Clase 6 congelacion

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Congelaciòn de embriones

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    1. 1. Reuben J. Mapletoft* Department of Large Animal Clinical Sciences, WCVM, University of Saskatchewan *Bioniche Animal Health, Belleville, ON, Canada CONGELACION DE EMBRIONES
    2. 2. CONGELACION DE EMBRIONES
    3. 3. Advantages of Frozen Embryos <ul><li>Remove necessity for immediate transfer of embryos </li></ul><ul><li>Remove necessity for synchronized recipients </li></ul><ul><li>Allows rapid and inexpensive transport of genetics </li></ul><ul><li>Decreases chances of disease introduction via importation </li></ul><ul><li>Embryos stored while parents disease/production tested </li></ul><ul><li>Storage of rare breeds and genetically valuable strains </li></ul><ul><li>Overcome problems of genetic drift </li></ul>
    4. 4. Ventajas de la Congelacion de Embriones <ul><li>No es necesario transferir los embriones inmediatamente después de colectados. </li></ul><ul><li>No es necesario tener muchas receptoras sincronizadas. </li></ul><ul><li>Permite el transporte de genética a bajo costo. </li></ul><ul><li>Facilita la introducción de una nueva raza y la adaptación de los futuros terneros al nuevo medio ambiente. </li></ul>
    5. 5. <ul><li>Disminuye el riesgo de introducir enfermedades exóticas. </li></ul><ul><li>Los embriones pueden ser almacenados mientras se testean los padres por enfermedades o por producción. </li></ul><ul><li>Almacenamiento de genética de razas o especies raras o en extinción. </li></ul><ul><li>Permite mantener la diversidad genética a través de un banco de embriones. </li></ul>
    6. 7. Cryobiological Principles <ul><li>1. Ice forms in extracelluar meduim between –5 o C and –10 o C </li></ul><ul><li>2. When an ice crystal grows extracelluarly, intracelluar solute concentration increases (solution effect) </li></ul>
    7. 8. - 5 to - 7 °C - 30 to - 35 °C
    8. 9. Freezing Injury <ul><li>Intracellular Ice </li></ul><ul><li>Solution Effects </li></ul>
    9. 10. Constitution of Freezing Medium <ul><li>1. PBS + antibiotic-antimycotic </li></ul><ul><li>2. Biological proteins – 0.4-20% </li></ul><ul><li>3. Cryoprotectants - ~10% </li></ul><ul><ul><li>*Glycerol </li></ul></ul><ul><ul><li>*Ethylene Glycol </li></ul></ul>
    10. 11. Cryoprotectants <ul><li>Permeating e.g. Glycerol or ethylene glycol </li></ul><ul><li>Nonpermeating e.g. Sucrose </li></ul>
    11. 12. Permeating Cryoprotectants eg. Glycerol or ethylene glycol <ul><li>Low molecular weight – permeating cryoprotectants replace water within cells** </li></ul><ul><li>Prevent intracellular ice crystallization </li></ul><ul><li>Reduce exposure to increased concentration of solutes (salts) during freezing </li></ul><ul><li>Cause less shrinkage during freezing </li></ul><ul><li>**Rate of permeation is an important factor </li></ul>
    12. 13. <ul><li>A permeating cryoprotectant will enter the embryo at a rate dependant on the permeability coefficient and the temperature </li></ul>
    13. 14. Cell Volume Changes with Addition and Removal of Cryoprotective Agents (Mazur) Diluent Added Influx Efflux 1 Relative Cell Volume Time in Permeating Additive 0
    14. 16. Cell Volume Changes with Addition and Removal of Cryoprotective Agents (Mazur) Diluent Added Influx Efflux 1 Relative Cell Volume Time in Permeating Additive 0
    15. 17. Protocolo de Congelación
    16. 18. <ul><li>Colectar </li></ul><ul><li>Lavar (10 veces) </li></ul><ul><li>Clasificar los embriones. </li></ul>Protocolo de Congelación
    17. 19. Lavado de embriones <ul><li>5 lavados con PBS (1/100 volumen de los embriones y no mas de 10 embriones) </li></ul><ul><li>2 lavados con tripsina al 0,2% por 30-60 segundos </li></ul><ul><li>5 lavados con PBS </li></ul><ul><li>Los Embriones deben Tener la ZP intacta, sin material adherido y ser observados a 50X de magnificación </li></ul>
    18. 21. Lavado de embriones
    19. 22. Enfermedades que no se Transmiten a través de la Transferencia de Embriones <ul><li>Categoría 1 </li></ul><ul><li>Leucosis Enzootica Bovina </li></ul><ul><li>Fiebre Aftosa (Bovino) </li></ul><ul><li>Lengua Azul (Bovino) </li></ul><ul><li>Brucela Abortus (Bovino) </li></ul><ul><li>Encefalitis Espongiforme Bovina (BSE) </li></ul><ul><li>Scrapie (Ovino) </li></ul><ul><li>IBR (Bovino) (con tripsina) </li></ul><ul><li>Pseudorrabia (Porcino) (con tripsina) </li></ul>IETS, 2004
    20. 23. <ul><li>Categoría 2 </li></ul><ul><li>Peste Porcina Clasica </li></ul><ul><li>Lengua Azul (ovino) </li></ul><ul><li>Categoria 3 </li></ul><ul><li>DVB </li></ul><ul><li>Peste Bovina </li></ul><ul><li>Haemophilus Sommus </li></ul><ul><li>Virus de la Inmunodeficiencia Bovina </li></ul><ul><li>Campilobacter Fetus (ovino) </li></ul><ul><li>Fiebre Aftosa (porcino, ovino y caprino) </li></ul><ul><li>Enfermedad Vesicular Porcina </li></ul><ul><li>Adenomatosis Pulmonar (ovinos) </li></ul><ul><li>Categoría 4 </li></ul><ul><li>Micobacterium Bovis </li></ul><ul><li>Micobacterium Paratuberculosis </li></ul><ul><li>Neospora Caninum </li></ul><ul><li>Anaplasmosis Bovina </li></ul><ul><li>Herpesvirus Bovino-4 </li></ul><ul><li>Ureaplasma Micoplasma </li></ul><ul><li>Clamidia Psitaci </li></ul><ul><li>Virus Parainfluenza 3 </li></ul><ul><li>Estomatitis vesicular (bovino) </li></ul><ul><li>Enfermedad de Akabane (bovino) </li></ul><ul><li>E. Coli 09:k99 (bovino) </li></ul><ul><li>Lepto Borgpeterseni s, hardjobovis </li></ul><ul><li>Enterovirus (bovino) </li></ul><ul><li>Maedi-visna (ovino) </li></ul><ul><li>Scrapie (Caprino) </li></ul><ul><li>Lengua Azul (caprino) </li></ul><ul><li>Artritis-encefalitis Caprina </li></ul><ul><li>Parvovirus porcino </li></ul><ul><li>Leptospirosis (porcino) </li></ul><ul><li>Brucela Ovis </li></ul><ul><li>Peste Porcina Africana </li></ul><ul><li>Circovirus Porcino </li></ul><ul><li>Sindrome Reproductivo y Respiratorio porcino </li></ul>
    21. 24. BOVINE EMBRYOS: EXAMPLES OF DEVELOPMENTAL STAGE AND QUALITY Page 1
    22. 25. BOVINE EMBRYOS: EXAMPLES OF DEVELOPMENTAL STAGE AND QUALITY Page 2
    23. 26. BOVINE EMBRYOS: EXAMPLES OF DEVELOPMENTAL STAGE AND QUALITY Page 3
    24. 27. Calidad y Estadío de los Embriones Respuesta Posible a la Congelación Stroud y Leibo, 1995
    25. 28. 1333 Total 39,66 23/58 c Blastocisto expandido 52,03 179/344 bc Blastocisto 59,39 275/463 a Blastocisto temprano 55,40 0,004 259/468 ab Mórula % Valor P P/total Estado embrión
    26. 29. 1333 Total 33,33 11/33 b 3 49,23 32/65 ab 2 56,11 0,01 693/1235 a 1 % Valor P P/total Calidad Embrión
    27. 31. Cryoprotector Embryo Cotton plug Plug/label E511 SM010769 SRN 5G DT 1
    28. 38. Cryoprotector Embryo Cotton plug Plug/label E511 SM010769 SRN 5G DT 1
    29. 39. Protocolo de Congelación <ul><li>1. Clasificar los embriones (Grado 1). </li></ul><ul><li>2. Colocarlos en Crioprotector 1.5 M y cargar la pajuela. </li></ul><ul><li>Tiempo Total: 10 minutos. </li></ul><ul><li>3. Colocar las pajuelas en la congeladora </li></ul><ul><li>(-6,5 ºC) y dejar 1 a 2 minutos. </li></ul><ul><li>4. Realizar el “seeding”. Dejar 10 minutos </li></ul>
    30. 40. Embryo Freezing Protocol <ul><li>Add cryoprotectant at room temp </li></ul><ul><li>Place in freezing chamber at -7 o C </li></ul><ul><li>Equilibrate for 5 minutes </li></ul><ul><li>Seed (induce ice crystal formation) </li></ul><ul><li>Hold for 10 minutes </li></ul><ul><li>Cool at 0.6 o C/min </li></ul><ul><li>Plunge in liquid nitrogen at -35 o C </li></ul><ul><li>Thaw - Water bath (25 to 35 o C) for 1 min </li></ul><ul><li>(In air for 10 seconds) </li></ul>
    31. 41. Seeding <ul><li>Induction of ice crystals in the sample (break the metastable state of solution)* </li></ul><ul><li>Begins cell dehydration process </li></ul><ul><li>*Critical step </li></ul>Crioprotector Embryo E511 SM010769 SRN 5G DT 1
    32. 42. Cooling Rate <ul><li>From seeding temp. to –35 o C </li></ul><ul><li>(0.3 to 0.8 o C/min) </li></ul><ul><li>From –35 o C to –196 o C </li></ul><ul><li> (~500 o C/min) </li></ul><ul><li>Rall, (1990) </li></ul>
    33. 43. Protocolo de Congelación <ul><li>1. Clasificar los embriones (Grado 1). </li></ul><ul><li>2. Colocarlos en Crioprotector 1.5 M y cargar la pajuela. </li></ul><ul><li>Tiempo Total: 10 minutos. </li></ul><ul><li>3. Colocar las pajuelas en la congeladora </li></ul><ul><li>(-6,5 ºC) y dejar 1 a 2 minutos. </li></ul><ul><li>4. Realizar el “seeding”. Dejar 10 minutos </li></ul><ul><li>5. Congelar a 0,6 ºC por minuto hasta - 35 ºC. </li></ul><ul><li>6. Sumergirlas en N 2 . </li></ul>
    34. 45. DESCONGELACION <ul><li>10 segundos en arie </li></ul><ul><li>30 segundos en agua a 25-30 o C </li></ul><ul><li>Vaciar la Pajuela en una placa de Petri </li></ul><ul><li>Remover el Glicerol </li></ul>
    35. 46. Embryo Thawing & Broken Zonae <ul><li>M ouse Bovine </li></ul><ul><li>n % n % </li></ul><ul><li>22 o C Water 223 (10.3%) 207 (21.7%) </li></ul><ul><li>22 o C Air 220 (0.01%) 202 (0.02%) </li></ul><ul><li>Palasz et al. (1989) </li></ul>
    36. 47. Cryoprotectant Removal (to prevent osmotic shock) <ul><li>Dilution </li></ul><ul><li>Use of sucrose as an osmotic counterforce </li></ul><ul><li>Highly permeating cryprotectants cause little osmotic shock </li></ul>
    37. 48. Non-permeating Cryoprotectants <ul><li>Low molecular weight, nonpermeating </li></ul><ul><li>eg. Sucrose </li></ul><ul><li>*Prevent intracellular ice formation by dehydrating cells before freezing </li></ul>
    38. 53. Protocolo de Congelación <ul><li>1. Clasificar los embriones (Grado 1). </li></ul><ul><li>2. Colocarlos en Crioprotector 1.5 M y cargar la pajuela. </li></ul><ul><li>Tiempo Total: 5 minutos. </li></ul><ul><li>3. Colocar las pajuelas en la congeladora </li></ul><ul><li>(-6,5 ºC) y dejar 1 a 2 minutos. </li></ul><ul><li>4. Realizar el “seeding”. </li></ul><ul><li>5. Congelar a 0,6 ºC por minuto hasta - 35 ºC. </li></ul><ul><li>6. Sumergirlas en N 2 . </li></ul>
    39. 54. Cell Volume Changes with Addition of a Nonpermeating Cryoprotective Agent 1 Relative Cell Volume Time in Nonpermeating Additive 0 Added Removed Sucrose
    40. 57. The Direct Transfer of Frozen-thawed Bovine Embryos <ul><li>Use of highly permeating cryoprotectants </li></ul><ul><li>Embryo transfer without dilution </li></ul><ul><li>Not necessary to examine embryo after thawing </li></ul><ul><li>Done much like AI </li></ul>
    41. 58. Transferencia Directa de Embriones Bovinos
    42. 59. Cell Volume Changes with Addition and Removal of Glycerol vs Ethylene Glycol Diluent Added Influx Efflux 1 Relative Cell Volume Time in Permeating Additive 0
    43. 62. Comparison of Glycerol and Ethylene Glycol Pregnancy Rates % Preg. % Preg. References No. No. Leibo & Mapletoft (1998) 59.2 11376 58.0 1609 Holland Gen. (unpub.) 51.8 228 55.3 838 Arreseigor et al. (1998) 47.4 97 45.9 423 Looney et al. (1996) 50.0 56 69.6 56 Hinshaw et al. (1996) 59.6 780 56.2 185 Lange (1995) 58.2 189 48.9 92 Ethylene Glycol Glycerol
    44. 63. < Continued > 55.0 58.6 13331 4099 Total Em Tran (unpub.) (domestic transfers) 51.2 387 52.6 671 Em Tran (unpub.) (split donors, exported to Holland) 51.8 218 53.8 225 References % Preg. No. % Preg. No. Ethylene Glycol Glycerol
    45. 64. 1997 Census of Cattle Embryos Frozen and Transferred in Canada and the USA (Leibo and Mapletoft, 1998) 55.4 87.6 % of Total 58.5 15,433 56.9 12,411 USA 59.2 11,376 58.0 1,609 Canada % Pregnant No. Frozen % Pregnant No. Frozen Country Ethylene Glycol Glycerol
    46. 65. Effect of Sucrose on Pregnancy Rates from Direct Transfers <ul><li>No. Embryos % Preg. ( + SD) </li></ul><ul><li>Transferred (weighted) </li></ul><ul><li>AETA Results </li></ul><ul><li>Ethylene Glycol 5,056 55.6 + 8.9 </li></ul><ul><li>Ethylene Glycol + Sucrose 10,377 55.2 + 7.1 </li></ul><ul><li>CETA Results </li></ul><ul><li>Ethylene Glycol 7,273 59.0 + 7.2 </li></ul><ul><li>Ethylene Glycol + Sucrose 4,653 58.8 + 6.3 </li></ul>
    47. 66. 100 90 80 70 60 50 40 Pregnancy (%) Seeding Temperatures of Direct Transfer Embryos Seeding Temperature ( o C) -5 -4 -6 -7 -8
    48. 67. 100 90 80 70 60 50 40 Pregnancy (%) Cooling Rate of Direct Transfer Embryos Cooling Rate ( o C/min) from -7 o C to -33 o C 0.4 0.5 0.6
    49. 68. Embryo Transfer in Canada in 2001 <ul><li>Embryos transferred fresh 23,569 </li></ul><ul><li>Pregnancies 14,326 (60.8%) </li></ul><ul><li>Embryos transferred frozen 23,158 </li></ul><ul><li>Pregnancies 13,820 (59.7%) </li></ul><ul><li>Direct transfer 22,061 (95%) </li></ul><ul><li>Pregnancies 12,983 (58.9%) </li></ul>
    50. 69. Embryo Transfer in Canada in 2002 Embryos transferred fresh 27,135 Embryos transferred frozen 27,511 Direct transfer 27,606 (99%)
    51. 70. Effect of Thaw Method on Survival of Frozen Bovine IVF Embryos a,b Values differ significantly (P< 0.01) 295 (66) b 333 (74) b 447 Water 293 (63) b 248 (75) b 466 Air > Water 226 (47) a 262 (55) a 477 Air Hatched Blastocysts after 72 h (%) Blastocysts after 24 h (%) No. Thawed Thaw Method
    52. 71. Protocolo de Congelación
    53. 72. Protocolo de Congelación <ul><li>1. Clasificar los embriones (Grado 1). </li></ul><ul><li>2. Colocarlos en EG 1.5 M y cargar la pajuela. </li></ul><ul><li>Tiempo Total: 5 minutos. </li></ul><ul><li>3. Colocar las pajuelas en la congeladora (-6,5 ºC) y dejar 1 a 2 minutos. </li></ul><ul><li>4. Realizar el “seeding”. Dejar 10 minutos </li></ul><ul><li>5. Congelar a 0,5 ºC por minuto hasta - 35 ºC. </li></ul><ul><li>6. Sumergirlas en N 2 . </li></ul>
    54. 73. Direct Transfer Straw Ethylene glycol Embryo Cotton plug Plug/label E511 SM010769 SRN 5G DT 1
    55. 76. Pajuela de Transferencia Directa Etilenglicol 1,5 M
    56. 78. Trypsin for sanitary washing of embryos as specified by the IETS
    57. 81. Lavado de embriones <ul><li>5 lavados con PBS (1/100 volumen de los embriones y no mas de 10 embriones) </li></ul><ul><li>2 lavados con tripsina al 0,2% por 30-60 segundos </li></ul><ul><li>5 lavados con PBS </li></ul><ul><li>Los Embriones deben Tener la ZP intacta, sin material adherido y ser observados a 50X de magnificación </li></ul>
    58. 82. Enfermedades que no se Transmiten a través de la Transferencia de Embriones <ul><li>Categoría 1 </li></ul><ul><li>Leucosis Enzootica Bovina </li></ul><ul><li>Fiebre Aftosa (Bovino) </li></ul><ul><li>Lengua Azul (Bovino) </li></ul><ul><li>Brucela Abortus (Bovino) </li></ul><ul><li>Encefalitis Espongiforme Bovina (BSE) </li></ul><ul><li>Scrapie (Ovino) </li></ul><ul><li>IBR (Bovino) (con tripsina) </li></ul><ul><li>Pseudorrabia (Porcino) (con tripsina) </li></ul>IETS, 2004
    59. 83. <ul><li>Categoría 2 </li></ul><ul><li>Peste Porcina Clasica </li></ul><ul><li>Lengua Azul (ovino) </li></ul><ul><li>Categoria 3 </li></ul><ul><li>DVB </li></ul><ul><li>Peste Bovina </li></ul><ul><li>Haemophilus Sommus </li></ul><ul><li>Virus de la Inmunodeficiencia Bovina </li></ul><ul><li>Campilobacter Fetus (ovino) </li></ul><ul><li>Fiebre Aftosa (porcino, ovino y caprino) </li></ul><ul><li>Enfermedad Vesicular Porcina </li></ul><ul><li>Adenomatosis Pulmonar (ovinos) </li></ul><ul><li>Categoría 4 </li></ul><ul><li>Micobacterium Bovis </li></ul><ul><li>Micobacterium Paratuberculosis </li></ul><ul><li>Neospora Caninum </li></ul><ul><li>Anaplasmosis Bovina </li></ul><ul><li>Herpesvirus Bovino-4 </li></ul><ul><li>Ureaplasma Micoplasma </li></ul><ul><li>Clamidia Psitaci </li></ul><ul><li>Virus Parainfluenza 3 </li></ul><ul><li>Estomatitis vesicular (bovino) </li></ul><ul><li>Enfermedad de Akabane (bovino) </li></ul><ul><li>E. Coli 09:k99 (bovino) </li></ul><ul><li>Lepto Borgpeterseni s, hardjobovis </li></ul><ul><li>Enterovirus (bovino) </li></ul><ul><li>Maedi-visna (ovino) </li></ul><ul><li>Scrapie (Caprino) </li></ul><ul><li>Lengua Azul (caprino) </li></ul><ul><li>Artritis-encefalitis Caprina </li></ul><ul><li>Parvovirus porcino </li></ul><ul><li>Leptospirosis (porcino) </li></ul><ul><li>Brucela Ovis </li></ul><ul><li>Peste Porcina Africana </li></ul><ul><li>Circovirus Porcino </li></ul><ul><li>Sindrome Reproductivo y Respiratorio porcino </li></ul>
    60. 85. Pajuela de Transferencia Directa Etilenglicol 1,5 M
    61. 86. Protocolo de Congelación <ul><li>1. Clasificar los embriones (Grado 1). </li></ul><ul><li>2. Colocarlos en EG 1.5 M y cargar la pajuela. </li></ul><ul><li>Tiempo Total: 5 minutos. </li></ul><ul><li>3. Colocar las pajuelas en la congeladora (-6,5 ºC) y dejar 1 a 2 minutos. </li></ul><ul><li>4. Realizar el “seeding”. </li></ul><ul><li>5. Congelar a 0,5 ºC por minuto hasta - 35 ºC. </li></ul><ul><li>6. Sumergirlas en N 2 . </li></ul>
    62. 87. Effect of Time Between Flushing and Freezing on Pregnancy Rate (Embryos frozen at Em Tran & thawed at Holland Genetics) (Hasler, 2001) 55.7 106 151 - 180 53.0 264 121 - 150 56.2 507 91 -120 56.0 722 61 - 90 56.0 418 31 - 60 54.1 85 0 - 30 % Pregnant No. Transfers Time (min)
    63. 92. Protocolo de Descongelación <ul><li>1. Sacar la pajuela. </li></ul><ul><li>2. Colocarla en Baño María a 30 ºC por 30 segundos. </li></ul><ul><li>3. Transferir dentro de los 15 minutos de descongelado. </li></ul>
    64. 93. 100 90 80 70 60 50 40 Pregnancy (%) Warming in Air of Direct Transfer Embryos Warming Time (sec) in Air 4 2 6 8 10
    65. 95. Rutina de Transferencia Directa de Embriones <ul><li>Trabajar al lado de la manga </li></ul><ul><li>1. Anotar número de receptora y embrión. </li></ul><ul><li>2. Examinar ovarios (palpación o US) y vaciar el recto. </li></ul><ul><li>3. Anestesia epidural, limpiar zona perineal. </li></ul><ul><li>4. Descongelar el embrión y cargarlo en la vaina de transferencia. </li></ul><ul><li>5. Transferir en el cuerno ipsilateral al CL lo más rápido posible. </li></ul><ul><li>6. Chequear planilla y largar. </li></ul>
    66. 96. Peres Coelho et al., 2007 1122 Total 51,22 42/82 >360 segundos 56,79 372/655 >180≤360 segundos 55,84 0,42 251/385 ≤ 180 segundos % Valor P P/total Tiempo TETF
    67. 97. a b b a Estadio de desarrollo del embrión- Embriones congelados con etilenglicol
    68. 98. Embriones Brahman vs Bos Taurus (Looney et al., 2004) 57.7 542 940 55.5 197 355 Totales 43.7 48 98 203 30 20 67 Brahman 57.2 54 124 231 65 67 103 Sintéticas con Brahman 59.7 61 80 131 58 61 105 Continentales 63.5 64 240 375 61 49 80 Británicas % % Pre. N % Pre. N Total Etilenglicol Glicerol Biotipo
    69. 99. Estadio y Preñez (Looney et al., Therio 1996; 45:170) 14.0 2 14 7 30.4 7 23 6 25.0 4 16 5 58.8 30 51 4 % Preñadas N Estadio
    70. 100. Porcentajes de preñez con embriones congelados o refrigerados por 24-30 h y transferidos en receptoras cruzas Bos Indicus. Tribulo et al., 2001   Grado 1 Grado 2 Total Congelados 27/49 (55,1) 7/20 (35,0) a 34/69 (49,3) Refrigerados 21/36 (58,3) 7/13 (53,8) b 28/49 (57,1)
    71. 101. Refrigerated n=131 % Frozen-Thawed DT n=252
    72. 102. a ab ab b Operador
    73. 103. a b a Calificación de la Transferencia
    74. 104. RECEPTORAS TRANS . PREÑADAS % PREÑEZ 177 100 56.5% 181 121 67% 358 221 62% Grupo control Grupo FLUNIXIN Total Análisis Estadístico: efectos significativos del grupo tratado con Meglumina de Flunixin (p= 0.0458, Chi cuadrado) Utilización de inhibidores de la producción de prostaglandinas para mejorar los porcentajes de gestación en la transferencia embrionaria (Meglumina de Flunixin) D.Ezcurra, L. Guller Frers, E.V. Lopez
    75. 105. The effect of Banamine (flunixin meglumine) on pregnancy rate of embryo transfer recipients ab P<0.02 ( * Schrick, 2003; ** Burry, unpublished ) Banamine Controls 65.4 65.3 b % preg. 260 1,300 No. trans. 66.2 245 Burry ** 60.2 a 797 Schrick * % preg. No. trans. Study
    76. 106. Perdidas Embrionarias y Fetales
    77. 107. Embriones congelados en Etilenglicol n=252
    78. 108. Abortaron: 9 3.6% Paridas: 123 48.8% Terneros: 127 50.4% Muertos al Nac.: 7 2.8% Muertos: 1 0.4% TOTAL: 119 47.2%
    79. 109. Porcentaje Acumulativo de Preñez con 60 Días de Entore post ET
    80. 110. TERNERA BRANGUS PP NACIDO POR TE RECEPTORA
    81. 111. Vitrification <ul><li>Vitrum = Latin for glass </li></ul><ul><li>Formation of glassy solid without ice crystals </li></ul><ul><li>Very rapid freezing </li></ul><ul><li>High molar level (5 to 7M) of </li></ul><ul><li>cryoprotectants </li></ul><ul><li>Requires no freezer (Dewar of nitrogen) </li></ul><ul><li>Can be used with in-straw dilution </li></ul>
    82. 112. Advantages of Vitrification to the Practitioner <ul><li>No freezer required </li></ul><ul><li>Faster with small no. of embryos - Shortens day with small no. of embryos or at the end of the day with “left over” embryos </li></ul><ul><li>Higher survival of IVF-derived embryos </li></ul><ul><li>Increased survival of lower quality embryos </li></ul>
    83. 113. Procedures  Basal embryo holding medium  Sucrose or galactose  Need four media • Embryo holding medium • “Low” concentration EG • High concentration EG • Dilution medium
    84. 114. Van Wagtendonk et al., 1997  A thorough study  Used 0.25-ml straws – DT  Used glycerol – in straw dilution with 1 M sucrose  Pregnancy rates • Vitrified 44.5% (N=393) • Conventional 45.1% (N=335)
    85. 115. Parameters Tested <ul><li>Cryoprotectant: (Ethylene glycol), concentration, no. of steps, timing of addition, and in straw dilution </li></ul><ul><li>Macromolecules: </li></ul><ul><ul><li>BSA </li></ul></ul><ul><ul><li>PVA </li></ul></ul><ul><ul><li>Sodium Hyaluronate </li></ul></ul>
    86. 116. a,b Values within columns without common superscripts differ (P<0.05). Expansion and hatching rates of vitrified embryos Equilibration Time (min) Blastocyst % expansion % hatching 1 60 a 29 a 2 66 a 41 ab 3 82 b 60 b Non-vitrified control 84 b 45 b
    87. 117. 1- vs 2-Step Vitrification Treatment % Survival (of controls) 1-step 85  10 2-step 98  10 Thaw temp 24  C 90  10 37  C 93  10
    88. 118. Expansion and hatching rates of vitrified in vivo GRADE 1 and 2 embryos Stage (n) % % Re-expansion Hatching Morula (25) 100 96 Blastocysts (20) 95 95
    89. 119. Comparison of Macromolecules 2.3 66% + 2.0 91% + + 2.2 61% + Quality Survival SH PVA BSA
    90. 120. Addition of Cryoprotectant <ul><li>3 minutes in 1st EG solution </li></ul><ul><li>45 seconds in 2 nd EG solution </li></ul><ul><ul><li>Draw embryo into straw, seal and freeze </li></ul></ul><ul><ul><li>Embryos can be loaded and frozen approximately 1 per minute </li></ul></ul>
    91. 121. Straw Configuration DHCDM V2HCDM Cotton plug Plunged end
    92. 122. Thawing  In air 10 s  Water bath 37 °C 20 s  Shake the straw  Back in bath  Dry  Embryo transfer
    93. 124. Thank you Muchas Gracias

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