1. Développement d’une méthode de confirmation par GC-C-IRMS
en vue de déterminer l’origine des métabolites de la boldénone
dans l’urine de bovin
Mohamed TALBI
Encadrant: Emmanuelle BICHON
Soutenance M2 Pro ACBPI
LABERCA, 6 septembre 2010
Laboratoire d’Etude des Résidus et Contaminants dans les Aliments
Ecole Nationale Vétérinaire, Agroalimentaire et de l’Alimentation Nantes Atlantique
www.laberca.org – www.saraf-educ.org

2. Plan
1. Introduction & contexte
2. Optimisation de la méthode
4. Conclusion & Perspectives
3. Analyse sur un échantillon d’urine réel par GC-C-IRMS

3. 3/19Mohamed, Soutenance M2 Pro ACBPI , 6 Septembre 2010
1. Introduction & contexte
Réglementation: Fin 80’s ,hormones stéroïdes en élevage: interdiction dans UE (directive
96/22/EC)
Contrôle, méthodes d’analyses, application de la réglementation (96/23/EC)
Hormones stéroïdes synthétiques: Bonne maîtrise d’extraction (sécurité alimentaire, dopage,…), matrices biologiques
Mais…
Contrôle des hormones stéroïdes « naturelles »: Cas différent, double statut (exogène ou endogène).
Cas de la boldénone

4. 4/19Mohamed, Soutenance M2 Pro ACBPI , 6 Septembre 2010
1. Introduction & contexte
Production par l’organisme ou conséquence d’une administration exogène ? (deux publications)
Fin 90’s: Détection urinaires de 17α-Boldénone ou 17β-Boldénone = administration illégale
(Arts et al.,1996): Urine blanches de bovins, 25 % des échantillons testés par GC-MS, traces 17α-Boldénone (0,1 à 2,7 ppb)
DG SANCO Expert Meeting 2003:
[17α-boldénone] > 2 µg.L-1
= échantillon suspect
Réunion de LNR UE 2003: Présence de 17α-Boldénone et 17β-Boldénone dans les fèces
- « La présence de 17α-Boldénone utilisation illégale »
Analyse supplémentaire obligatoire = Confirmation

5. 5/19Mohamed, Soutenance M2 Pro ACBPI , 6 Septembre 2010
1. Introduction & contexte
Recherche d’un critère discrminant :
Métabolites marqueurs : β-boldénone sulfate, 6β-OH-boldénone
[Métabolites] faibles Proche de la limite de détection (appareil)
Alternative (sujet de stage) :
Analyse GC-C-IRMS : grande pureté, quantité suffisante (limite de sensibilité) Méthode de purification
(sujet de stage)
Structure du métabolite
M1 5β-androst-1-en-3,17-dione
M2 5β-androst-1-en-17α-ol-3-one
M3 5α-androst-1-en-17ξ-ol-3-one
M4 5β-androst-1-en-17β-ol-3-one
M5 5ξ-androst-1-en-3ξ-ol-17-one
M6 5α-androst-1-en-3α-ol-17-one
M7 Androst-1,4-diene-3,17-dione
M8 Androst-1,4-dien-17α-ol-3-one
M9 Androst-1,4-dien-17β-ol-3-one
Stéroïdes endogènes: CER, origine naturelle
Boldénone administrée: appauvrissement en 13
C,
origine synthétique
∆ = δ BOLD - δ ENDO ≈ 0 Même origine
Origine ≠∆ = δ BOLD - δ ENDO < - 3 ‰

6. Plan
1. Introduction & contexte
2. Optimisation de la méthode
4. Conclusion et Perspectives
3. Analyse sur un échantillon d’urine réel par GC-C-IRMS

7. 7/19Mohamed, Soutenance M2 Pro ACBPI , 6 Septembre 2010
2. Optimisation de la méthode

8. 8/19Mohamed, Soutenance M2 Pro ACBPI , 6 Septembre 2010
2. Optimisation de la méthode 2.2. Optimisation de l’étape sur SPE C18
Matrice
URINE
Déconjugaison
des glucuroconjugués
SPE C18
Rinçage:H20 et n-hexane
Elution: MeOH/AE (40:60)
Extraction
liquide/liquide
Dissolution du résidu
pH 14
Extraction avec le pentane
pH 14
Extraction avec l’éther
Androgènes
« A »
Reprendre dans 75 µL d’AE
et 100 µL de n-hexane
Reprendre
et 100 µL
SPE SiOH
Rinçage:10 mL
Hexane/AE (90:10)
Elution: 10 mL
Hexane/AE (50:50)
SP
Rinça
Hexane
Eluti
Hexane/A
Hexane
Evaporer à sec et dissoudre
dans le MeOH
HPLC N(CH3)2
Collecter six fractions
Evaporer à
dans
AF1 à AF6
HPLC
Collecte
EF1
HPLC C18
Collecter cinq fractions
AF’1 à AF’5
HP
Collecter
EF’1
Dérivation: acétylation Dérivatio
GC-MS
injection des fractions
G
injection
GC-C-IRMS
mesure isotopique 13
C/12
C δ‰
GC-
mesure isoto
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
rendement
M1 Etio DHEA Boldione
(M7)
M2 17α-T (M8) (M9) 17a-E 6b-OH-
BOLD
analytes standards
SPE C18 sur urine blanche supplémentée
SPE C18-1:
MeOH/AE(30:70)
SPE C18-2:MeOH/AE(40:60)
Eau MilliQ
vs
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
M
1
Etiocholanolone
D
HEA
Boldione
(M
7)
M
4
M
2
17a-Testostérone
17a-boldénone
(M
8)
17b-boldénone
(M
9)
17a-estradiol
6b-O
H
-boldénone
Rendementen%
Choix du mélange MeOH/AE (40:60)
MeOH/AE (30:70)

9. 9/19Mohamed, Soutenance M2 Pro ACBPI , 6 Septembre 2010
2. Optimisation de la méthode 2.3. Optimisation de l’étape LLE
LLE sur matriceEau MilliQ
vs
URINE
Déconjugaison
des glucuroconjugués
SPE C18
Rinçage:H20 et n-hexane
Elution: MeOH/AE (40:60)
Extraction
liquide/liquide
Dissolution du résidu
pH 14
Extraction avec le pentane
pH 14
Extraction avec l’éther
Androgènes
« A »
Estradiol et 6b-
OH-boldénone
Reprendre dans 75 µL d’AE
et 100 µL de n-hexane
Reprendre dans 75 µL d’AE
et 100 µL de n-hexane
SPE SiOH
Rinçage:10 mL
Hexane/AE (90:10)
Elution: 10 mL
Hexane/AE (50:50)
SPE SiOH
Rinçage:10 mL
Hexane/AE (90:10)
Elution: 10 mL
Hexane/AE (50:50) puis
Hexane./AE (30:70)
Evaporer à sec et dissoudre
dans le MeOH
HPLC N(CH3)2
Collecter six fractions
Evaporer à sec et dissoudre
dans le MeOH
AF1 à AF6
HPLC N(CH3)2
Collecter six fractions
EF1 à EF6
HPLC C18
Collecter cinq fractions
AF’1 à AF’5
HPLC C18
Collecter cinq fractions
EF’1 à EF’5
Dérivation: acétylation Dérivation: acétylation
GC-MS
injection des fractions
GC-MS
injection des fractions
GC-C-IRMS
mesure isotopique 13C/12C δ‰
GC-C-IRMS
mesure isotopique 13C/12C δ‰
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
M
1
Etiocholanolone
DHEA
Boldione
(M
7)
M
4
M
2
17a-Testostérone
17a-boldénone
(M
8)
17b-boldénone
(M
9)
17a-estradiol
6b-O
H-boldénone
F-A3
F-A2
F-A1
F-A1: extraction par pentane
F-A2: extraction par
pentane
F-A3:
extraction par éther
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
M
1
E
tiochola
nolone
D
H
E
A
B
oldione
(M
7
)
M
2
17
a-T
esto
stéro
ne
5a
-A
ndro
st-1-en-3
b,17a
diol
17
a-bo
ld
énon
e
(M
8)
5a
-and
rosta
n-3b
,17
a-d
io
l
17
b-bo
ld
énon
e
(M
9)
17
a-estradiol
6b
-O
H
-B
O
L
D
A1
A2
E1
E2
A1: extraction par pentane à pH 14
A2: extraction par éther à pH 14
E1:
extraction par éther à pH 5,2
E2:extraction par éther à pH 5,2
pH14

10. 10/19Mohamed, Soutenance M2 Pro ACBPI , 6 Septembre 2010
2. Optimisation de la méthode 2.4. Optimisation de l’étape sur SPE SiOH
Dissolution du résidu
pH 14
Extraction avec le pentane
pH 14
Extraction avec l’éther
Androgènes
« A »
Estradio
OH-boldé
Reprendre dans 75 µL d’AE
et 100 µL de n-hexane
Reprendre dans 75 µL d’AE
et 100 µL de n-hexane
SPE SiOH
Rinçage:10 mL
Hexane/AE (90:10)
Elution: 10 mL
Hexane/AE (50:50)
SPE SiOH
Rinçage:10 mL
Hexane/AE (90:10)
Elution: 10 mL
Hexane/AE (50:50) puis
Hexane./AE (30:70)
Evaporer à sec et dissoudre
dans le MeOH
HPLC N(CH3)2
Collecter six fractions
Evaporer à sec et dissoudre
dans le MeOH
AF1 à AF6
HPLC N(CH3)2
Collecter six fractions
EF1 à EF6
HPLC C18
Collecter cinq fractions
AF’1 à AF’5
HPLC C18
Collecter cinq fractions
EF’1 à EF’5
Dérivation: acétylation Dérivation: acétylation
GC-MS
injection des fractions
GC-MS
injection des fractions
GC-C-IRMS
mesure isotopique 13C/12C δ‰
GC-C-IRMS
mesure isotopique 13C/12C δ‰
Polarités:
Boldénone ++
Hydroxy-boldénone +++
Méthode initiale: élution avec 11mL Hexane/AE
(60:40) pour éluer les «A»
Se1(Hex/AE) Se2(Hex/AE) Se3 (Hex/AE) Se4(Hex/AE) Se5 (Hex/AE)Se6(Hex/AE) Se7(Hex/AE)
(90/10) (80/20) (70/30) (60/40) (50/50) (40/60) (30/70)
M1
Etiocholanolone
DHEA
Boldione(M7)
M2
17α-Testostérone
17α-boldénone(M8)
17β-boldénone(M9)
17α-estradiol
6β-OH-BOLD
Profil d’élution:
Hexane/AE (50:50) Androgènes
Hexane/AE (70:30), Hexane/AE (30:70) Estradiol et 6β-OH-boldénone

11. 11/19Mohamed, Soutenance M2 Pro ACBPI , 6 Septembre 2010
2. Optimisation de la méthode 2.5. Optimisation de la séparation sur
colonne HPLC N(CH3)2
Colonne HPLC semi-préparative N(CH3)2 pour les stéroïdes
0 5 10 15 20 25
mAU
0
20
40
60
80
100
120
140
160
DAD1 A, Sig=250,4 Ref=360,100 (2010-04EH080451.D)
6.515
10.598
16.882
DAD1 B, Sig=200,16 Ref=360,100 (2010-04EH080451.D)
2.519
2.817
4.034
6.002
6.192
6.489
10.611
16.884
DAD1 C, Sig=210,8 Ref=360,100 (2010-04EH080451.D)
2.519
2.813
4.034
6.003
6.192
6.488
10.598
16.887
DAD1 D, Sig=230,16 Ref=360,100 (2010-04EH080451.D)
2.655
2.816
4.034
6.003
6.192
6.503
10.598
16.882
DAD1 E, Sig=280,16 Ref=360,100 (2010-04EH080451.D)
1
2 3 4
7
5 et 6
AF1 AF2 AF3 AF4 AF6AF5
1: M1 2: M2 3: M4 4: Boldione (M7)
5 et 6: 17α-boldénone (M8), 17β-boldénone (M9)
7: 6β-OH-boldénone
Idem pour la fraction « EF »
Extraction avec
pH 1
Extraction av
Reprendre dans 75 µL d’AE
et 100 µL de n-hexane
SPE SiOH
Rinçage:10 mL
Hexane/AE (90:10)
Elution: 10 mL
Hexane/AE (50:50)
Evaporer à sec et dissoudre
dans le MeOH
HPLC N(CH3)2
Collecter six fractions
AF1 à AF6
HPLC C18
Collecter cinq fractions
AF’1 à AF’5
Dérivation: acétylation
GC-MS
injection des fractions
GC-C-IRMS
mesure isotopique 13C/12C δ‰

12. 12/19Mohamed, Soutenance M2 Pro ACBPI , 6 Septembre 2010
2. Optimisation de la méthode 2.6. Optimisation de la séparation sur GC-
MS: étude de l’acétylation
Dérivation (avec et sans) des métabolites de la boldénone:
21.00 22.00 23.00 24.00 25.00 26.00 27.00 28.00 29.00 30.00
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
Time-->
Abundance
TIC:04081004.D
17a-boldénoneacétylée
17a-boldénonenative
TIC:06081004.D
20.00 21.00 22.00 23.00 24.00 25.00 26.00 27.00 28.00 29.00 30.00 31.00
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
Time-->
Abundance
TIC:04081008.D
6b-OH-boldénoneacétylé
TIC:06081008.D
Avec dérivation: Pic plus fin, signal
Ex: Boldénone et 6β-OH-boldénone (avant et après acétylation)
6β-OH-boldénone non dérivé pas observé
Dérivation obligatoire
Hexane/AE (90:10)
Elution: 10 mL
Hexane/AE (50:50)
Evaporer à sec et dissoudre
dans le MeOH
HPLC N(CH3)2
Collecter six fractions
AF1 à AF6
HPLC C18
Collecter cinq fractions
AF’1 à AF’5
Dérivation: acétylation
GC-MS
injection des fractions
GC-C-IRMS
mesure isotopique 13C/12C δ‰

13. 13/19Mohamed, Soutenance M2 Pro ACBPI , 6 Septembre 2010
2. Optimisation de la méthode 2.7. Optimisation de la séparation sur
colonne HPLC C18
Colonne HPLC semi-préparative C18 pour les métabolites
de boldénone:
1: M1 2: M2 3: M4 4: Boldione (M7)
5: 17α-boldénone (M8) 6: 17β-boldénone (M9)
7: 6β-OH-boldénone
0 5 10 15 20 25 30 35 40
mAU
0
100
200
300
400
DAD1 A, Sig=250,4 Ref=360,100 (2010-03EH010433.D)
11.309
15.832
16.594
17.458
21.004
DAD1 B, Sig=200,16 Ref=360,100 (2010-03EH010433.D)
1.268
2.944
12.317
17.459
18.496
21.004
30.100
38.459
DAD1 C, Sig=210,8 Ref=360,100 (2010-03EH010433.D)
1.267
2.497
2.8272.954
12.316
14.584
18.496
21.007
38.455
DAD1 D, Sig=230,16 Ref=360,100 (2010-03EH010433.D)
2.961
11.309
14.584
15.832
16.594
17.458
21.009
38.448
DAD1 E, Sig=280,16 Ref=360,100 (2010-03EH010433.D)
2.513
2.951
4
7 5 6
3 et 2
1
AF’1 AF’2 AF’3 AF’4
Idem pour la fraction « EF »
Elution: 10 mL
Hexane/AE (50:50)
Evaporer à sec et dissoudre
dans le MeOH
HPLC N(CH3)2
Collecter six fractions
AF1 à AF6
HPLC C18
Collecter cinq fractions
AF’1 à AF’5
Dérivation: acétylation
GC-MS
injection des fractions
GC-C-IRMS
mesure isotopique 13C/12C δ‰ m

14. 14/19Mohamed, Soutenance M2 Pro ACBPI , 6 Septembre 2010
2. Optimisation de la méthode 2.7. Optimisation de la séparation sur colonne HPLC C18
Intérêt d’une purification sur colonne HPLC C18 semi-préparative:
AVANT HPLC C18
APRES HPLC C18
-Identification et évaluation de la
pureté des composés en GC-MS
- Ex: Echantillon d’urine
Analyse par GC-C-IRMS

15. Plan
1. Introduction & contexte
2. Optimisation de la méthode
4. Conclusion et perspectives
3. Analyse sur un échantillon d’urine réel par GC-C-IRMS

16. 16/19Mohamed, Soutenance M2 Pro ACBPI , 6 Septembre 2010
3.1. Précautions analytiques
(appareil)
Avant analyse:
10 « pulses »
CO2
Stabilité:
Intensité d’ion 45/44
Constant
Écart toléré: 0,5 ‰
Mesure du ratio 13
C/12
C
Fraction AF’3
17α-testostérone
Urine : 3 jours après administration de boldénone undécylénate
3. Analyse sur un échantillon d’urine par GC-C-IRMS

17. 17/19Mohamed, Soutenance M2 Pro ACBPI , 6 Septembre 2010
3.3. Résultats finaux
DEVIATIONS ISOTOPIQUES OBTENUES
APRES CORRECTIONS
Valeurs isotopiques corrigées obtenues pour les CER
δ (17α-testostérone)= -21,6 ‰
δ (étiocholanolone)= -20,6 ‰
Valeurs isotopiques corrigées obtenues pour les métabolites
δ (17α-boldénone)= -32,4 ‰
δ (M4)= - 32,4 ‰
δCER(moyenne)= -21,1 ‰
δBOLD(moyenne)= -32,4 ‰
∆(CER-BOLD)= -11,3 ‰ Différence significativement < -10 ‰ = NON CONFORME
3. Analyse sur un échantillon d’urine par GC-C-IRMS

18. Plan
1. Introduction & contexte
2. Optimisation de la méthode
4. Conclusion et perspectives
3. Analyse sur un échantillon d’urine par GC-C-IRMS

19. 19/19Mohamed, Soutenance M2 Pro ACBPI , 6 Septembre 2010
4.Conclusion & Perspectives
 Protocole développé Confirmation d’une administration frauduleuse de boldénone
 Premiers résultats
 Fenêtre de temps après administration à déterminer
Échantillons extraits
tardivement après
administration
Bovins