1. UNIVERSIDAD AUTONOMA DE
SINALOA
Facultad de Ciencias Químicas-
Biológicas
Bioquímica I
TEMA
Extracción y purificación de proteínas
PROFESORA
Dra. Liliana León López
INTEGRANTES
Apodaca Ontiveros Maria Fernanda
Leal Rubio Milkin Salome
Hernández Moreno Maria del Rosario
Rendón Aguilar Kathya Yolanda
2.
3. Es un conjunto de métodos y
técnicas que tienen como objetivo
obtener fracciones puras o
enriquecidas en un determinado
componente celular, ya sea éste un
orgánulo (mitocondrias, núcleos,
peroxisomas, etc.) una fracción de
membrana (membrana total,
plasmática, dominio basolateral,
dominio apical, etc.), complejos
multiproteicos (citoesqueleto de
actina, microtúbulos, poros
nucleares, etc.).
Todo proceso de fraccionamiento
subcelular tiene tres etapas:
-Rotura de las células o tejidos
-Separación de la fracción deseada
-Verificación de la pureza
4. Células anexas: Primero se deben
romper conexiones con otras
células.
Células no anexas: pueden
separarse teniendo en cuenta
forma, densidad o características
que puedan marcarse.
Existen dispositivos de
homogenización en los que está
calibrada la separación entre el
émbolo y la pared de cristal para
producir homogenizados con un
tamaño de partícula determinado.
Homogenizador de Esferas
Fragmentación celular por
acción del choque de las
esferas de vidrio con las
células.
Homogenizació
n
5. Separación de organelos
La separación puede ser
llevada a cabo empleando
la centrifugación.
Manejando las
variables fuerza centrifuga
y tiempo podemos separar
primero los organelos de
mayor tamaño como el
núcleo.
6. La centrifugación diferencial se basa en la existencia de
diferentes partículas en la suspensión que difieren en su
densidad de la del medio. Si se centrifuga en condiciones
suaves (poco tiempo, poco fuerza de aceleración) sedimentarán
las partículas mayores y/o más densas. Cuando el
sobrenadante de la primera centrifugación es centrifugado de
nuevo en condiciones de mas tiempo y más fuerza de
aceleración sedimentan de nuevo las partículas más densas
presentes y así sucesivamente. Se pueden aplicar condiciones
crecientes de severidad en la centrifugación y obtener una
colección de sedimentos que corresponden sucesivamente a
fracciones de partículas de diferente tamaño y/o densidad.
7.
8. Verificación de la pureza de
los organelos separados
*Morfología
* Marcadores
enzimáticos:
*Métodos
inmunoquimicosMarcadores enzimáticos
Cada organela presenta unas enzimas exclusivas, las cuales
pueden ser empleadas como marcadores de su pureza. La tabla
nos presenta algunos ejemplos de marcadores enzimáticos de
algunos organelos.
ACTIVIDAD ENZIMATICA EN ALGUNOS
ORGANELOSORGANELA ACTIVIDAD ENZIMATICA
MITOCONDRIAS CITOCROMO C
PEROXISOMAS CATALASA
LISOSOMAS FOSFATASA ALCALINA
9. BASADO EN LAS SIGUIENTES CARACTERISTICAS
PROTEICAS
• Tamaño
• Solubilidad
• Carga
• Afinidad
10. CARACTERISTICAS PROCEDIMIENTOS
Tamaño
• Diálisis-ultrafiltración
• Electroforesis en gel
• Cromatografía de exclusión molecular
• ultracentifugacion
Solubilidad
• Precipitación con sales
• Precipitación con solventes orgánicos
• Precipitación por pH
Polaridad
• Cromatografía de absorción
• Cromatografía en papel
• Cromatografía en fase reversa
• Cromatografía de interacción hidrofóbica
Carga
• Cromatografía de intercambio iónico
• Electroforesis
• isoelectroenfoque
selectividad • Cromatografía por afinidad
11.
12. • La diálisis es uno de los métodos de filtración molecular más
utilizados
• Se coloca una solución acuosa que contiene moléculas de
distintos tamaños dentro de una bolsa de diálisis que se
encuentra a su vez sumergida en un gran volumen de un
buffer determinado
• Las moléculas pequeñas del soluto (excepto aquellas que se
encuentran fuertemente cargadas) pasan libremente a través
de la membrana, hasta alcanzar el equilibrio.
• Reemplazando la solución externa repetidas veces, puede
lograrse reducir la concentración de las moléculas pequeñas a
valores prácticamente despreciables
13. • El agua pasa también libremente a través de la bolsa,
ocasionando así concentración o dilución, dependiendo
de si la solución interna se encuentra más o menos
concentrada que la externa (efecto osmótico).
14. • la electroforesis se basa en el movimiento de partículas cargadas en un campo eléctrico, hacia un electrodo
concarga opuesta. la movilidad de las macromoléculas depende desu carga, forma y tamaño.
15. ELECTROFORESIS EN GELES
separa por carga y tamaño el material soporte interacciona con las proteínas
actuando como matriz retardando a las proteínas más grandes
• geles agarosa
• geles poliacrilamidas
16.
17.
18. Los elementos estándar de una columna cromatografía incluyen un
material sólido y poroso (matriz) que se deposita en el interior de
la columna. A través de la matriz, la fase estacionaria fluye una
disolución, la fase móvil. La disolución que sale de la columna por
la parte inferior (el efluente), es reemplazada constantemente por
una disolución suministrada de un depósito en la parte superior. La
disolución de proteína a separar se deposita sobre la cabeza de la
columna y se deja percollar hacia el interior de la matriz sólida. Se
añade más disolución sobre ella. La disolución de proteína forma
una banda dentro de la fase móvil que tiene inicialmente la anchura
de la disolución de proteína aplicada a la columna.
19. A medida que las proteínas se desplazan a través
de la columna, se retardan en diferentes grados
según sus diferentes interacciones con el
material de la matriz. La banda de proteína se
ensancha así a medida que se mueve a través de
la columna. Los tipos individuales de proteína
(tales como A, B, y C, mostradas en azul, rojo y
verde) se separan gradualmente entre sí,
formando bandas dentro de las bandas más
anchas de proteínas. La separación mejora a
medida que aumenta la longitud de la columna.
Sin embargo, cada banda de proteína individual
también se ensancha con el tiempo debido a la
difusión, un proceso que disminuye la resolución.
En este ejemplo la proteína está bien separada de
B y C, pero el ensanchamiento por difusión
impide la separación completa de B y C en estas
condiciones
20.
21. Este método separa sus proteínas en base a
su tamaño.
Las proteínas de mayor tamaño emergen de la
columna antes que las pequeñas.
La fase solida consiste en unas pequeñas
perlas hechas de material entrelazado,
partícula que contiene unos poros o
cavidades, por lo que toman el camino mas
corto a través de la columna, rodeando las
partículas por el exterior.
Las proteínas mas pequeñas penetran en las
cavidades y son retardadas a causa de su paso
mas laberintico a través de la columna.
22. Procedimiento o
paso
Volumen de la
fracción(mL)
Proteína total
(mg)
Actividad
(unidades)
Actividad
especifica
(unidades/mg)
1. Extracto celular
o crudo.
2. Precipitación
con sulfato
amónico.
3. Cromatografía
de intercambio
iónico.
4. Cromatografía
de exclusión
molecular.
5. Cromatografía
de afinidad.
1.4000
280
90
80
6
10.000
3.000
400
100
3
100.000
96.000
80.000
60.000
45.000
10
32
200
600
15.000
Tabla de purificación de un enzima hipotético
23.
24. Aprovecha las diferencias en el signo y la magnitud de las
cargas eléctricas netas de las proteínas a un pH
determinado. La matriz de la columna es un polímero
sintético(resina) que tiene unidos grupos cargados; los que
tienen unidos grupos anionicos se denominan
intercambiadores catiónicos, los que tienen grupos
catiónicos se denominan intercambiadores anionicos.
La afinidad de cada proteína por los grupos cargados de la
columna esta afectada por el pH(que determina el estado de
ionización de la molécula) y la concentración de los iones
salinos libres competidores presentes en la disolución que
los rodea.
La separación puede optimizarse cambiando gradualmente
el pH y/o la concentración de sal de la fase móvil, de forma
27. TABLA 3-6 Puntos isoeléctricos
de algunas proteínas
proteína PI
Pepsina
Albumina de huevo
Albumina sérica
Ureasa
B-lactoglobulina
Hemoglobina
Mioglobina
Quimotripsinogeno
Citocromo c
lisozima
<1,0
4,6
4,9
5,0
5,2
6,8
7,0
9,5
10,7
11,0
28. CARACTERÍSTICAS:
• revela la presencia de proteínas con colorantes específicos
• no existe interacción con el soporte
• resolución muy baja
• rápido
29.
30. En esta técnica la fase estacionaria está constituida por
una tira. La muestra se deposita en un extremo colocando
pequeñas gotas de una solución y evaporando el
disolvente luego de cada aplicación. Luego el disolvente o
mezcla de disolventes empleada como fase móvil se hace
ascender por capilaridad. Para esto se coloca una porción
del papel en contacto con la fase móvil dentro de un
recipiente que la contiene. Después de unos minutos,
cuando el disolvente deja de ascender o ha llegado al
borde extremo del papel, se retira el papel y seca.
31.
32.
33. Las partículas de las columnas tienen
en este caso un grupo químico unido
covalentemente llamado ligando, un
grupo o molécula que se une a una
macromolécula, como por ejemplo una
proteína. Cuando se carga una mezcla
de proteínas en la columna, cualquiera
de ellas que tenga afinidad por este
ligando se unirá a las partículas de
resina, retardando su migración a
través de la columna.
