Determinación de Hemoglobina A2 por cromatogrfía en columna

1. Determinación deDeterminación de
hemoglobina Ahemoglobina A22
[Cromatografía de intercambio iónico]
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2. Fundamento
Tras realizar un hemolizado de la muestra de sangre, la
hemoglobina A2 es retenida en una columna de resinas de
intercambio iónico, de este modo podemos separarlas del resto de
las hemoglobinas. Una vez separada, utilizando unas condiciones
específicas de pH y concentración de iones, se puede cuantificar
mediante lectura espectrofotométrica a 415 nm.
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3. Material
• Muestra: Sangre anticoagulada con EDTA (Tapón morado).
• Kit comercial con microcolumnas de intercambio iónico y tampón
de elución.
• Material de laboratorio: pipetas, gradillas, tubos de ensayo, etc.
• Espectrofotómetro.
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4. Técnica
Preparamos un hemolizado de la muestra mezclando sangre con
agua destilada, 50 μl de sangre y 200 μl agua destilada.
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5. Preparamos la columna de cromatografía:
•Quitamos la pestaña inferior de cierre.
•Eliminamos el tampón que lleva como conservante.
•Ajustamos el disco que lleva en el interior de la columna.
•Colocamos la columna en un recipiente adecuado sobre el que podamos recoger
los eluidos, ej.: tubo de ensayo grande (20 ml.)
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6. Aplicar sobre el disco superior de la columna la cantidad que
marque el protocolo del hemolizado de la muestra que hemos
preparado anteriormente y dejar que penetre en la columna.
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7. Aplicar el tampón de elución, según marque el protocolo, hasta
recoger la fracción que corresponda a la hemoglobina A2.
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8. Determinar espectrofotométricamente la absorbancia de la fracción
correspondiente a la hemoglobina A2, ajustando la longitud de onda
de la medida a 415 nm.
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9. Determinar espectrofotométricamente la absorbancia de la
hemoglobina total. Para ello preparar un nuevo hemolizado de la
muestra diluyendo sangre en agua destilada, según protocolo. La
medida se realiza igualmente a 415 nm.
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10. Calcular la proporción de
hemoglobina A2 respecto a
la hemoglobina total
relacionando las
absorbancias respectivas.
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11. ConsideracionesConsideraciones
1. Mantén las reglas de bioseguridad generales; guantes, bata, etc.
2. Prepara todo el equipo y material previamente.
3. Comprueba las condiciones de la muestra: Identificación,
ausencia de hemólisis (el sobrenadante no debe estar rojizo),
ausencia de burbujas, condiciones de conservación, etc.
4. La obtención de los eluidos es una operación relativamente lenta,
por tanto no desesperes y tenlo en cuenta a la hora de programar
el tiempo de la técnica.
5. Los valores normales de hemoglobina A2 van de 1,3% al 3,8%,
por encima del 4% es indicativo de rasgo talasémico.
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