem em um vetor
de escolha
Clonagem Molecular- Requerimentos
1) Método para clivar o DNA alvo;
2) Método para juntar 2 moléculas de DNA
covalentemente (inserto + vetor)- LIGAÇÃO!
3) Célula hospedeira;
4) Método para introduzir moléculas de DNA para
dentro da célula hospedeira que as possa duplicar;
5) Método para selecionar moléculas de DNA
quimérico ou recombinantes;
6) Métodos para o screening da característica
procurada .
Geração de moléculas
recombinantes
- Clonagem Molecular -
CLONAGEM
Ligação de extremidades compatíveis
Sítio
Múltiplo
de
Clonagem
(Polylinker)
As
endonucleases
de Restrição
Clonagem
Orientada
As “Ferramentas”
1) Enzimas
2) Vetores
3) Células hospedeiras
ENZIMAS
Enzimas de Restrição
São endonucleases que clivam o DNA
em seqüências específicas chamadas
sítio de restrição.
Quebram a ligação fosfodiéster
Os sítios de restrição são, geralmente,
seqüências palindrômicas (mesma
seqüência nos dois sentidos)
Enzymes for DNA manipulation –
restriction enzymes
Source: http://www.blc.arizona.edu/INTERACTIVE/recombinant3.dna/clones.html
Enzimas de Restrição
Classes of Restriction Enzymes
Type I
cleavage occurs 400-7000 bp
from recognition site
Type II
cleavage occurs adjacent or
within recognition site
Type III
cleavage occurs 25-27 bp
from recognition site
• Endonucleases sítio-específicas
isoladas de procariotos
• Protegem a bactéria do ataque de
vírus (fagos)
• Protegem seu próprio DNA
metilando-o no sítio de restrição
• Enzimas do tipo II são as mais
utilizadas em Biologia Molecular
EcoRI metilase
DNA Ligase
Promover a união de moléculas de DNA
pela formação de uma ligação
fosfodiéster entre uma extremidade 3’-
OH e outra 5’-PO4.
DNA Polimerases
Polimerizam a molécula de DNA a
partir de uma extremidade 3´-OH e
usando uma das fitas do DNA como
molde.
Exe: Taq polimerase
Transcriptase reversa
Polimeriza uma fita de DNA a partir
de um molde de RNA
Isolada dos retrovírus
Aplicação: síntese de cDNA
VETORES
Os Vetores
São moléculas de DNA que irão propagar o
DNA clonado.
Características desejadas:
•Habilidade de se duplicar na célula hospedeira;
• Marca genética para selecionar a célula contendo o
vetor (resistência a drogas ou marcas auxotróficas);
•Sítios de clonagem únicos.
Tipos de vetores
Plasmídios
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Cosmídios
Cromossomos artificiais de levedura (YAC)
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insetos e mamíferos
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Moléculas de DNA fita dupla circulares e de
replicação autônoma (ORI);
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antibióticos ou complementação auxotrófica.
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um vetor
de
expressão
de E. coli
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Transformação Bacteriana
Source: http://www.blc.arizona.edu/INTERACTIVE/recombinant3.dna/clones.html
Células podem ser selecionados em placas com antibiótico.
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está ativa. As colônias brancas na presença de X-gal significa a presença de DNA
recombinante no plasmidio.
Bacteriófagos
Infectam células de E. coli e o DNA
se duplica na célula hospedeira.
Ex: Fago 
Vetores baseados no fago 
Foram retirados 20 Kb do genoma do fago
necessários para integração/excisão para
serem substituídos por DNA exógeno e
formar um genoma de 50 Kb que é
empacotado in vitro.
Genomas maiores ou menores não são
empacotados.
Ciclo lítico compulsório
Clonando no
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• São plasmídios contendo as extremidas “cos”
do fago λ
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auxotrofia);
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Genetics, Ricki Lewis
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