2. Aplicaciones
Purificación,
Purificación análisis y caracterización de proteínas
Determinar la masa relativa de una proteína
Verificar la concentración de proteinas
V ifi l ió d i
Detección de modificaciones en las proteínas
Expresión Global de proteinas (E 2 dimensiones)
Isoelectroenfoque (IEF)
SDS-PAGE
Mapeo de péptidos (digestión proteolítica)
Inmunoblotting
3. Amino ácidos como electrolitos
pI: carga neta es igual a cero
pK1 + pK 2
pI =
2
7. Electroforesis
El término electroforesis fue
introducido por primera vez en
1907 por Michaelis, técnica en la
cual una partícula cargada
(proteína)
( t í ) se h hace ddesplazar a
l
través de un medio (gel de
poliacrilaminida, agarosa, papel)
aplicando un campo eléctrico.
Paramentros que influyen:
Voltaje
Distancia entre los electrodos
Tamaño y forma de la molécula
Temperatura
Tiempo
8. La velocidad de migración depende de dos factores
Conduciendo l
C d i d el movimiento está l f
i i t tá la fuerza qε ejercida por
j id
el campo eléctrico sobre la partícula
q es la carga de la molécula (columbios)
ε es la fuerza del campo eléctrico (voltios por metro)
Resistiendo el movimiento esta la fuerza de fricción fv del
medio sobre la partícula
v es la velocidad de la partícula
f es el coeficciente de fricción
fv = qε
q
9. Geles de poliacrilamida: Continuos y discontinuos
Buffer continuo o discontinuo
Geles continuos: (Weber and Osborn 1969)
[ ] ctte de acrilamida
Buffer constante
Existe un único gel separador que emplea el mismo tampón en los
tanques y en el gel.
Geles discontinuos:(Laemmli 1970)
“geles de apilamiento” poro no restrictivo (3-4%T)
“Geles de resolución o separador ” (7-25% T)
En este sistema cada uno de los geles se prepara con tampones de
diferente pH y fuerza iónica, y el tampón de electroforesis es un tercer
tipo de tampón
11. Geles de Poliacrilamida
El tamaño del poro porcentaje de acrilamida
Alto (10-15%T) son óptimos para la separación de
proteínas de pequeño tamaño (menores de 50KDa)
Menores (<10%T) son los indicados para la separación de
proteínas mayores.
La relación utilizada entre acrilamida y bisacrilamida es
37,5:1.
12. Tamaño del poro del gel es el mejor factor
para determinar la resolución de las protínas (Hjertén 1962)
T = total de la concentración en porcentaje de los monómeros
( acrylamide pluss N N’
l id l N,N’-methylenebisacrylamide)
th l bi l id )
%T = acrilamida (gr) + bisacrilamida (gr) * 100
100 ml
C = es el porcentaje (por peso) de los enlaces cruzados N,N’-
l t j ( )d l l d N N’
methylenebisacrylamide relativos al total de los monomeros
%C = bisacrilamida (gr) * 100
acrilamida (gr) + bisacrilamida
El tamaño del poro es inversamente proporcional a %T
13.
14. Otros factores
Composición del buffer: Tripsina (pk 8.15) en vez de
glicina (pk 9 6) facilita
9.6) la resolución de péptidos
pequeños (Schanger and von Jagow 1987)
pH: Las propiedades de tamizado son alteradas
Incremento de pH de 8.9 a 9.2 se realiza para incluir
p p
proteinas de baja masa molecular (10-20 K) sin sacrificar
la resolución
Aditivos a los geles: Los detergentes (tritonx100, SDS) y
polímeros como dextran ficoll entre otros inhiben la
dextran,
polimeración de la acrilamida generando poros de
tamaño grande
16. Determinación de la masa molecular (Mr) de una proteína
Electroforesis en gel con SDS
Determinar el peso molecular nativo
Las estructuras 2 3 y 4 de las proteínas se
2,
descomponen
La cadena se rodea del SDS
Carga es insignificante
Carga y longitud son proporcionales al tamaño
de la cadena
17. Colorantes Video
Las proteínas separadas mediante SDS-PAGE pueden
ser visualizadas en el gel mediante diversos métodos de
i li d l l di di é d d
tinción:
Azul
A l coomassie (sensibilidad hasta 50 ng)
Fluorescencia SYPRO RUBY (280 nm y 450/610 nm)
(sensibilidad hasta 50 ng)
Coloración de Plata compatible con espectrofotometría
de masas (Sensibilidad 1 a 2 ng)
18. 2D
2D- PAGE
Separación de mezclas de proteínas altamente complejas
Las
L proteínas son separadas secuencialmente por d criterios
t í d i l t dos it i
físicos:
En primer lugar son separadas en un gel con gradiente de pH en
condiciones desnaturalizantes de acuerdo con su punto
isoeléctrico (isoelectroenfoque)
(isoelectroenfoque).
Segundo lugar tras esta separación por carga son separadas de
acuerdo con su masa molecular por electroforesis discontinua en
gel de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE).
La tinción del gel permite que las proteínas aparezcan formando
manchas circulares (spots).
( p )
25. Preparación de las muestras
Lisis de las células o destrucción de los tejidos
j
Baja T
Inhibidores de proteasas
Sustancias interferentes (removidas con ácido
tricloroacetico)
Reactivos de calidad
Preparar la muestras y realizar inmediatamente el IEF
Separar todas las partículas por centrifugación
d l í l f ó
26. Solubilización de las proteínas
Completamente solubilizada, disgregada, denaturada y
reducida antes de aplicar el IEF para lo cual se requiere:
d id t d li l l l i
Un agente denat ante UREA o tio ea
denaturante tiourea
[] 2 a 8M
Un detergente neutro o zwitterionico (Triton X SDS)
X,
[] final 0,25% (w/v) o inferior
Un agente reductor (puentes disulfuro y sulfidricos)
2-mercaptoetanol
[]20 a 100 mM
Buffers o anfolitos transportadores
[] 40 mM o 2% (v/v)
27. Interferencias: Intervienen en l separación y visualización
I t i la ió i li ió
Moléculas iónicas pequeñas
Endógenas (metabólicos en tejidos y sales en suero)
Exógenas (Buffer residual y sales)
Interfieren en la separación de la 1D incrementan
conductividad reducen la efectividad del IEF
Acumulación el Á Ánodo o Cátodo en la tira
Soluciones:
Precipitar l proteinas (TCA) y resuspenderlas en soluciones
las ( ) d l l
libres de sales
Diálisis retirar sales
28. Interferencias: Intervienen en l separación y visualización
I t i la ió i li ió
Ácidos Nucleídos
ADN o ARN
Pobre enfoque en la región de ácida del gel IEF
Generan background en geles 2D coloreados con plata
Soluciones:
Removerlos por ultracentrifugación
ó
Adicionar nucleasas ( 1 mg/ml Dnasa I, o,25 mg/ml RNasa)
Adicionar urea
Emplear Benzonasa endonucleasa bacteriana
29. Interferencias: Intervienen en l separación y visualización
I t i la ió i li ió
Lípidos
Forman complejos con:
Las proteínas: reducen la solubilidad
Los detergentes: reducen su efectividad
Solución:
Precipitarlos con solventes orgánicos
á
Usando un exceso de detergente
30. Interferencias: Intervienen en l separación y visualización
I t i la ió i li ió
Compuestos fenolicos
Modifican las proteínas reacciones de oxido reducción
Soluciones:
Emplear diotreitol (DTT) durante la extracción
Técnicas de precipitación
Enzima fenol oxidasa es inhibida por la tiourea
Secuestrados por polivinilpirrolidona
31. Colorantes
Azul coomassie (aminotriarilmetano)
aminotriarilmetano)
Robert Webster y Stephen Fazekas 1963
No forma complejos covalentes con las proteínas
Fuerzas de van der Waals einteracciones con grupos
aminos
Fuertemente protonado
(a.a. básicos) Arginina, lisina, tirosina y histidina
Ley de Beer -Lambert
Sensibilidad hasta 50 ng
33. Colorantes
Coloración de Plata amoniacal. Switzer et al 1979
Alta sensibilidad
Problemas background alto
Rabilloud et al 1994 en 100 protocolos: cinco pasos
Fijación
Sensibilicación
Impregnación con plata
p g p
Revelar la imagen
Estabilización de la imagen
Sensibilidad 2 a 4 ng de proteína en spot
Calidad del agua: Agua desionizada con una resistividad de
más 15 moh/cm para la soluciones y lavados
Agua destilada no puede ser usada
Espectrometría de masas compatible con coloración de plata
34. Coloración de Plata amoniacal.
amoniacal
Las proteínas se separan con
4.20% de SDS-gel
g de
poliacrilamida y se visualizaron
mediante tinción de plata.
Punta de flecha indica co-
inmunoprecipitadas proteínas.
Fuente: Purificación de un complejo de proteínas
que se asocia con la cromatina. Masahiro Okada,
maokada@lab.nig.ac.jp, Departamento de Genética
Molecular del Instituto Nacional de Genética y de la
Universidad de Graduados de Estudios Avanzados
Avanzados,
Mishima, Shizuoka 411-8540, Japón
35. Colorantes
Fluorescencia SYPRO RUBY
Estructura del colorante no es de dominio publico
Forma un complejo orgánico con metales que se une
directamente por mecanismos electrostáticos
á
(280 nm y 450/610 nm) (sensibilidad hasta 50 ng)
Interacciona con los a.a. básicos Arginina, lisina y
histidina
Muy costoso
37. Transferencia de proteínas Video
Western blotting (Towbin et al 1979): es una técnica
1979)
usada para identificar y localizar proteínas en función de
su capacidad para unirse a los anticuerpos específicos.
38. Visualización
Densitómetros
Escáner de fluorescencia
Funcionan con softwares de análisis diseñados para p
detectar y cuantificar “spots” en las imágenes digitales
así como para comparar y analizar estadísticamente los
geles d i
l de interés
é
El software de análisis usado en el Servicio es el
PDQuest de Bio Rad Se ofrece la opción de usar el
Bio-Rad.
software Decyder de GE para análisis de imágenes
DIGE.
40. Análisis de los geles 2D
Detectar y cuantificar proteínas
Identificar cambios en la expresión de proteínas
Software:
Z3 (Compugen)
Melanie III (Genebio and Bio-Rad)
Bio Rad)
PDQuest (Bio-Rad)
Phoretix 2D advance (PerkinElmer Wallac)
( )
41. Análisis de los geles 2D
Parámetros:
Sensibilidad, tamaño del pozo, reducción del background y
número de smooths
