Contributo à Diferenciação de Leveduras de Interesse Enológico por Perfis Isoenzimáticos
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1) O documento descreve um estudo sobre a identificação de espécies de leveduras de interesse enológico através de perfis isoenzimáticos e sequenciamento genético. 2) Foram analisadas 32 estirpes de 19 espécies de leveduras encontradas em diferentes ambientes vínicos. 3) Os resultados demonstraram que a análise isoenzimática e sequenciamento do rDNA permitiram diferenciar as espécies estudadas.
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Contributo à Diferenciação de Leveduras de Interesse Enológico por Perfis Isoenzimáticos
- 1. Contributo à diferenciação de leveduras de interesse enológico por perfis isoenzimáticos Nuno Pedro Herculano Pimentel
- 2. Objectivos do trabalho Focou-se a aplicabilidade da análise isoenzimática na identificação de espécies de levedura relevantes ao processo de vinificação. Para tal: • Visou-se dar continuidade a estudos anteriores, complementando a base de dados de perfis isoenzimáticos de leveduras existente na EVN.
- 3. Estirpes em estudo Efectuou-se uma pesquisa bibliográfica de espécies de leveduras encontradas em ambientes vínicos, e assim: • Fez-se a selecção de espécies de leveduras relevantes ao processo de vinificação, não presentes na base de perfis isoenzimáticos de leveduras da EVN. Os diversos ambientes vínicos presentes nas diferentes etapas de fabrico do vinho podem ser (Sponholz, 1993): Vinha Adega: processos pré-fermentativos fermentação alcoólica processos pós-fermentativos
- 4. Vinha •Dispersão entomófila Em microbiotas associados com abelhas (género Apis) foram identificadas as espécies de leveduras: – géneros Metschnikowia e Wickerhamiella; – Wickerhamiella domercqiae. •Uvas Em microbiotas associados com uvas foram identificadas as espécies de leveduras: – Candida pulcherrima (Metschnikowia pulcherrima); – Hanseniaspora uvarum / Kloeckera apiculata; – Hanseniaspora osmophila; – Kloeckera apis (Hanseniaspora guilliermondii); – Saccharomyces veronae (Pichia mexicana); – Lodderomyces elongisporus. •Uvas infectadas por Botrytis cinerea Especialmente em más condições de vindimas, vindimas com pluviosidade. – Torulopsis bacillaris (Candida stellata); – Candida vini (Pichia fluxuum); – Pichia carsonii.
- 5. Adega • Fase pré-fermentativa As espécies Metschnikowia pulcherrima e Kloeckera apiculata (anamorfo de Hanseniaspora uvarum) tratam-se das espécies mais encontradas no microbiota proveniente das uvas, nas fases pré-fermentativas e de início de fermentação (Rosini et al.,1982). – Candida pulcherrima (Metschnikowia pulcherrima); – Hanseniaspora uvarum / Kloeckera apiculata; – Kluyveromyces thermotolerans; – Torulopsis bacillaris (Candida stellata); – Candida vini (Pichia fluxuum). • Fase fermentativa – Torulopsis bacillaris (Candida stellata) - no início / durante a primeira fase fermentativa); – C. mycoderma (Pichia fluxuum); – C. pulcherrima (Metschnikowia pulcherrima); – Debaryomyces hansenii; – Hanseniaspora uvarum / Kloeckera apiculata; – Kloeckera apis (Hanseniaspora guilliermondii); – Kluyveromyces thermotolerans; – Lodderomyces elongisporus; – Saccharomyces veronae (Pichia mexicana); – S. exiguus; – Saccharomycodes ludwigii.
- 6. Adega • Fase pós-fermentativa Em vinhos armazenados foram detectadas as espécies: – géneros Dekkera / Brettanomyces; • Kloeckera apiculata (anamorfo de Hanseniaspora uvarum); • Torulopsis bacillaris / Torulopsis stellata (Candida stellata); • Torulopsis domercqii (Wickerhamiella domercqiae); • Candida mycoderma (Pichia fluxuum); • Saccharomycodes ludwigii. Em vinificações especiais como é o caso do vinho Xerez, foi identificada a espécie: – Saccharomyces exiguus. Em linhas de engarrafamento ou em vinhos engarrafados foram isoladas as espécies: ― Torulopsis stellata (Candida stellata); ― Candida pulcherrima (Metschnikowia pulcherrima); ― Candida mycoderma / C. vini (Pichia fluxuum); ― Lodderomyces elongisporus; ― Saccharomyces baillii var. baillii (Zygosaccharomyces baillii ).
- 7. Métodos de identificação de leveduras Análise de perfis electroforéticos: Proteína total Isoenzimas Em leveduras a análise isoenzimática tem sido aplicada: Em estudos taxonómicos: • na delimitação de espécies • na descrição formal da espécie • no esclarecimento de relações anamorfo/ teleomorfo No estudo de populações Em estudos epidemiológicos Sequenciação da região D1/D2 do rDNA 26S Em leveduras a sequenciação do rDNA 26S (D1/D2) tem sido usada: No estudo dos relacionamentos filogenéticos entre as espécies de leveduras; Na identificação de leveduras ao nível da espécie;
- 8. Material e métodos Espécies de leveduras analisadas Candida cantarellii (2); ( Candida stellata (2); ( Candida vanderwaltii (1); Pichia mexicana (1); ( Pichia fluxuum (2); ( Kluyveromyces thermotolerans (3); Metschnikowia pulcherrima (3); ( Pichia carsonii (3); Saccharomyces exiguus (3); Wickerhamiella domercqiae (2); ( Lodderomyces elongisporus (1); Debaryomyces hansenii var. fabryii (1); Dekkera naardenensis (1); ( Hanseniaspora guilliermondii (1); Hanseniaspora occidentalis (1); ( Hanseniaspora osmophila (1); Hanseniaspora uvarum (2); ( Saccharomycodes ludwigii (1); Schizosaccharomyces pombe (1). Total: 32 estirpes; 19 espécies e 12 géneros
- 9. Material e métodos Análise isoenzimática Crescimento das Rebentamento Electroforese Extracto proteíco células das células (PAGE-nativa) Solução de revelação de actividade enzimática (EST, LDH, ADH, ACP e G6PD) (37ºC, ao abrigo da luz) •Mobilidade electroforética relativa (Rm) Nota Rm = a / b a b Foram efectuados duplicados de crescimento em 10 % a – distância da migração da banda de actividade das estirpes analisadas, enzimática que foram submetidos à b – distância da migração do corante de referência análise isoenzimática juntamente com as estirpes em estudo.
- 10. Material e métodos •Análise numérica dos resultados Matriz dos resultados Matriz de semelhanças - coeficiente de DICE Rm EVN EVN EVN EVN EVN … Estirpes E0.21E0.28E0.32E0.40E0.42E0.48 … 365 366 367 368 369 … EVN 365 0 0 0 0 0 1 … EVN 365 Sii Sij Sik … … EVN 366 0 0 0 0 1 0 … EVN 366 Sji Sjj Sjk … EVN 367 0 0 0 0 0 0 … EVN 367 Ski Skj Skk … EVN 368 0 0 0 0 0 0 … EVN 368 … … … … EVN 369 0 0 0 0 0 0 … EVN 369 … .. EVN 370 . 0 0 0 0 0 1 … . . . … … … … … … Dendrograma Método de aglomeração com médias não-ponderadas (UPGMA)
- 11. Material e métodos • Sequenciação da região D1/D2 do rDNA 26S ITS5 NL1 NL4 LR6 5S NTS2 ETS 17 – 18 S ITS1 5.8S ITS2 25 – 28 S NTS1 5S D1 / D2 Esquema dos genes do rRNA com indicação da localização dos primers utilizados e da região sequenciada. Reacção de Extracção do Amplificação DNA por PCR Purificação do sequenciação, DNA primers ITS5 e LR6 produto PCR primers: • NL1 • NL4 Observação Observação Observação do prod. do DNA do prod. PCR PCR purificado extraído Sequenciação no sequenciador automático CEQ 8000
- 12. Resultados obtidos • Análise isoenzimática – perfis isoenzimáticos obtidos EST LDH ADH ACP G6PD 384T 384T 384T 384T 384T 392 392 392 392 392 385 385 385 385 385 395T 395T 395T 395T 395T 365T 365T 365T 365T 365T 369T 369T 369T 369T 369T 381NT 381NT 381NT 381NT 381NT 381a 381a 381a 381a 381a 382 382 382 382 382 383 383 383 383 383 391T 391T 391T 391T 391T 375T 375T 375T 375T 375T 376 376 376 376 376 377 377 377 377 377 396T 396T 396T 396T 396T 368T 368T 368T 368T 368T 386T 386T 386T 386T 386T 394T 394T 394T 394T 394T 367NT 367NT 367NT 367NT 367NT 393T 393T 393T 393T 393T 378T 378T 378T 378T 378T 380 380 380 380 380 378a 378a 378a 378a 378a 379 379 379 379 379 379a 379a 379a 379a 379a 370NT 370NT 370NT 370NT 370NT 371 371 371 371 371 390T 390T 390T 390T 390T 389T 389T 389T 389T 389T 373 373 373 373 373 387T 387T 387T 387T 387T 374 374 374 374 374 372T 372T 372T 372T 372T 388T 388T 388T 388T 388T 366 366 366 366 366
- 13. Resultados obtidos • Análise isoenzimática – análise numérica (EST+LDH+ADH+ACP+LDH) r = 0.88 365T 366 Candida cantarellii 369T Pichia mexicana 372T 374 Kluyveromyces thermotolerans T Debaryomyces hansenii var. fabryii 388 367 Candida stellata 393 394T Hanseniaspora uvarum 378T 378a 380 Pichia carsonii 379 379a 375T 376 Metschnikowia pulcherrima 377 381NT 381a Saccharomyces exiguus 382 383 391 Hanseniaspora occidentalis 384T Wickerhamiella domercqiae 392 Hanseniaspora osmophila 386T Lodderomyces elongisporus 385 Wickerhamiella domercqiae 395T Saccharomycodes ludwigii 368T Candida vanderwaltii 373 Kluyveromyces thermotolerans 387T Candida stellata 370NT Pichia fluxuum 371 390 Hanseniaspora guilliermondii 389T Dekkera naardenensis 396T Schizosaccharomyces pombe 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 Índice de semelhança
- 14. Resultados obtidos • Análise isoenzimática – análise numérica (EST+LDH+ADH+ACP+LDH) r = 0.88 365T 366 Candida cantarelii 369T 372T 374 Kluyveromyces thermotolerans 388T 367 393 Candida stellata 394T 378T 378a 380 379 379a 375T 376 377 381NT 381a 382 383 391 384T 392 386T 385 Wickerhamiella domercqiae 395T 368T 373 Kluyveromyces thermotolerans 387T 370NT 371 Candida stellata 390 389T 396T 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 Índice de semelhança
- 15. Resultados obtidos Sequenciação da região D1/D2 do rDNA 26S EVN 366 EVN 365T EVN 367 EVN 387T 1,1 % dissemelhança 9,0 % dissemelhança EJ1 – Candida EVN 367 EJ1 10-372 10-372 – Candida cf. stellata 0,0 % dissemelhança EVN 373 EVN 372T EVN 385 EVN 384T 0,2 % dissemelhança 0,4 % dissemelhança A variabilidade intraespecífica ≤ 1% de substituições nucleotídicas (Kurtzman e Robnett, 1998)
- 16. 260 253 255 r = 0.88 É necessário efectuar uma comparação 256 251 167 262 166 267 de mobilidades electroforéticas (Rm) 237 263 258 261 264 similares no mesmo gel. 257 265 266 268 254 252NT 259 216 230 I 382 383 381NT 329T 222 284T 285 Agrupamento I 299 302 292 293 298 301 290 291 303 287 269 271T 270 272 273 274 276 277 275NT 278 235 355 242T 243 Agrupamento II 244 245 248 246 247 249 390 279NT 280 281 283 282 II 370NT 371 III 378T Agrupamento III 380 379 212 223 217 219 213 215 218 224 229 227 220 221 225 228 226T 312NT 310 311 340 341 342 Agrupamento IV 384T • Saccharomycodes ludwigii 392T 391T 345 346NT 231T 368T 373 387T 354T IV 348 349 395T V 339 Agrupamento V 394T • Hanseniaspora uvarum 393 367NT 305 308 307 388T 168 VI 350 351 396T 294 288 289 300 Agrupamento VI 295 • Schizosaccharomyces pombe 336 337 338T 326NT 327 372T 374 232 234 233 241NT 238 239 333T 334 335 330T 331 332 Agrupamento VII 385 236 VII 375T 376 377 343 344 VIII 386T 389T 296 369T 304 306 297 Agrupamento VIII • Lodderomyces elongisporus 286 309 365T 366 325 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 Índice de semelhança
- 17. Conclusões A análise dos perfis isoenzimáticos obtidos na generalidade conseguiu efectuar a distinção das 19 espécies de leveduras em estudo. • Verificou-se que 4 das 32 estirpes analisadas, não agruparam com as estirpes tipo da sua espécie Com os resultados da sequenciação do rDNA 26 S (D1/D2), verificou-se que: • Para 2 das 4 estirpes analisadas a sequenciação do rDNA confirmou uma incorrecta identificação na espécie (EVN 366- Candida cantarellii e 367- C. stellata); • Para as restantes 2 estirpes confirmou a sua classificação (EVN 373 - Kluyveromyces thermotolerans e 385 - Wickerhamiella domercqiae). Assim: É necessário o estudo de sistemas enzimáticos adicionais para permitir a identificação e discriminação das espécies Kluyveromyces thermotolerans e Wickerhamiella domercqiae). A inclusão dos resultados obtidos, na análise isoenzimática, na BD de perfis isoenzimáticos de leveduras existente na EVN, permitiu a diferenciação da generalidade das 50 espécies de leveduras associadas com a indústria de vinificação. • Para algumas espécies é necessário focar outros sistemas enzimáticos adicionais para permitir a sua diferenciação mediante a análise electroforética.
- 18. Referências bibliográficas Barnett, J., A.; M., A., Delaney; E., Jones; A., B., Magson; B., Winch.1972. The number of yeasts associated with wine grapes of Bordeaux. Arch. Microbiol., 83, 52-55. Bréchot, P.; J., Chauvet; H., Girard.1962. Identification des levures d'un moût de Beaujolais au cours de sa fermentation. Ann. Technol. Agric., 11, 235-244. Castelli, T.; S. Georgantas.1970. Gli agenti della fermentazione vinaria nel nord della Grecia. Vini d'Italia,12, 185-191. Davenport, R., R.1974. Microecology of yeasts and yeast-like organisms associated with an English vineyard. Vitis, 13, 123-130. Duarte, F., L.2000. Perfis electroforéticos de isoenzimas na diferenciação de leveduras de interesse enológico. Tese Doutoramento, Universidade do Minho, Braga. Fleet, G., H.; S., Lafon-Lafourcade; P., Ribéreau-Gayon.1984. Evolution of yeasts and lactic acid bacteria during fermentation and storage of Bourdeaux wines. Appl. Environ. Microbiol., 48, 1034-1038. Gandini, A.1969. Microbiological investigations of Moscato d'Asti. Infection occurring during bottling and the effect of using an iodine-containing compound. Vini d'Italia, 11, 455-527 (abstract). Goto, S.; H., Oguri; M., Yamazaki.1984. Yeast population in botrytized grapes. J. Inst. Enol. Vitic. Yamanashi Univ., 19, 1-5 (abstract). Hidalgo, P.; M., Flores.1994. Occurrence of the killer character in yeasts associated with Spanish wine production. Food Microbiol., 11, 161-167 (abstract). Kurtzman, C., P.; C., J., Robnett.1998. Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences. Antonie van Leeuwenhoek, 73, 331-371. Kyselakova, M.1994. Observation of yeast occurrence in wine cellars. Acta Universitatis Agriculturae Facultas Horticulture, Bro., 9, 11-15 (abstract). Kyselakova, M.1995. Investigation no the occurrence of Candida sp. in cellars and cellar equipment. Vinohrad, Bratislava., 33, 13-14 (abstract). Lachance, M., A.; W., T., Starmer; C., A., Rosa; J., M., Bowles; J., Stuart; F., Barker; D., H., Janzen.2001.Biogeography of the yeasts of ephemeral flowers and their insects. FEMS Yeast Res. I, 1-8. Longo, E.; J., Cansado; D., Agrelo; T.,G., Villa.1991. Effect of climatic conditions on yeast diversity in grape musts from northwest Spain. Am. J. Enol. Vitic., 42, 141-144. Malfeito-Ferreira, M.1996. Perfis de ácidos gordos e toxicidade de ácidos fracos em leveduras de contaminação de alimentos. Tese Doutoramento, Instituto Superior de Agronomia, U.T.L., Lisboa. Maiquez, E., G.1995. Los microorganismos del Jerez. Microbiología Sem., 11, 51-58. Minarik, E.1971. Etude de la flore levurienne des régions viticoles périphériques en Tchécoslovaquie. Conn. Vigne Vin., 5, 185-197. Minarik, E.1982. Levures de contamination des vins embouteillés. Bulletin OIV, 628, 414-419. Nadal, D.; B., Colomer; B., Piña.1996. Molecular polymorphism distribution in phenotypically distinct populations of wine yeast strains. Appl. Environ. Microbiol., 62, 1944-1950. Pardo, I.; M., J., García; M., Zúñiga; F., Urubu.1989. Dynamics of microbial populations during fermentation of wines from Utiel-Requena region of Spain. Appl. Environ. Microbiol., 55, 539-541. Parish, A., E.; D., E., Carrol.1985. Indigenous yeasts associated with muscadine (Vitis rotundifolia) grapes and musts. Am. J. Enol. Vitic., 36, 165-169. Peynaud, E.; S., Domerq.1959. A review of microbiological problems in wine-making in France. Am. J. Enol. Vitic., 10, 69-77. Rosini, G.; F., Federici; A., Martini.1982. Yeast flora of grape berries during ripening. Microb. Ecol., 8, 3-89. Sneath, P., H., A.; R., R., Sokal.1973. Numerical taxonomy, the principles and practice of numerical classification. W. W. Freeman and Company, São Francisco. Stollarova, V.1992. Populations of yeasts on grapes, Vitis vinifera L., in the vinicity of the nuclear power station at Mochovce. Biologia Bratislava., 47, 697-701 (abstract). Sponholz, W., R.1993. Wine spoilage by microorganisms, In: Wine microbiology and biotechnology, (G., H., Fleet ed.), 395-420. Harwood academic publishers, Chur. Van der Walt e van Kerken (1958; cit. in Duarte, 2000) Van Zyl e Du Plessis (1961; cit. in Davenport, 1974).