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Prof. Samuel Borges
Visualizando micro-organismos
A ferramenta indispensável na microbiologia é o
microscópio. A microscopia microbiológica iniciou-se no século
XVII com Leeuwenhoek e seus pequenos microscópios
portáteis.
Desde seu modesto início, a microscopia passou por
muitos avanços significativos, até se tornar a ciência
sofisticada dos dias atuais.
Microscopia
Para a observação dos micro-organismos, são necessários
microscópios. Dependendo do tipo de análise, bactérias,
protozoários e algas podem ser observados ao microscópio
óptico ou de luz.
Já para as partículas virais, o microscópio eletrônico é o
único equipamento capaz de desvendar sua estrutura.
A maioria de nós não é capaz de enxergar objetos
menores de 100 m de diâmetro. Para ver micro-organismos,
que são de 10 a 100 vezes menores, precisamos do auxílio das
lentes de um microscópio.
Existem muitos tipos de microscópios, mas todos eles
dependem de três fatores para produzirem uma imagem clara:
ampliação, contraste e resolução.

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Ampliação
Usamos o microscópio para obter ampliação, que é o
aumento da imagem. Qualquer lente convexa (mais grossa no
centro do que na extremidade) é capaz de aumentar uma
imagem.
Pela refração, ela desvia os raios paralelos de luz a
partir de um objeto, de maneira que se encontrem em um único
ponto, o ponto focal, formando uma imagem aumentada do
objeto atrás dele.
A ampliação pode ser maior tornando-se a lente mais
convexa ou trazendo o objeto mais próximo da lente.
Ampliação
Contraste
Se refere a diferenças na intensidade de luz. Essas
diferenças, dentro do campo de visão do microscópio, são
essenciais para vermos uma imagem do espécime (objeto
visualizado no microscópio).
Normalmente, o contraste é criado por absorção de luz:
as diferentes quantidades de luz são absorvidas à medida que
os raios atravessam as diferentes regiões do espécime.
Contraste
Obter o contraste adequado é um problema em
particular quando visualizamos bactérias, porque, sendo quase
incolores, elas absorvem pouquíssima luz visível, gerando pouco
contraste.
Para obter imagens de bactérias e da maioria dos micro-
organismos, o contraste deve ser aumentado artificialmente.
Uma maneira é a aplicação da coloração nas células microbianas
ou em parte delas.

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Resolução
É a capacidade de distinguir detalhes dentro de uma
imagem. Diferentemente do contraste (que é uma propriedade
do espécime), a resolução é uma propriedade do sistema de
lentes utilizado para visualizá-lo.
Resolução
Três fatores determinam o poder de resolução de um
microscópio:
O tamanho da objetiva (a primeira lente de aumento do
microscópio);
O comprimento de onda de luz que atravessa o espécime;
O índice de refração do material entre a objetiva e o
espécime.
Microscópio de luz composto
Os microscópios que usam luz visível como fonte de
iluminação são chamados de microscópios de luz. Os
microscópios de luz, como o de Leeuwenhoek, que têm uma
única lente, são chamados microscópios simples.
Hoje, os microscópios de luz são microscópios
compostos. Eles proporcionam maior ampliação e são mais
fáceis de usar. Possuem duas lentes, uma objetiva e uma ocular,
que em conjunto proporcionam uma ampliação maior do que está
sendo observado.
Partes de um microscópio
A maioria dos microscópios modernos tem uma fonte de
luz embutida. Primeiro, essa luz atravessa uma série de lentes
chamadas de condensador, que concentra a luz sobre o
espécime, onde um pouco de luz é absorvida.
A luz transmitida entra na lente objetiva, que forma
uma imagem do espécime dentro do canhão do microscópio. Às
vezes, um prisma se encontra dentro do canhão, permitindo que
ele seja curvado para criar um ângulo de visualização mais
confortável.

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Partes de um microscópio
A lente ocular aumenta ainda mais a imagem dentro do
canhão e a projeta para a última lente na série – aquela dentro
do olho. A lente no olho forma, então, uma imagem na nossa
retina.
O microscópio composto fornece iluminação de campo
claro, onde o plano de fundo é iluminado mais que o espécime.
No entanto, ele pode ser adaptado para a visualização de
espécimes em outros métodos: contraste de fase; campo
escuro; fluorescência; ou contraste de interferência
diferencial.
Ampliação total
A maioria dos microscópios compostos possibilita a
escolha entre várias lentes objetivas em um revólver giratório,
cada uma com um poder de ampliação diferente.
As lentes de baixo poder aumentam um objeto em 4
vezes (4X) ou 10 vezes (10X), as de alto poder, 40 vezes (40X)
e a lente de imersão em óleo, em 100 vezes (100X).
Montagens a fresco
É o método mais simples de preparo de um espécime
para exame microscópico. Basta colocar uma gota de líquido
contendo micro-organismos em uma lâmina de microscópio e
colocar uma lamínula sobre ela. Porém, essas montagens a
fresco evaporam depressa.
Para visualizações prolongadas, uma montagem de gota
suspensa pode ser feita, colocando–se uma gota de líquido
contendo micro-organismos em uma lamínula e suspendendo-a
sobre uma lâmina côncava.
Montagens a fresco
As montagens a fresco são usadas para observar micro-
organismos vivos, como por exemplo, Trichomonas vaginalis, um
protozoário com grande mobilidade, que causa inflamações na
vagina e na uretra.
Porém, muitos micro-organismos não têm contraste
suficiente para ser claramente visíveis em uma montagem a
fresco. Para visualizá-los, é necessário aumentar o contraste
corando o espécime ou usando um microscópio que gere
contraste por outros meios.

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Colorações
Utilização de corantes que aumentam o contraste de
espécimes, ligando-se seletivamente a determinadas células ou
partes de células, revelando estruturas que, do contrário,
seriam invisíveis ou quase imperceptíveis.
Por exemplo, Koch conseguiu descobrir a causa da
tuberculose em grande parte porque desenvolveu uma
coloração que lhe possibilitou observar a bactéria causadora,
Mycobacterium tuberculosis, associada ou não ao tecido
hospedeiro.
Colorações
Alguns corantes, chamados corantes vitais, podem ser
adicionados diretamente à amostra a fresco. Porém, a maioria
dos corantes é eficaz somente após os micro-organismos terem
sido fixados.
Os micro-organismos podem ser fixados por
aquecimento ou tratados com substâncias químicas.
Colorações
A fixação por calor é o método habitual: uma gota de
líquido contendo micro-organismos é espalhada como um filme
fino (esfregaço) em uma lâmina e deixada para secar; em
seguida a lâmina é passada rapidamente por uma chama aberta.
O calor da chama mata as células microbianas,
desnaturando sua proteína, o que prende as células à lâmina.
Colorações
A fixação química danifica menos que o calor. O ácido
ósmico, formaldeído ou glutaraldeído são usados com mais
frequência. Basta adicionar uma gota da substância química ao
líquido contendo os micro-organismos.
Entretanto, a fixação traz dificuldades, pois muitas
vezes, ela distorce a aparência da célula e, é claro, sua
mobilidade não pode ser estudada.

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Colorações
Depois da fixação, o corante é aplicado à lâmina e
deixado tempo suficiente para ser absorvido pelo espécime. O
excesso do corante é retirado normalmente, lavando-se a
lâmina com água.
Tipos de colorações
Os procedimentos de coloração podem ser agrupados em
três partes: colorações simples, colorações diferenciais e
colorações especiais.
Colorações simples – usam corantes básicos para tornar
as células visíveis. Eles coram todas as células que absorvem o
corante da mesma cor.
Tipos de colorações
Colorações diferenciais – usadas para distinguir
diferentes tipos de micro-organismos. Esses procedimentos
normalmente envolvem três passos: coloração primária,
descoloração e contracoloração. Muitas vezes utilizam-se
mordentes.
Tipos de colorações
Colorações diferenciais – a coloração primária é o
mesmo que a coloração simples; a descoloração é um
tratamento que remove a coloração de determinadas células; e
a contracoloração é a aplicação de outro corante para revelar
as células ou parte das células que tenham sido descoradas.
Duas colorações diferenciais são usadas extensivamente
em microbiologia: a coloração de Gram e a coloração ácido-
resistente.

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Técnica de Gram
Foi desenvolvida pelo bacteriologista dinamarquês
Christian Gram, em 1884. As bactérias foram divididas em
dois grupos: gram-positivos e gram-negativos.
Passo 1. Coloração primária: aplica-se violeta de
genciana a um espécime fixo da bactéria. Tanto os gram-
positivos como os gram-negativos ficam da cor púrpura.
Técnica de Gram
Passo 2. Mordentes: aplica-se iodo, que fixa a coloração,
mas não muda a aparência geral da célula.
Passo 3. Descoloração: adiciona-se um agente
descorante, normalmente etanol. As bactérias gram-negativas
perdem a cor púrpura e as gram-positivas retêm a cor.
Passo 4. Contracoloração: adiciona-se um corante
vermelho, safranina, que torna os gram-negativos rosa e os
gram-positivos violeta.
Técnica de Gram
A observação de material corado pela técnica de Gram
não só é importante para acompanhar o isolamento de
amostras, como também serve para determinar o tipo de
antibiótico que deve ser utilizado em diferentes infecções.
Gram-positiva: Bacillus subtilis: não patogênica.
Gram-negativa: Escherichia coli: patogênica. Pode causar
gastroenterite e infecção urinária, por exemplo.
Coloração ácido-resistente
Foi desenvolvida por Paul Ehrlich em 1882 para
identificar a bactéria que causa a tuberculose (Mycobacterium
tuberculosis). Essa coloração aplica-se somente a
micobactérias e algumas actinomicetas (bactérias com
formatos estranhos).
Por causa disso, essas bactérias são chamadas ácido-
resistentes. Todas as outras bactérias e tecidos hospedeiros
são descoloridos, mas sua presença em um espécime pode ser
descoberta por contracoloração.

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Coloração ácido-resistente
As bactérias ácido-resistentes resistem à descoloração
porque possuem um material semelhante à cera em seu
envelope celular. A coloração Ziehl-Neelsen, descrita a seguir,
é um tipo de coloração ácido-resistente.
Passo 1. Coloração primária: aplica-se carbolfucsina ao
espécime fixo em uma lâmina de microscópio. Todas as células
são coradas de vermelho.
Coloração ácido-resistente
Passo 2. Mordentes: a lâmina é aquecida por 5 minutos,
até evaporar, o que leva o corante para dentro das células.
Passo 3. Descoloração: uma solução descolorante feita
de ácido clorídrico em etanol é adicionada. Ela remove o
corante vermelho de todas as células, exceto das bactérias
ácido-resistentes.
Coloração ácido-resistente
Passo 4. Contracoloração: adiciona-se azul de metileno
como contracorante. Ele cora de azul todas as células
bacterianas descoradas e o tecido hospedeiro. As bactérias
ácido-resistentes permanecem vermelhas.
Colorações especiais
Os microbiologistas também têm à sua disposição um
elaborado conjunto de corantes utilizados para propósitos
especiais. Alguns corantes especiais revelam partes específicas
de uma célula microbiana, como a parede celular, o nucleoide,
endosporos, membranas, flagelos ou a cápsula.
Outros corantes especiais são usados para revelar
determinados micro-organismos difíceis de serem corados,
como os espiroquetas e as riquétsias.

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Colorações especiais
Coloração de flagelos de Leifson
Flagelos são longas extensões celulares semelhantes a
uma linha, que permitem que algumas bactérias se movimentem.
Eles são muito finos para serem visualizados ao
microscópio de luz, porém a coloração dos flagelos os torna
visíveis pela adição de um material que se adere a eles, fazendo
que fiquem mais espessos, e depois serem corados.
Colorações especiais
Todos os passos na coloração dos flagelos são
projetados para serem delicados, pois os mesmos se rompem
facilmente. A coloração de flagelos de Leifson envolve os
seguintes passos:
Passo 1. A suspensão de bactérias é quimicamente
fixada com formalina e espalhada em uma lâmina de vidro.
Passo 2. Elas são deixadas para secar ao ar, sem
aquecimento.
Colorações especiais
Passo 3. Uma mistura recém preparada de ácido tânico e
corante de rosanilina é então adicionada à lâmina. O ácido
tânico engrossa os flagelos e a rosanilina os cora.
Passo 4. O corante em excesso é enxaguado,
encharcando-se a lâmina com água.
Passo 5. A lâmina é novamente deixada para secar ao ar
antes de ser examinada ao microscópio.
Colorações especiais
Coloração negativa
Algumas bactérias têm ao seu redor uma estrutura
protetora chamada cápsula. Essas estruturas são invisíveis em
preparações não coradas.
Porém, sua presença pode ser revelada por coloração
negativa, um processo por meio do qual a cápsula fica visível
por não se ligar ao corante e permitir assim a passagem da luz.

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Colorações especiais
A coloração negativa envolve os seguintes passos:
Passo 1. Uma montagem a fresco do espécime é
preparada.
Passo 2. Adiciona-se nanquim. As partículas de carbono
na tinta não conseguem penetrar na cápsula, então apenas o
fundo da lâmina é enegrecido. A cápsula e a célula são
reveladas como uma zona clara.
Passo 3. Um corante simples pode, então, ser aplicado
para tornar a célula visível.
Microscopia de luz: outros caminhos para obter
contraste
A microscopia de campo claro de espécimes corados é
usada na maioria dos laboratórios. Porém, outros tipos de
microscópio de luz compostos podem ser empregados para fins
de visualização de micro-organismos não corados.
Microscopia de contraste de fase
Os microscópios de contraste de fase usam um método
completamente diferente para conseguir o contraste: eles
podem gerá-lo a partir de variações no índice de refração em
todo o campo.
A maior vantagem da microscopia de fase é que ela
dispensa a necessidade de fixação e coloração.
Microscopia de contraste de fase
Logo, pode ser usada para estudar atividades e
propriedades das células vivas, incluindo movimento celular e
estruturas celulares internas que não foram adulteradas.
Uma pequena desvantagem é o aro de luz que circula os
objetos no campo de visão.

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Microscopia Nomarsky
Conhecida também como microscopia de contraste
diferencial, é uma variação da microscopia de contraste de
fase.
Os microscópios Nomarsky usam um par de prismas em
locais semelhantes e produzem uma imagem quase
tridimensional, com melhores detalhes que o contraste de fase.
Microscopia de campo escuro
Um microscópio de campo escuro tem um condensador
especial que redireciona o feixe proveniente da fonte de luz,
de forma que ele atravessa o espécime, mas não a objetiva.
É mais eficaz na visualização de estruturas superficiais,
sendo comumente usada para detectar a bactéria Treponema
pallidum.
Microscopia por fluorescência
Nesse tipo de microscopia, o contraste é aumentado por
fluorescência. Diferentemente das técnicas de contraste de
fase e campo escuro, a microscopia por fluorescência depende
de uma propriedade do espécime, não do microscópio.
Contudo, um microscópio deve ser modificado com
equipamentos especiais para iluminar o espécime com luz
ultravioleta de onda curta.
Microscopia por fluorescência
Alguns micro-organismos, incluindo bactérias
fotossintéticas e algas, são naturalmente fluorescentes.
Porém, a maioria dos micro-organismos deve ficar fluorescente
por meio da adição de corantes chamados fluorocromos.
Esse tipo de microscopia pode ser usado para identificar
micro-organismos específicos, ligando quimicamente os
fluorocromos a anticorpos, por exemplo.

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Microscopia eletrônica
Os microscópios eletrônicos que utilizam um feixe de
elétrons (que tem um comprimento de onda muito pequeno) têm
um poder de resolução muito maior que os microscópios de luz,
ou seja, sua ampliação é muito maior.
Existem dois tipos de microscópios eletrônicos (ME) de
uso comum: o microscópio eletrônico de transmissão (MET) e o
microscópio eletrônico de varredura (MEV).
Microscopia eletrônica de transmissão
O MET pode separar pontos próximos até a 1 nm, em
comparação a aproximadamente 300 nm de um microscópio de
luz. Ele produz uma imagem detalhada com ampliações de até
300.000X, em comparação a aproximadamente 1.000X para um
microscópio de luz.
Microscopia eletrônica de varredura
O MEV é usado para visualizar superfícies, por exemplo,
de células intactas. Os espécimes são congelados a seco e,
então, são cobertos com uma fina camada de metal pesado,
como ouro ou platina.
A camada previne que elétrons penetrem no espécime e
melhora a imagem, chamada de micrografia eletrônica de
varredura.
Uso da microscopia
Cada um dos vários tipos de microscópio tem suas
próprias vantagens, desvantagens e utilizações particulares.
Em geral, os microscópios de luz são para uso diário.
A preparação do espécime e a operação são
relativamente rápidas e simples. O microscópio de luz fornece
informações valiosas sobre o tamanho, a forma e a aparência
geral das células. No entanto, a resolução é limitada, assim
como a ampliação.

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Uso da microscopia
A microscopia eletrônica é basicamente uma ferramenta
de pesquisa, pois permite a visualização da ultraestrutura da
célula, ou seja, detalhes mais finos, que não são visíveis por
microscopia de luz.
A ME oferece resolução suficiente e ampliação útil para
visualizar vírus e objetos menores, assim como moléculas
grandes.
Referências bibliográficas
INGRAHAM, J. L.; INGRAHAM, C. A. Introdução à
microbiologia – uma abordagem baseada em estudos de
caso. São Paulo: Cencage Learning, 2010.
NEDER, R. N. Microbiologia – manual de laboratório. São
Paulo: Nobel, 1992.
VERMELHO, A. B.; PEREIRA, A. F.; COELHO, R. R. R.;
SOUTO-PADRÓN, T. Práticas de microbiologia. Rio de
Janeiro: Guanabara Koogan, 2006.