2. Pruebas de Identificación
rápidas
1.Prueba de la catalasa
2.Prueba de la coagulasa
3.Prueba de PYR
4.Prueba de oxidasa
3. Pruebas de Identificación para
Cocos Gram +
1. DNasa
2. Prueba del manitol salado
3. Bilis esculina
4. CAMP
5. Hidrólisis del hipurato
6. Voges –Proskauer
Pruebas de sensibilidad a ATB
1. Disco de Optoquina
2. Disco de novobiocina
3. Disco de Bacitracina
5. Prueba de la catalasa
Fundamento: Detecta la presencia de la enzima
catalasa.
Procedimiento: En portaobjetos colocar sobre una
colonia unas gotas de H202 3 %.
H202 H20 + 02
Liberación de burbujas rápida y sostenida indica
la producción de oxígeno molecular = prueba (+)
Consideraciones:
No Agar sangre (peroxidasa en los eritrocitos).
7. Prueba de la coagulasa
Fundamento: Detecta un factor de agregación “clumping
factor” en la superficie de la bacteriana.
Procedimiento: se coloca una colonia sospechosa de
pertenecer a una especie de Staphylococcus y se
emulsifica en una gota de plasma de conejo.
Interpretación: “arracimamiento” bacteriano en 1 minuto =
prueba (+).
Si el resultado es negativo ensayar la producción de
coagulasa en tubo.
Consideraciones:
Utilizar plasma con EDTA y no citratado, ya
que organismos capaces de metabolizar el citrato
(Enterococcus spp.) pueden dar resultados falsos (+).
Las pruebas (-) luego de 4 hs de incubación
a 35ºC, dejar a temperatura ambiente y leer luego de 18-
24 hs a fin de evitar la fibrinólisis que producen algunas
cepas al ser incubadas en forma prolongada a 35ºC.
9. Prueba del PYR:
Fundamento: detecta la enzima pirrolidonil arilamidasa se utiliza
como sustrato el reactivo L-pirrolidonil- beta-naftilamida (PYR), para
la identificación rápida de enterococos.
Procedimiento: Realizar un alto inóculo (2 MacFarland) e introducir
un disco de PYR.
Tiempo y Tº de incubación: 30 minutos a 35º C.
Tiempo de lectura: 5 minutos.
Interpretación:
Disco rosado o rojo (+)
Disco y/o solución amarillo a incoloro (-).
Consideraciones: Algunas especies de Staphylococcus y los
estreptococos del grupo A dan, también, una prueba positiva.
11. Prueba de la DNAsa
Fundamento: El S. aureus produce una DNAasa
termoestable que hidroliza DNA. La producción de
DNAsa puede determinarse incorporando ácido
desoxirribonucleico (DNA) en agar nutritivo .
Procedimiento: Se inocula el microorganismo en
manchas densas sobre agar DNA y después de 18 a 24
hs de incubación. Revelar con HCl al 1%, que precipita
el DNA nativo del medio.
Interpretación: colonias rodeadas por una zona clara
donde el ADN ha sido despolimerizado e hidrolizado =
prueba (+)
13. Agar Manitol salado
Fundamento: el medio contiene manitol (1%), cloruro de sodio (7,5
%), rojo de fenol y peptonas.
Procedimiento: Sembrar la cepa e incubar 18 a 24 hs a 35ºC.
Interpretación:
Crecimiento y viraje
S. aureus
Crecimiento sin viraje.
S. epidermidis
Consideraciones:
La alta concentración de sal inhibe otros microorganismos excepto
enterococos (por lo tanto usar la placa para identificación, no para
aislamiento).
15. Prueba de la bilis-esculina:
Fundamento: Se basa en la capacidad de ciertas bacterias
(estreptococos del grupo D) para hidrolizar la esculina en presencia
de 1-4% de sales biliares.
Procedimiento: Se inocula el microorganismo en la superficie de
un pico de flauta. Incubar 24 hs.
Interpretación: La beta glucosidasa escinde la esculina en glucosa
y esculetina. Esta ultima es soluble en el medio y forma un
complejo de color negro con Fe 3+ .La hidrólisis de esculina se
observa como un oscurecimiento del medio (color negro) en 24 hs
de incubación a 35ºC, raramente se requieren 48 hs de incubación
hasta que la hidrólisis sea aparente.
Consideraciones: Es importante que el medio contenga 40% de
bilis, ya que algunos productos contienen menos cantidad lo que
lleva a confundir algunos estreptococos viridans con enterococos
16. Prueba de CAMP
Fundamento: Los estreptococos grupo B secretan el factor CAMP
que interactúa con la ß-hemolisina secretada por una cepa ß-
hemolítica de S. aureus (ATCC 25923) lo que causa un
acrecentamiento o sinergismo de la hemólisis.
Procedimiento: En placa de agar sangre sembrar una estría de la
cepa de S. aureus y perpendicularmente a ésta (lo más cerca
posible, sin llegar a tocarla) sembrar la cepa de estreptococo en
estudio.
Tiempo y Tº de incubación: Incubar 24 hs a 35ºC en aerobiosis
(en CO2 aumentan los falsos positivos).
Interpretación: El sinergismo se observa como un área de ß-
Hemólisis en forma de “punta de flecha” en la zona
de desarrollo más cercana a ambas estrías.
18. Prueba del hipurato de sodio
Fundamento: Ciertas cepas son capaces de hidrolizar el hipurato
de sodio. La producción de hipuricasa resulta en la hidrólisis del
hipurato de sodio con la formación de benzoato de sodio y glicina.
Procedimiento:
Inocular un tubo con medio hipurato de sodio con el
microorganismo. Incubar 24 hs a 35ºC. Centrifugar. Pipetear 0.8 ml
el sobrenadante. Agregar 0.2 ml de cloruro férrico 7%.
Inocular un tubo con 0.4 ml de medio hipurato de sodio con el
microorganismo. Incubar 2 hs a 35ºC. Agregar 0.2 ml de Ninhidrina.
Interpretación:
La formación de un precipitado denso y persistente por 10 minutos
= prueba (+) Benzoato de sodio
La aparición de un color púrpura profundo = prueba (+) glicina.
20. Prueba de la susceptibilidad a
la Novobiocina
Fundamento: Se basa en que ciertas bacterias son sensibles a la
novobiocina.
Procedimiento: Se inocula el microorganismo en agar Mueller
Hinton según técnica de Kirby-Bauer, utilizando discos de
Novobiocina (5 µg).
Interpretación: Sensible: inhibición del desarrollo con un diámetro
mayor o igual a 16 mm
Staphylococcus R
Micrococcus S
Consideraciones:
Kirby Bauer (Difusión en disco)
Inoculo sin incubación previa
Tiempo de lectura: 24 hs.
Tº de incubación: 33º a 35º
21. Prueba de la Bacitracina:
Fundamento: Se basa en que ciertas bacterias son sensibles a la
bacitracina.
Procedimiento: Se inocula el microorganismo en AS según técnica
de Kirby-Bauer utilizando discos de Bacitracina (0.04 U).
Interpretación: Sensible: Cualquier zona de inhibición del
desarrollo.
Consideraciones: Kirby Bauer (Difusión en disco)
Inoculo sin incubación previa
Tiempo de lectura: 18 a 24 hs.
Tº de incubación: 33º a 35º en CO2
Recordar que el uso de discos de Bacitracina en forma directa en
las placas primarias de cultivo puede dar como resultado un 40% a
50% de falsos negativos.
24. Pruebas de Identificación para
enterobacterias
1. Prueba OF
2. Prueba de la oxidasa o citocromooxidasa
3. TSI
4. SIM (Sulfhídrico- Indol- Movilidad)
5. Rojo de metilo - Voges –Proskauer
6. ONPG (O-nitrofenil-b-galactopiranosido)
7. Citrato
8. Ureasa
9. Fenil-alanina-desaminasa
10.Descarboxilasas
26. CITOCROMOOXIDASA O
PRUEBA DE LA OXIDASA
Fundamento: El sistema citocromooxidasa, se halla en
microorganismo aerobios, microaerófilos y anaerobios facultativos.
Procedimiento: Hacer una suspensión del microorganismo con
solución fisiológica (inóculo) en un tubo de vidrio, agregar un disco
(disco comercial de papel impregnado de tetrametil-para-
difenilamina) se agita y antes de los 2 minutos se debe leer.
Interpretación: Un cambio de color del disco a rosado o violeta =
prueba (+). Si no hay cambio de color el microorganismo es oxidasa
negativo.
Consideraciones Esta prueba no puede realizarse con colonias
que provengan de medios de cultivo que contenga hidratos de
carbono ni indicadores, por lo que si se la va a realizar se debe
incubar los microorganismos en un placa de AS o bien un TSA
(tripteina-soya-agar)
28. PRUEBA DE OXIDACIÓN
FERMENTACIÓN (O-F)
Fundamento: Determinan el metabolismo oxidativo o fermentativo
de un hidrato de carbono o su falta de utilización. Se usa el medio
O-F de Hugh y Leifson que contiene peptonas e hidratos de
carbono en una relación 1:5. Al ser menor la concentración de
peptonas, hay menor producción de productos de oxidación a partir
de los AA que tienden a elevar el pH y pueden neutralizar los
ácidos débiles producidos por los microorganismos no
fermentadores.
Procedimiento: Se utilizan 2 tubos con el medio O-F, se hace la
siembra con ansa de punta hasta el fondo de los dos tubos. Uno de
los tubos queda expuesto al aire, y el otro se cubre con vaselina
estéril.
Interpretación:
Microorganismos oxidativo: producen ácido solo en el tubo
abierto, expuesto al O2 atmosférico. Por lo que solamente el tubo
expuesto al aire atmosférico cambia su color original a amarillo.
Microorganismos fermentadores: producen ácido en los 2 tubos.
O sea que los dos tubos viran del verde al amarillo.
Bacterias sacarolíticas: son inertes a este medio que conserva su
pH alcalino después de la incubación, conservando su color
original.
30. TSI (TRIPLE AZÚCAR HIERRO
AGAR)
Fundamento: Sirve para detectar la
fermentación de hidratos de carbono. El medio
contiene: glucosa al 0.1%, lactosa 1%, sacarosa
al 1% y peptonas; también tiene un indicador
rojo de fenol y sulfato de hierro para evidenciar
la formación de SH2.
Procedimiento: El medio se fracciona en picos
de flauta con una capa basal profunda (2 cm.
por lo menos). Con el ansa en punta se siembra
por punción y estría.
El medio no inoculado es anaranjado-rojizo o
rojo pálido. Incubar 24 hs a 35º C.
31. TSI (TRIPLE AZÚCAR HIERRO
AGAR)
Interpretación:
Fermentación de la glucosa (alcalino/ácido)
Primero los microorganismos empiezan a fermentar la glucosa, produciendo
ácidos y virando totalmente el medio a color amarillo. Como solamente
utilizan la glucosa, no pueden usar la sacarosa ni la lactosa, cuando la
glucosa que se halla en baja concentración se consume (antes de las 24hs)
los microorganismos comienzan a utilizar la peptonas con producción de
amoníaco que alcaliniza el medio dando un color rojo, pero solamente en el
pico, quedando el fondo ácido.
Fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa (ácido/ácido)
Como la lactosa y sacarosa están en una proporción 10 veces mayor que la
glucosa, en un período de 24hs., la lactosa y sacarosa, aún no se
consumen quedando ácido el medio o sea totalmente amarillo.
3) No fermentación de lactosa, sacarosa ni glucosa (alcalino/alcalino). Un
microorganismo incapaz de obtener sus nutrientes de los hidratos de
carbono, lo obtiene de las peptonas. Cuando las peptonas son degradadas
libran amoníaco y alcalinizan el medio. Produciéndose entonces
intensificación del color.
32.
33. Consideraciones del TSI
Es importante respetar el tiempo de lectura, porque si el caso 1 se
lee antes de las 24hs. se va a interpretar como ac/ac y no lo es. Si
el 2 se lee después de las 24hs, los microorganismo ya se quedan
sin hidratos de carbono, entonces comienzan a utilizar las peptonas
y se alcaliniza el medio.
Con respecto al sulfhídrico pueden presentarse distintas
modalidades:
Pico rojo, fondo amarillo con precipitado negro y formación de gas,
esto se puede dar en Salmonella, se lee: alc/ac (SH2) (gas)
También se puede ver totalmente amarillo y el fondo negro: se lee:
ac/ac (SH2).
Además se puede visualizar en el tubo la producción de gas por
parte del microorganismo, entonces en el medio se observan
burbujas, resquebrajamiento, o si no todo el medio de cultivo
aparece levantado.
35. SIM (SULFHÍDRICO – INDOL –
MOVILIDAD)
Fundamento: Es un medio semi-sólido transparente que pone en
evidencia la movilidad, la producción de triptofanasa y de SH2. Contiene:
Triptofano: la enzima triptofanasa, lo desdobla, produce indol, que se pone
de manifiesto con el reactivo de Erlich o Kovac
Citrato de hierro y amonio: los microorganismos productores de SH2
ennegrecen el medio de cultivo
Si los microorganismos son móviles, al ser éste un medio semi-sólido se
produce enturbiamiento del medio de cultivo, caso contrario solo crece en la
punción.
Procedimiento: se inocula el microorganismo por punción con ansa de
punta. Se deja incubar a 35ºC durante 24hs. y luego de este tiempo se
agregan unas gotas del reactivo de Erlich o Kovac dejándolo resbalar por
las paredes del tubo.
Interpretación:
Triptófano (+): observar la interfase, la aparición de un color rojo fucsia
brillante por la formación de un complejo entre el indol y el p-
dimetilaminobenzaldehido.
M (+) / SH2 (-) enturbiamiento del medio
M (+) / SH2 (+), se ennegrece todo el medio
M (-) / SH2 (-) se observa crecimiento solamente en la estría
M (-) / SH2 (+), se observa precipitado negro alrededor de la estría (pero no
ennegreciendo de todo el medio).
38. ROJO DE METILO – VOGES
PROSKAUER:
Fundamento: El acido pirúvico, un compuesto fundamental formado en la
fermentación de la glucosa, es metabolizado aún mas a través de cierto
numero de vías metabólicas. Una de ellas da como resultado la producción
de acetoína (acetil-metil-carbinol) un producto final de reacción neutra. En
presencia de oxigeno e KOH al 40%, la acetoína es convertida en diacetilo
y el α naftol sirve como catalizador para producir un complejo de color rojo.
Procedimiento: Se usa el mismo caldo de enriquecimiento para las dos
pruebas (2ml), se hace la inoculación del microorganismo, y se lleva a
incubar a 35ºC durante como mínimo 24-72hs..
Luego se lo divide en dos partes, una para la prueba de RM y otra para la
de VP.
Rojo de metilo: se agregan 3 gotas del reactivo de metilo, si en la
superficie del medio aparece un color rojo intenso es RM (+) =
microorganismos que utilizan la glucosa fermentándola hasta llegar a un pH
menor a 4,4.
VP: Se agrega 0.6 ml de alfa-naftol seguidos de 0,2 ml de KOH al 40%. Es
esencial que los reactivos se agreguen en este orden. El tubo se sacude
suavemente y luego se deja quieto de 10 a 15 min. La aparición de color
rojo = prueba (+) (presencia de acetil-metil-carbinol).
40. ONPG (O-NITROFENIL-β-
GALACTOPIRANÓSIDO)
Fundamento: Lo microorganismos lactosa (+) tienen β-galactosidasa y
permeasa, dos enzimas necesarias para la formación de ácidos a partir de
la lactosa
La permeasa es necesaria para que la molécula de lactosa ingrese en la
célula bacteriana.
Hay algunos microorganismo que son falsos lactosa (-) por carecer de
permeasa, pero sí tienen β-galactosidasa, en realidad son lactosas (+).
Esta prueba se hace con los microorganismo que dan lactosa (-)
Procedimiento: Hacer un inóculo con SF estéril, agregar un disco de papel
comercial, se agita y antes de los 2 minutos se debe leer.
Interpretación: Un color amarillo intenso nos indica que el microorganismo
es productor de β-galactosidasa= prueba (+).
Consideraciones
Se hace un inóculo del microorganismo en solución fisiológica estéril, se
agrega un disco de papel. Se lleva a incubar a 37ºC durante 24hs.
42. CITRATO
Fundamento: Sirve para poner de manifiesto aquellos
microorganismos que utilizan el citrato como única
fuente de carbono, el indicador es azul de bromo timol.
Procedimiento: El color original del medio es verde, y
se encuentra fraccionado en pico de flauta, la siembra
se hace por estría, se incuba 24-72hs a 35ºC.
Interpretación: Si el microorganismo utiliza citrato, se
produce alcalinización del medio de cultivo pasando éste
a color azul intenso, lo cual indica prueba positiva para
el citrato.
44. UREA:
Fundamento: Sirve para poner de manifiesto aquellos
microorganismo que poseen la enzima ureasa.
Procedimiento: El medio fraccionado en pico de flauta
contiene urea y rojo de fenol como indicador, el color
original del medio es amarillo (o sea ácido) La siembra
se realiza con ansa de punta tanto en profundidad como
en la superficie. Se deja incubar 24 hs a 35º C.
Interpretación: Si el microorganismo es productor de
ureasa, desdobla la urea produciendo amoníaco,
consecuentemente produce alcalinidad que se
manifiesta porque el medio toma un color fucsia.
46. FENIL-ALANINA-DESAMINASA:
Fundamento: Sirve para poner de manifiesto aquellos
microorganismo que poseen la enzima FENIL-
ALANINA-DESAMINASA. El medio se prepara con un
pico de flauta largo, pues la lectura se hace sobre la
superficie del medio de cultivo.
Procedimiento: Se siembra sobre la superficie del
medio solamente, se incuba 24 hs a 35º C, se revela
con cloruro férrico.
Interpretación: El color original es amarillo, si el
microorganismo es productor de la enzima, al agregar
sobre el medio cloruro férrico, ésta se pone de
manifiesto, dando a la superficie un color verde intenso.
48. AMINOÁCIDOS:
DESCARBOXILASAS:
Fundamento: Las descarboxilasas son enzimas sustrato-
específicas (presentes o no en los microorganismos) capaces de
reaccionar con la porción carboxilo (COOH) de AA formando
aminas de reacción alcalina. Esta reacción, conocida como
descarboxilación, forma C02 como producto secundario. Cada
descarboxilasa es específica para un aminoácido.
Lisina, arginina y ornitina son los aminoácidos evaluados de rutina
en la identificación de enterobacterias.
El medio Moeller es la base (semi-sólida) que se emplea con más
frecuencia. El aminoácido se agrega a la base. El color original es
lila.
Procedimiento: Se inoculan por punción 2 tubos y se sellan con
aceite mineral. Uno de los tubos contiene el AA y el otro no.
Interpretación: Si el aminoácido es descarboxilado, se forman
aminas alcalinas y el medio pasa a violeta más intenso. Si no es
descarboxilado pero fermenta la glucosa, vira al amarillo por la
formación de ácidos
50. LIA:
Agar de ensayo para la demostración simultánea de lisina decarboxilasa
(LD) y de la formación de hidrogeno sulfurado (H2S) para la identificación
de enterobacterias.
► La lisina puede ser descarboxilada por microorganismos LD positivas
que la transforman en la amina cadaverina. Esto produce un viraje al
violeta del indicador de pH púrpura de bromocresol,puesto que la
descarboxilación sólo tiene lugar en medio ácido (pH inferior a
6.0). Es necesario que se produzca previamente la acidificación del medio
decultivo, por fermentación de la glucosa. Este medio de cultivo solo
puede utilizarse para la diferenciación de bacterias que fermentan
glucosa.
► Los microorganismos LD negativos, pero fermentadores de la glucosa,
producen un viraje al amarillo de la totalidad del medio de cultivo. La
incubación prolongada puede ocasionar alcalinización en la zona de la
superficie del medio de cultivo y en consecuencia, se produce un viraje al
violeta. La formación de H2S produce una coloración negra debido al
sulfuro de hierro producido.
