PDV: Biologia mencion Guía N°34 [4° Medio] (2012)

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Guía N°34 de Biologia mencion del Preuniversitario PDV. Año 2012.

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PDV: Biologia mencion Guía N°34 [4° Medio] (2012)

  1. 1. BIOLOGIA MENCIÓN BM-34UNIDAD I: ORGANIZACIÓN, ESTRUCTURA Y ACTIVIDAD CELULAR GENOMA, GENES E INGENIERÍA GENÉTICA BIOLOGÍA MOLECULAR II BIOTECNOLOGÍA Gen de interés cortado con enzimas de Tecnología de ADN restricción recombinante Clonación del ADN Proteína que se utiliza para simular nieve a una mayor temperatura
  2. 2. INTRODUCCIONEs sabido que la información genética se encuentra guardada en pequeñas partículas especialesque llamamos cromosomas, y en ellos, se encuentra el DNA organizado en unidades funcionalesque conocemos como genes. La transmisión de la información genética de un individuo a otrogeneralmente es entre individuos de una misma especie ya que la naturaleza impone ciertasbarreras biológicas, sin embargo, por otro lado también la misma naturaleza ofrece la posibilidadde que la información hereditaria traspase las barreras de las especies, como es el caso dealgunos virus y algunas bacterias que funcionan como verdaderos movilizadores de informacióngenética entre especies, así la bioquímica y la biotecnología han logrado reproducir estosprocesos. Con el correr del tiempo los científicos también se percataron que los seres vivos tienenmecanismos para defenderse de estos genomas foráneos que eran insertados por los virus y/obacterias, así, la era del ADN recombinante (o ingeniería genética) se inició en la década de1970. Cuando los investigadores descubrieron que las bacterias se protegen de la infección porvirus debido a la presencia de ciertas enzimas que restringen o interfieren la invasión viral. Ellasprovocan cortes del ADN viral en sitios específicos el que ahora cortado, no puede realizar lasíntesis de las proteínas del propio fago. Los científicos llamaron a estas proteínas enzimas derestricción que ha permitido obtener secuencias de nucleótidos determinadas produciendofragmentos de ADN reproducibles que pueden generar clones (DNA cloning). Pero por otra parte,la biotecnología podría utilizar la siguiente frase “logremos que las modificaciones del genoma deorganismos simples, nos ayude a modificar el genoma de organismos superiores”1. MANIPULACIÓN DE ADN AMPLIFICACIÓN DE ADN IN VITROLa técnica de reacción en cadena de la polimerasa o PCR, del inglés Polymerase Chain Reaction,revolucionó la biología molecular. Kary Mullis fue el desarrollador de la técnica del PCR en 1983 yfue galardonado en 1993 con el Premio Nobel de Química por su descubrimiento.La idea de la reacción en cadena de la polimerasa es simple, se utilizan dos cebadores o primersque son complementarios a las cadenas opuestas de una secuencia de ADN, lo que permite que laenzima ADN polimerasa actúe sobre ellos para replicar el ADN. Si este procedimiento se realizacíclicamente, el resultado es una gran cantidad de una secuencia de ADN de interés. Teoría de la reacción en cadena de la polimerasa o PCR: Etapas (Figura 1)A) Desnaturalización: El ADN que se quiere amplificar se desnaturaliza a través de la separación de ambas hebras. Este ADN no necesita estar purificado ni clonado, y puede provenir de distintas fuentes, incluyendo ADN genómico, muestras forenses como sangre seca o semen, muestras almacenadas en registros médicos, pelos, restos momificados y fósiles. El ADN es desnaturalizado por calor a unos 95ºC hasta que se disocia en cadenas simples, normalmente en unos 5 minutos.B) Hibridación: Luego de la separación los cebadores o primeros hibridan el ADN de cadena simple. Los cebadores son oligonucleótidos sintéticos que hibridan con las secuencias flanqueantes del segmento a amplificar. Generalmente se utilizan dos cebadores diferentes, cada uno de ellos tiene una secuencia complementaria a una de las dos cadenas del ADN. Los cebadores se alinean con sus extremos 3` encarados ya que hibridan a cadenas opuestas. Al necesitar cebadores sintéticos se requiere alguna información de la secuencia del ADN a amplificar. 2
  3. 3. C) Elongación: Finalmente a la mezcla de reacción se le añade una ADN polimerasa resistente al calor, enzima que extiende los cebadores en dirección 5`- 3` utilizando como molde al ADN de cadena simple unido al cebador. El producto es una molécula de ADN de doble cadena con los cebadores incorporados en el producto final. 2 3 1 Figura 1. Técnicas de PCR (amplificación de ADN). 1 Desnaturalización: los fragmentos del ADN a amplificar se calientan a 95ºC para romper lospuentes de hidrógeno que mantienen unidas ambas hebras del ADN. 2 Hibridación: se baja latemperatura a 55 ºC para que los cebadores o primers se unan de manera complementaria a cadahebra del ADN. 3 Elongación: se sube la temperatura hasta 72ºC para que la enzima Taq ADNpolimerasa agregue nucleótidos libres a cada hebra de ADN para generar las hebrascomplementarias. Luego este proceso se repite varias veces y se obtiene gran cantidad demoléculas de ADN de interés. 3
  4. 4. CORTES EN LA MOLÉCULA DE ADN (Figura 2)Una herramienta muy útil en biotecnología y necesaria para las tecnologías del ADN recombinanteson las endonucleasas de restricción o simplemente llamadas enzimas de restricción. Estasenzimas, aisladas en bacterias, reciben su nombre debido a que limitan o previenen lasinfecciones víricas degradando el ácido nucleico invasor. Las enzimas de restricción reconocen unasecuencia específica de nucleótidos, denominados sitios de restricción, de una molécula de ADNde doble cadena y cortan en esa secuencia (Figura 2). El premio Nobel de 1978 se otorgó aWerner Arber, Hamilton Smith y Daniel Nathans por su investigación sobre enzimas de restricción.Hasta la fecha se han aislado y caracterizado casi 200 tipos de enzimas de restricción diferentes.La capacidad para cortar el ADN en lugares específicos es importante por dos razones: En primer lugar, permite generar mapas físicos en el ADN que se construyen a partir de la localización de sitios de corte para enzimas de restricción. Estos mapas de restricción proporcionan datos cruciales para identificar y trabajar con moléculas de ADN. En segundo lugar, la escisión o cortes por endonucleasa de restricción permite la creación de moléculas recombinantes. La capacidad de construir moléculas recombinantes es importante para la investigación, porque muchos pasos en el proceso de clonación y manipulación de ADN requieren la capacidad de combinar moléculas de ADN de diferentes orígenes. Figura 2. Corte del ADN por enzimas de restricción y unión por ADN ligasa. 4
  5. 5. Si se quieren unir dos fragmentos de ADN provenientes de distintos orígenes (ADNrecombinante), se pueden utilizar enzimas de restricción que reconozcan secuencias de ADNpresentes en ambos fragmentos y luego los corten, generando fragmentos complementarios quehibridarán y serán unidos gracias a la ayuda de la enzima ADN ligasa. SEPARACIÓN DE FRAGMENTOS DE ADN: ELECTROFORESIS EN GELMuchos procedimientos que evalúan las moléculas de ADN utilizan electroforesis en gel (figuraNº3). Esta técnica usa un gel como tamiz molecular para separar los ácidos nucleicos o lasproteínas en función de su tamaño, su carga eléctrica y otras propiedades físicas. Como lasmoléculas de ácidos nucleicos poseen cargas negativas en sus grupos fosfato, en un campoeléctrico viajan hacia el polo positivo. A medida que se mueven, la mayor parte de las fibraspoliméricas obstruyen el paso de las moléculas más largas en mayor medida que el de lasmoléculas más cortas, de esta manera las separa de acuerdo con su longitud. Por tanto, laelectroforesis en el gel separa una mezcla de moléculas de ADN lineal en bandas, cadauna formada por moléculas de ADN de la misma longitud. s Figura 3. Electroforesis de ADN en gel.En el análisis de fragmentos de restricción, los fragmentos de DNA obtenidos después de ladigestión de una molécula de DNA con enzimas de restricción, se separan mediante electroforesisen gel. Cuando la mezcla de fragmentos de restricción que proviene de una molécula de DNAespecífica se somete a electroforesis, se obtiene un patrón de bandas característico de la moléculaoriginal y de la enzima de restricción utilizada. 5
  6. 6. Como el ADN se puede extraer el gel en forma íntegra, el procedimiento también proporciona unaforma de preparar muestras puras de fragmentos individuales.El análisis de fragmentos de restricción también es útil para comparar dos moléculas de DNAdiferentes; por ejemplo, dos alelos de un gen. Una enzima de restricción reconoce una secuenciaespecífica de nucleótidos y un cambio en un solo par de bases impide que se corte en un sitioespecífico. Por tanto, si se presentan diferencias en los nucleótidos entre los alelos dentro de unasecuencia de reconocimiento de una enzima de restricción, la digestión con esa enzima permiteobtener una mezcla de fragmentos de cada alelo. De esta manera, cada mezcla proporciona su propiopatrón de bandas en la electroforesis en gel. Por ejemplo, la anemia falciforme se debe a unamutación en un solo nucleótido dentro de una secuencia de restricción en el gen de la β-globina.Como se ilustra en la Figura el análisis de fragmentos de restricción por electroforesis puede distinguirlos alelos normales de este gen de los alelos que producen células falciformes. Alelo normal -globina 175 bp 201 bp Fragmento grande Ddel Ddel Ddel Ddel Alelo de la β-globina con la mutación causante de la anemia drepanocítica 376 bp Fragmento grande Ddel Ddel Ddel a) Sitios de restricción Ddel en los alelos del gen de la β-globina normal y de la anemia drepanocítica. Alelo Alelo de la normal anemia drepanocítica 2 Fragmento grande 376 bp 201 bp 175 bp b) Electroforesis de los gragmentos de restricción de los alelos Normales y de la anemia drepanocítica.Figura 4. Uso del análisis de fragmentos de restricción para distinguir los alelos normales de los aleloscausantes de la anemia drepanocítica en el gen de la β-globina. La mutación causante destruye uno de lossitios de restricción Ddel dentro del gen de β-globina. 6
  7. 7. 2. CLONACIÓN MOLECULAREl plásmido bacteriano se denomina vector de clonación, que se define como una moléculade ADN que puede transportar ADN extraño a una célula y replicarse dentro de ella. Los plásmidosbacterianos se emplean de forma universal como vectores de clonación debido a dos razones. Enprimer lugar, pueden aislarse con facilidad de las bacterias y manipularse para formar plásmidosrecombinantes mediante la inserción de ADN extraño in vitro, y luego volver a introducirse en lascélulas bacterianas. En segundo lugar, las células bacterianas se reproducen con rapidez y en elproceso multiplican todo el ADN extraño que alberguen.En la figura Nº4 se muestra un método de clonación de un gen humano específico a través de unvector de clonación representado por un plásmido bacteriano. Los números de los pasos en lafigura se explican en detalle a continuación. 1 Se comienza con el aislamiento del plásmido bacteriano de la célula de E. coli y del ADN quecontiene el gen en cuestión de células humanas cultivadas en el laboratorio. El plásmido ha sidosometido a ingeniería genética para portar dos genes que más adelante serán útiles: ampr quedetermina que las células de E. coli sean resistentes al antibiótico ampicilina, y lacZ, que codificauna beta-galactosidasa, esta enzima hidroliza el azúcar lactosa y también una molécula sintéticasimilar denominada X-gal. Dentro del gen lacZ hay una sola copia del sitio de restricciónreconocido por la enzima de restricción empleada en el siguiente paso. ADN Figura 5. Clonación molecular. 7
  8. 8. 2 La misma enzima de restricción digiere el plásmido como el ADN humano y produceextremos cohesivos o adherentes. La enzima corta el ADN del plásmido en el único sitio derestricción dentro del gen lacZ, pero también corta el ADN humano en múltiples sitios, generandovarios miles de fragmentos. Uno de los fragmentos de ADN humano transporta el gen de interés. 3 Luego de mezclar los fragmentos de ADN humano con los plásmidos cortados para permitirla formación de pares de bases entre los extremos adhesivos complementarios. A continuación seagrega una ADN ligasa que forma uniones permanentes entre los pares de bases de los plásmidosy los fragmentos de ADN humanos. Alguno de los plásmidos recombinantes resultantes contienefragmentos de ADN humano como los tres que se ilustran en la figura. Este paso también generaotros productos, como por ejemplo, un plásmido que contiene varios fragmentos de ADN humano,una combinación de dos plásmidos o una versión no recombinante del plásmido original que sevolvió a unir. 4 El ADN preparado en el paso 3 se mezcla con bacterias portadoras de una mutación de supropio gen lacZ, que las imposibilita para metabolizar la lactosa. Bajo condiciones experimentalesadecuadas, las células adquieren ADN extraño por transformación. Algunas células obtienen unplásmido recombinante portador del gen en cuestión. Sin embargo muchas otras célulasincorporan un plásmido recombinante portador de un gen distinto, un plásmido no recombinante oun fragmento de ADN humano. Estas distintas posibilidades se comentarán más adelante. 5 En este paso de la clonación, las bacterias se siembran en un medio sólido de nutrientes(agar) que contiene ampicilina y X-gal, que es una molécula similar a la lactosa. El uso de estemedio permite identificar los clones de células transformadas con un plásmido recombinante.¿Cómo podemos reconocer los clones de células portadoras de plásmidosrecombinantes? En primer lugar, solo las células con plásmidos se reproducen porque solo estas células tienen el gen ampr, que les confiere resistencia contra la ampicilina del medio. Cada bacteria que se reproduce genera un clon después de varias divisiones celulares, lo que produce un gran grupo de células que descienden de la célula original. Una vez que el clon alcanza unas 105 células se forma una masa o colonia de células visibles en la placa de agar. A medida que las células se reproducen también se copian, o clonan, todos los genes extraños transportados por los plásmidos recombinantes. En segundo lugar, el color de las colonias permite distinguir las colonias bacterianas con plásmidos recombinantes de las que tienen plásmidos no recombinantes. Las colonias con plásmidos no recombinantes y el gen lacZ intacto son de color azul porque producen beta-galactosidasa funcional, que hidroliza el X-gal en el medio y forma un producto de color azul. En cambio, en colonias con plásmidos recombinantes que tienen ADN extraño insertado en el gen lacZ no se produce beta-galactosidasa funcional; por tanto, estas colonias son de color blanco. Hasta este momento, el procedimiento permite clonar muchos fragmentos diferentes de ADN humano, no solo el que interesa en el experimento. La parte final más difícil de la clonación de un gen específico es identificar la colonia que contiene el gen entre varios miles de colonias portadoras de otros fragmentos de ADN humano. 8
  9. 9. IDENTIFICACIÓN DE CLONES PORTADORES DE UN GEN DE INTERÉSPara rastrear todas las colonias con plásmidos recombinantes (las colonias blancas del métodoexplicado antes) en busca de un clon de células que contengan un gen de interés, se puedebuscar el gen propiamente dicho o su producto proteico. En el primer sistema, que describimosaquí, se detecta el ADN del gen a través de su capacidad de formar pares de bases con unasecuencia complementaria en otra molécula de ácido nucleico, proceso denominado hibridaciónde ácido nucleico. La molécula complementaria, un ácido nucleico corto de cadena simple quepuede ser tanto ADN o ARN, se denomina sonda de ácido nucleico. Si se conoce por lo menosparte de la secuencia nucleotidica del gen en cuestión (a partir de las proteínas que codifica o desu secuencia en el genoma de una especie relacionada) se puede sintetizar una sondacomplementaria con esta molécula. Por ejemplo, si parte de la secuencia en una cadena del genestudiado es 5`GGCTAACTTAGC3` se deberá sintetizar la siguiente sonda: 3`CCGATTGAATCG5`Cada molécula de la sonda, que forma puentes de hidrógeno específicas con una cadenacomplementaria en el gen estudiado, se marca con un isotopo radioactivo o con una marcafluorescente para poder rastrearla.Por ejemplo, se pueden trasladar unas pocas células de cada colonia blanca ilustrada en lafigura 4 (paso 5) a un punto en una nueva placa de agar y permitir que se formen nuevascolonias. Una forma en que estos clones bacterianos pueden evaluarse de forma simultánea paradeterminar la presencia de ADN complementario a una sonda de ADN. Un paso esencial de estemétodo es la desnaturalización de ADN circular; esto es, la separación de sus dos cadenas. Aligual que la desnaturalización de las proteínas, este proceso se lleva a cabo con productosquímicos o calor.Una vez identificada la ubicación de una colonia portadora del gen deseado se pueden hacerproliferar algunas células procedentes de esas colonias en un medio de cultivo líquido en untanque grande para luego aislar con facilidad grandes cantidades del gen. Además, se puede usarel mismo gen clonado como sonda para identificar genes similares o idénticos de ADN de otrosorígenes, como por ejemplo, ADN de otras especies.a) VectoresDespués de unirse a un vector o vehículo de clonación, un segmento de ADN puede llegar a entraren una célula huésped y replicarse o clonarse. Los vectores son, esencialmente, moléculasde ADN transportadoras. Para servir de vector, una molécula de ADN debe tener unasdeterminadas características: Poder replicarse independientemente junto con el segmento de ADN que transporta. Contener algunos sitios de corte para enzimas de restricción, presentes sólo una vez en el vector. Estos sitios de restricción se cortan con una enzima de restricción y se utilizan para insertar segmentos de ADN cortados con la misma enzima. Tener algún marcador de selección (normalmente genes de resistencia a antibióticos o genes de enzimas que la célula huésped no tenga) para poder distinguir las células huésped que transportan el vector de las que no lo contienen. Ser fácil de recuperar desde la célula huésped. 9
  10. 10. Actualmente se utilizan varios tipos de vectores, los más utilizados son: los plásmidos y los bacteriófagos.  Plásmidos: Los plásmidos son moléculas de ADN de doble cadena extracromosómicas de origen natural que tienen un origen de replicación (ori+) y que se replica automáticamente en las células bacterianas. Para poder utilizarlos en ingeniería genética se han modificado o diseñado muchos plásmidos de manera que contengan un número limitado de sitios de restricción y genes de resistencia a antibióticos específicos. El vector pBR322 fue uno de los primeros plásmidos diseñados que se utilizó en ADN recombinante (Figura 6a).  Bacteriófagos: Corresponden a virus capaces de infectar bacterias, por lo que a su ADN se les puede insertar genes de forma similar que a los plásmidos bacterianos, para posteriormente introducirlos en bacterias que puedan clonarlo. Uno de los bacteriófagos más utilizados es el bacteriófago lambda, del cual se han identificado y ubicado todos su genes y se conoce toda la secuencia nucleotidica de su genoma (Figura 6b).a) b) Figura 6. a) muestra el plásmido pBR322, las líneas que seccionan el plásmido muestran varios sitios de cortes para distintas enzimas de restricción como EcoRI o BamHI que son las más utilizadas. Además muestra en líneas sombreadas dos genes de resistencia a antibióticos (ampicilina y tetraciclina) utilizados como marcadores de selección, y un sitio desde donde se origina la replicación del plásmido (ori+).b) muestra la morfología de un bacteriófago capaz de infectar bacterias para transferir su ADN. 10
  11. 11. 3. INGENIERÍA GENÉTICALa posibilidad de clonar genes individuales para el análisis marcó el comienzo de una era deprogreso sin precedentes en la investigación. A la vez, este desarrollo fue acompañado de grandesanuncios de los posibles avances médicos y otras aplicaciones. La capacidad para diseñargenéticamente cualquier tipo de célula u organismo es un largo camino por recorrer. Pero nosestamos acercando a esta posibilidad, lo que ha generado entre los científicos mucho entusiasmoy controversia. Vectores de expresión y formación de productos génicos.Una variedad de vectores especializados se han construido desde el desarrollo de la tecnología declonación. Un tipo muy importante de vector, es el de expresión. Estos vectores contienen lassecuencias necesarias para dirigir la expresión de ADN insertado en un tipo celular específico, esdecir, las secuencias correctas para permitir la transcripción y traducción del gen. La producciónde proteínas recombinantes en bacterias, por ejemplo, utiliza vectores de expresión conpromotores bacterianos y otras regiones de control. Las bacterias transformadas por dichosvectores sintetizan grandes cantidades de la proteína codificada por el ADN insertado. Productosfarmacéuticos se han producido de esta manera, la primera de las cuales era la insulina, quese utiliza para tratar la diabetes. Organismos transgénicosLa capacidad de introducir los genes en una célula huésped, o para introducir genes de lamisma célula, es un tema del cual se encarga la ingeniería genética. Un animal que contiene ungen que se ha introducido sin el uso de la reproducción convencional se llama un animaltransgénico. Vamos a explorar una serie de usos de animales transgénicos en medicina y laagricultura, pero es importante darse cuenta de que su uso original era para la investigaciónbásica.La capacidad para diseñar genes permite que unexperimentador se plantee preguntas que nunca podríaplantearse de otra manera. Un ejemplo dramático fue el usodel gen “sin ojos” de ratones en Drosophila. Cuando este gende ratón se introdujo en Drosophila, se originó una moscatransgénica sin ojos, quedando demostrada la capacidad desustituir un gen de Drosophila en la organización de laformación de ojos. Incluso podría causar la formación de ojosen lugares incorrectos cuando se expresa en el tejido quenormalmente no forman ojos. Este resultado muestra que laformación del ojo compuesto de un insecto no es tandiferente de la formación del ojo de los vertebrados.Una de las formas de obtener un animal transgénico esmicroinyectando el gen en el núcleo de un cigoto, luego elembrión se implanta en un útero de la misma especie y seobtiene un organismo transgénico con el gen de interés, porejemplo capaz de producir una proteína humana (Figura 7). 11 Figura 7. Formación de un animal transgénico.
  12. 12. En plantas, uno de los métodos más utilizados es introducir genes, en el tejido meristemático(embrionario), capaz de originar una planta completa, a través del plásmido Ti recombinantecomo vector. Se introduce el gen de interés en el plásmido Ti y se introduce en bacteriasAgrobacterium tumefaciens (Figura 8, izquierda), con las cuales se infectan las célulasmeristemáticas. Estas células infectadas formaran un callo, que posteriormente se incuba conhormonas vegetales, para producir una planta transgénica completa, con el gen de interés, comopor ejemplo el gen de la luciferasa. (Figura 8, derecha)Figura 8. Utilización del plásmido Ti para producir plantas transgénicas. A la derecha se presenta una plantade tabaco expresando un gen de la luciérnaga, el gen de la luciferasa que codifica una enzima que catalizauna reacción química que libera energía luminosa. 12
  13. 13.  Organismos KnockoutUna de las tecnologías más importantes para fines de investigación es la mutagénesis in vitro, queconsiste en la capacidad de crear mutaciones en cualquier sitio en un gen clonado para examinarsu efecto sobre la función. Un objetivo es reemplazar un gen normal o silvestre por una copiamutante, para probar la función del gen mutado. Desarrollado por primera vez en la levadura,esta técnica se ha extendido ahora al ratón.Algunos ratones tienen genes que han sido deliberadamente "apagados". Estos ratones,llamados ratones knockout de genes, se producen por mutagénesis que generan una pérdida de lafunción de un gen. Los ratones knockout son muy útiles para estudiar la función de genes yenfermedades genéticas, ya que, un investigador puede observar los cambios específicosen la expresión de genes y rasgos. Por ejemplo, los científicos están usando un ratón knockoutde genes para estudiar la obesidad, como se puede ver en la figura Nº8. El ratón knockout (a laizquierda) no tiene un gen funcional de una proteína llamada leptina, que ayuda a controlar laingesta de alimentos. Los investigadores están usando este tipo de ratón para estudiar laobesidad. Figura 9. A la izquierda ratón knockout de leptina, a la derecha ratón normal o silvestre.4. APLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGÍAa) APLICACIONES MÉDICAS Diagnóstico y tratamiento de enfermedadesEs una de las más recientes innovaciones para el diagnóstico de enfermedades contagiosas, enespecial, a través del uso de los PCR. Por ejemplo, como la secuencia del ARN genómico delVIH se conoce, es posible usar un PCR para amplificar, y así detectar, el ARN del VIH enla sangre o muestras de tejido.Los médicos pueden ahora diagnosticar cientos de enfermedades genéticas usando PCRcon primers que reconocen los genes asociados con ese desorden. El producto de ADNamplificado es luego secuenciado para revelar la presencia o ausencia de la mutación causante dela enfermedad. Entre los genes para enfermedades humanas que han sido identificadas están laanemia falciforme, hemofilia, fibrosis quística, enfermedad de Huntington y distrofiamuscular de Duchenne. Los individuos afectados con enfermedades como estas pueden seridentificados antes de presentar los síntomas, incluso antes de nacer. Un PCR puede también serusado para identificar portadores asintomáticos de enfermedades recesivas. 13
  14. 14. Las técnicas antes descritas también han permitido mejoras el tratamiento de enfermedades.Analizando la expresión de muchos genes en pacientes con cáncer de mamas, investigadores hanencontrado correlaciones entre los patrones de expresión de varios genes con la posibilidad dedesarrollar el cáncer. El análisis de la expresión génica permite a médicos y pacientes acceder ainformación valiosa para considerar opciones de tratamiento. Terapia GénicaLa introducción de genes en individuos afectados con fines terapéuticos, tiene granpotencial para el tratamiento de un número relativamente pequeño de desórdenes asociados sóloa un gen defectuoso. En teoría, un alelo normal del gen defectuoso puede ser insertado encélulas somáticas del tejido afectado por el desorden.Para que la terapia génica de células somáticas sea permanente, las células que reciben el alelonormal deben ser las únicas que se multipliquen a lo largo de la vida del paciente. Las células dela médula ósea, las que incluyen células madre que originan todas las células sanguíneas, son losprimeros candidatos.La figura 9 muestra un procedimiento posible de terapia génica para un individuo cuyas célulasde su médula ósea no puedenproducir una enzima vital porposeer un único gen defectuoso. Siel tratamiento es exitoso, las células dela médula ósea del pacientecomenzarán a producir la proteínafaltante, y el paciente puede curarse.El procedimiento mostrado en la figurafue usado en pacientes con un tipo deInmunodeficiencia Severa Combinada(SCID). En una prueba realizada enFrancia en el 2000, diez niños con SCIDfueron tratados con el mismoprocedimiento. Siete de estos pacientesmostraron mejoras significativas luegode dos años. Sin embargo, tres deestos pacientes desarrollaron leucemia,y uno de ellos falleció.Así la terapia génica plantea variascuestiones técnicas. Por ejemplo ¿cómose puede asegurar que la inserción deun gen no afecta otras funcionescelulares? O ¿cómo se puede controlarla actividad de los genes transferidospara que sinteticen una cantidadapropiada del producto? Figura 10. Terapia génica en células de la médula ósea. 14
  15. 15. b) APLICACIONES FARMACÉUTICAS● Síntesis de pequeñas moléculas para ser usadas como drogas. La determinación de la secuencia y estructura de proteínas cruciales para la sobrevivencia de células tumorales ha permitido la identificación de pequeñas moléculas que combaten ciertos tipos de cánceres bloqueando la función de estas proteínas. Las drogas que trabajan de este modo han sido usadas exitosamente para tratar la leucemia mielogénica crónica (CML), algunos tipos de cáncer de mama y de pulmón. Estas aplicaciones sólo son posibles en cánceres para los que la base molecular es bien conocida.● Producción de proteínas en cultivos celulares. Por medio de las técnicas de ingeniería genética, es posible producir grandes cantidades de proteínas que naturalmente están presentes en pequeñas cantidades. Las células que reciben el gen de interés pueden sintetizar y secretar una proteína, simplificando la tarea de purificación por métodos bioquímicos tradicionales. Entre los primeros productos farmacéuticos “manufacturados” de esta forma, se encuentra la insulina humana y la hormona del crecimiento.● Producción de proteínas en animales. En algunos casos, en vez de usar sistemas celulares para producir grandes cantidades de productos proteicos, los farmacéuticos pueden usar animales completos. Pueden introducir un gen desde un animal en el genotipo de otro individuo, a menudo de diferentes especies. A este individuo se le denomina animal transgénico. Este animal ahora puede actuar como una fábrica farmacéutica. Por ejemplo, el gen para una proteína sanguínea humana como la antitrombina puede ser insertada en el genoma de una cabra donde la vía de secreción del producto transgénico es la leche del animal (Figura Nº12). La proteína luego es purificada desde la leche (que es más fácil que la purificación desde cultivos celulares). Los investigadores también han creado pollos transgénicos que expresan grandes cantidades de un producto en sus huevos. Las compañías biotecnológicas consideran las características de los posibles animales candidatos para decidir cuál usar para la manipulación. Por ejemplo, una cabra se reproduce más rápido que una vaca, y es posible obtener más proteínas de la leche de cabra que de la leche de otros mamíferos que se reproducen más rápidamente, como los conejos. Figura 11. Animal transgénico que produce en su leche una proteína sanguínea. 15
  16. 16. Las proteínas humanas producidas por animales transgénicos pueden diferir sutilmente en algunos aspectos de la proteína naturalmente producida. Por esto, las proteínas deben ser probadas cuidadosamente para asegurarse que estas (u otros contaminantes de los animales domésticos), no provoquen reacciones alérgicas u otros efectos adversos en pacientes.c) APLICACIONES EN AGRICULTURA Y GANADERÍALos científicos están trabajando para aprender más acerca de genomas de plantas y animales deimportancia agronómica. Por algunos años, han usado la tecnología del ADN en un esfuerzo pormejorar la productividad agrícola.Las tecnologías del ADN permiten a los científicos producir animales transgénicos. Losobjetivos de crear un animal transgénico son a menudo los mismos objetivos que a críatradicional, por ejemplo crear una oveja con lana de mejor calidad, o un cerdo con carne menosgrasa, o una vaca que madure en un tiempo más corto. Los científicos pueden, por ejemplo,identificar y clonar un gen que provoque el desarrollo de músculos más grandes en el ganado ytransferirlo incluso a una oveja. Sin embargo, problemas como una menor fertilidad o unaumento en la susceptibilidad a enfermedades no son extraños en animales que portangenes de otras especies. La salud animal es un punto importante a considerar cuando sedesarrollan animales transgénicos.En agricultura los científicos ya cuentan con un número de plantas para cultivos con genes paracaracteres deseables, tales como maduración tardía y resistencia a enfermedades,herbicidas, insecticidas, e incluso resistentes a condiciones del suelo como la salinidad.Las plantas son fáciles de manipular genéticamente a diferencia de la mayoría de los animales.Para muchas especies de plantas, un simple tejido puede crecer en un cultivo para originar unaplanta adulta. Así, la manipulación genética puede llevarse a cabo en una simple célula somática yluego esta célula puede ser usada para originar un organismo completo con las nuevascaracterísticas.El vector más comúnmente usado para introducir genes nuevos en células vegetales es unplásmido, llamado plásmido Ti, obtenido desde la bacteria Agrobaterium tumefaciens. Esteplásmido integra segmentos de su ADN, en el ADN cromosómico de la célula vegetalhospedera.¿Cómo los biotecnólogos podrían solucionar problemas agrícolas? (Tabla Nº1). Tabla 1. Biotecnología y problemas agrícolas a solucionar. 16
  17. 17. Preguntas de selección múltiple1. Se utilizó una misma enzimas de restricción para un gen que codifica un factor de coagulación, siendo el gen N el alelo normal y el gen D el alelo causante de una enfermedad. La imagen muestra los patrones obtenidos de una electroforesis para ambos fragmentos. Con esta información es correcto inferir que el alelo I) causante de la enfermedad posee dos sitios de restricción. II) normal es más largo que el alelo causante de la enfermedad. III) normal posee más sitios de restricción que el alelo causante de la enfermedad. A) Solo I. B) Solo II. C) Solo III. D) Solo I y II. E) I, II y III.2. Queda mejor definido un vector de clonación como A) un gen con resistencia a antibióticos. B) una bacteria modificada con un gen exógeno. C) un virus o bacteria que replica material genético con facilidad. D) un organismo utilizado para sintetizar proteínas recombinantes. E) una molécula de ADN a la cual se le pueden introducir nuevos genes con facilidad.3. La amplificación del ADN in vitro por la técnica de reacción en cadena de la polimeraza (PCR), se realiza en los siguientes pasos I) desnaturalización (separación de las hebras de ADN). II) hibridación (cebadores o primers hibridan el ADN de cadena simple). III) elongación (la ADN polimeraza extiende a los colaboradores en dirección 5’ – 3’) Es (son) correcta(s) A) solo I. B) solo II. C) solo III. D) solo I y II. E) I, II y III. 17
  18. 18. 4. El gráfico muestra la concentración relativa de ADN durante la realización de un PCR, en donde la letra A señala un aumento de la temperatura y la letra B una disminución. Con esta información es correcto afirmar que A) un ciclo de PCR tarda unos tres minutos. B) la ADN polimerasa no actúa a altas temperaturas. C) el ADN posee solo hebras simples en el primer minuto. D) no es aplicable la técnica del PCR. E) la temperatura no afecta la velocidad de reacción.5. Una forma que permite curar permanentemente una enfermedad genética es I) modificar el estilo de vida del individuo afectado. II) cambiar la secuencia de ADN afectada. III) translocar el gen afectado. A) Solo I. B) Solo II. C) Solo I y II. D) Solo II y II. E) I, II y III.6. Las bacterias protegen su ADN de los virus por la acción de enzimas de restricción o endonucleasas de restricción. Al respecto, es correcto afirmar que el hombre las utiliza para I) combinar moléculas de ADN de diferente origen. II) combatir enfermedades bacterianas. III) introducir un segmento de ADN en moléculas de ADN transportadoras. A) Solo I. B) Solo II. C) Solo III. D) Solo I y II. E) Solo I y III.7. Para insertar un gen de interés en el plásmido, como lo muestra la figura, se debe utilizar A) PCR. B) mapas de restricción. C) enzimas de restricción. D) sitios de restricción. E) bacteriófago lambda. 18
  19. 19. 8. A continuación se muestran algunas etapas para generación de ratones capaces de producir una proteína vegetal en su leche. L M Z Es correcto plantear que se señala con la letra I) L un vector de clonación. II) M un ADN recombinante. III) Z un ratón knockout. A) Solo II. B) Solo I y II. C) Solo I y III. D) Solo II y III. E) I, II y III.9. Para la formación de un plásmido recombinante es imprescindible la utilización de I) ADN ligasa. II) ADN polimerasa. III) enzima de restricción. A) Solo I. B) Solo I y II. C) Solo I y III. D) Solo II y III. E) I, II y III. 19
  20. 20. 10. Es común utilizar árboles genealógicos y análisis genéticos para determinar el genotipo de una familia portadora de una enfermedad. A continuación se muestra un árbol genealógico y los resultados de una electroforesis, para el gen en cuestión, en donde cada individuo se señala con una letra distinta. Con estos resultados es correcto plantear que el individuo I) A es portador del gen causante de la enfermedad. II) C es heterocigoto. III) E es homocigoto recesivo. A) Solo I. B) Solo III. C) Solo I y III. D) Solo II y III. E) I, II y III.11. Sobre la electroforesis es correcto plantear que los fragmentos de I) igual tamaño forman una misma banda. II) menor longitud quedan en la superficie. III) ADN viajan hacia el cátodo. A) Solo I. B) Solo II. C) Solo III. D) Solo I y II. E) Solo I y III.12. Una proteína humana producida por un animal transgénico en el humano puede I) ser algo distinta de la producida por él. II) provocarle alergias. III) bloquear su producción natural. Es (son) correcta(s) A) solo I. B) solo II. C) solo III. D) solo I y II. E) I, II y III. 20
  21. 21. 13. Las plantas transgénicas pueden adquirir nuevas características que les permiten I) crecer en ambientes con condiciones adversas. II) aumentar su concentración de nutrientes. III) desarrollar resistencia a plagas. A) Solo I. B) Solo II. C) Solo I y II. D) Solo II y III. E) I, II y III.14. ¿Cuál de las siguientes herramientas biotecnológica está mal asociada a su función? A) Enzimas de restricción – formación de plásmidos recombinantes. B) ADN ligasa – formación de cortes adhesivos. C) ADN polimerasa – PCR. D) Electroforesis – separación de fragmentos de ADN. E) Vector de clonación – transporte de genes.15. Las plantas son más fáciles de manipular por ingeniería genética que los animales, porque A) los genes de las plantas no contiene intrones. B) existen más vectores disponibles para células vegetales. C) una célula somática de una planta puede originar una planta completa. D) se pueden microinyectar genes en núcleos vegetales. E) las células vegetales no poseen endonucleasas. 21
  22. 22. RESPUESTAS Preguntas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Claves C E E A B E C B C E A D E B C DMDO-BM34Puedes complementar los contenidos de esta guía visitando nuestra Web http://www.pedrodevaldivia.cl/ 22

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