Este documento resume um trabalho prático sobre a micropropagação da videira realizado por estudantes de Genética Molecular e Biotecnologia. O objetivo era estudar o efeito de diferentes meios de cultura no crescimento de microestacas de videira. Foram utilizados cinco meios contendo diferentes concentrações de citoquininas e auxinas. Os resultados obtidos ao longo de três semanas mostraram que os meios suplementados promoveram melhor desenvolvimento dos rebentos.

1. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
GENÉTICA
MOLECULAR E
BIOTECNOLOGIA
MICROPROPAGAÇÃO DE
VIDEIRA
Docente: Fernanda Leal
Discentes:
CRISTIANA VALENTE Nº 33708;
DAVID RODRIGUES Nº 33714;
FRANCISCO PINTO Nº 33707;
LUÍS SAMPAIO Nº 33706;
PEDRO VEIGA Nº 33698

2. Índice
Introdução ..................................................................................................................................... 3
Aplicações da Micropropagação ............................................................................................... 4
Vantagens da micropropagação................................................................................................ 4
Desvantagens da micropropagação .......................................................................................... 5
Fases da micropropagação ........................................................................................................ 5
Principais classes de hormonas vegetais e suas características................................................ 6
Auxinas .................................................................................................................................. 6
Citoquininas/citocininas ........................................................................................................ 6
Giberelinas ............................................................................................................................ 7
Objectivos do trabalho prático...................................................................................................... 7
Material utilizado .......................................................................................................................... 7
Procedimentos ............................................................................................................................... 8
Cultura da videira ...................................................................................................................... 8
Resultados ..................................................................................................................................... 8
Discussão ..................................................................................................................................... 12
Conclusão .................................................................................................................................... 13
Bibliografia .................................................................................................................................. 14
ANEXO ......................................................................................................................................... 15
2

3. Introdução
Micropropagação é um termo que foi utilizado pela primeira vez por Hartman e
Kester (1975) que passou a ser empregado para definir os processos de propagação
vegetativa na cultura de tecidos vegetais (2).
A micropropagação, ou propagação vegetativa in vitro, é uma das aplicações da
cultura de tecidos de mais larga utilização. Destina-se principalmente àquelas espécies
que são de difícil propagação pelos métodos convencionais, permitindo a obtenção de
grande número de plantas sadias e geneticamente uniformes em curto período de
tempo (3).
Sua aplicabilidade está baseada na teoria da totipotência, a qual estabelece que
qualquer parte do vegetal, por menor que seja, tem capacidade de originar uma nova
planta, desde que sejam fornecidas as condições adequadas. Com base nesta teoria,
pode-se inferir que qualquer espécie vegetal tem a capacidade de ser micropropagada,
a partir de qualquer parte da planta. Contudo, na prática, muitas espécies são difíceis
de serem micropropagadas e são chamadas de recalcitrantes (3).
Para que se criem plantas por micropropagação, é necessário obter uma ou
várias células indiferenciadas (células potencialmente mais totipotentes) do
parênquima (tecido pouco especializado que forma a parte interior de muitos órgãos)
ou um explante da planta-mãe (4).
A indução da multiplicação de explants cultivados in vitro dá-se através da
interação entre o potencial inerente do explant utilizado e os fitorreguladores. Quando
nesta multiplicação ocorre a formação direta de uma ou mais gemas, esta é chamada
de organogênese direta. E quando antes da formação de uma nova gema ocorre a
formação de calos, esta é chamada de organogênese indireta (3).
A pequena quantidade de tecido que forma o explante pode ser tão pequeno
como um pequeno conjunto de células, e é colocado num meio de cultura adequado
ao seu crescimento, contendo nutrientes e hormonas, nomeadamente sacarose como
fonte de energia e hormonas de crescimento. O tecido da planta começa então a
crescer, formando uma massa de células indiferenciadas denominada tecido caloso.
Este tecido continua a crescer e a diferenciar-se em novos tecidos específicos,
3

4. originando uma planta. Numa fase final, as plantas são transferidas para o solo, ou,
mais comummente, para vasos com composto orgânico para um crescimento contínuo
através dos métodos convencionais (4).
Num sistema comercial de micropropagação, o objetivo é a multiplicação o
mais fiel possível do material original (clonagem), para que sejam mantidas as
características comerciais deste material. Assim, para a manutenção desta fidelidade, é
importante que se evite a organogênese indireta, pois a formação de calii pode dar
origem a instabilidades genéticas indesejáveis que virão a se multiplicar durante o
processo de micropropagação, vindo a produzir indivíduos com características
diferentes do original (3).
Aplicações da Micropropagação (5):
•Produção de plantas livres de patógenos;
•Produção de sementes sintéticas;
•Pesquisa básica de fisiologia vegetal;
•Produção de metabólitos secundários;
•Armazenamento e manejo de germoplasma;
•Propagação em massa;
•Seleção in vitro;
•Aumento da variabilidade genética;
•Resgate de embriões imaturos;
•Quebra de barreiras de incompatibilidade genéticas;
•Clonagem em pequena escala de genótipos especiais;
Como todas as técnicas, a micropropagação apresenta vantagens e
desvantagens (2).
Vantagens da micropropagação

Produz plantas livres de doenças.

Produz plântulas enraizadas prontas para a plantação e crescimento, o que é
melhor do que o recurso a sementes e a estacas.
4

5. 
Possui uma fecundidade extremamente elevada, pelo que se obtêm milhares
de plantas enquanto que através das técnicas convencionais se obtém apenas
entre dezenas a centenas de plantas no mesmo período de tempo.

É o único método viável para a regeneração de células genéticamente
modificadas e para células resultantes da fusão de protoplastos.

É um bom método de multiplicar plantas que não produzam sementes ou que
apenas produzam em quantidades pouco lucrativas.

A micropropagação produz plantas mais resistentes, com um crescimento mais
rápido do que as plantas produzidas através de métodos convencionais.
Desvantagens da micropropagação

É um processo muito dispendioso e pode ter um custo laboral superior a 70%.

Uma planta infectada pode produzir clones infectados. Isto é incomum, já que
as plantas em stock são seleccionadas e vedadas com cuidado para evitar isto.

A maioria das plantas irá naturalmente produzir sementes, que normalmente
são livres de doenças e que crescerão rapidamente sob boas condições. O
número de semente produzidas varia, mas é normalmente aceitável para a
multiplicação e é de graça. Por esta razão, muitos criadores de plantas nunca
recorrerão à micropropagação devido ao seu custo proibitivo.
Fases da micropropagação
1)
Escolha da planta mãe, desinfecção e instalação em cultura do material
vegetal;
2)
Multiplicação dos explants (rebentos), pelo uso de citoquinina;
3)
Alongamento dos rebentos, primeiro individualiza-se os rebentos e
coloca-se em meios com auxina;
4)
Enreizamento, podendo ser necessário utilizar uma auxina diferente da
anterior;
5)
Aclimatização, adaptação da plântula às condições do meio exterior
(temperatura, humidade e luminosidade).
(6)
Os explants são colocados em meios de cultura adequados ao seu crescimento,
contendo: sais minerais, vitaminas, fontes de ferro e de carbono, reguladores de
5

6. crescimento (hormonas ou reguladores sintéticos) e possivelmente algumas
substâncias orgânicas (6).
O tecido começa a desenvolver-se e origina uma massa de células
indiferenciadas, o tecido caloso. Este continua o seu processo de crescimento e
diferenciação dando origem a tecidos especializados e formando uma plântula (6).
Na fase final da micropropagação (aclimatização) as plântulas são transferidas
normalmente para vasos com composto orgânico ou para o solo.
O desenvolvimento da planta é condicionado pela interacção de factores
intrínsecos e pela variação das condições ambientais. As plantas são organismos muito
organizados quer em forma quer em função, sendo as hormonas os agentes
responsáveis pelos processos de crescimento e de organização.
Consoante as características químicas e os efeitos que as hormonas exercem
sobre as plantas, podemos agrupa-las em classes.
Principais classes de hormonas vegetais e suas características
Auxinas – são compostos que conduzem ao alongamento celular, são
sintetizadas nos meristemas apicais caulinares, nos primórdios foliares, nas folhas
jovens, e nas sementes em desenvolvimento e conseguem espalhar-se por toda a
planta. Esta hormona modifica a permeabilidade da membrana plasmática e promove
a formação de tecido caloso. Quando presente em doses excessivas a auxina inibe a
formação de raízes, considerando-se assim a raiz mais sensível à auxina que o tecido
do caule. Em doses extremamente elevadas a auxina pode estimular a síntese de
etileno e causar efeitos negativos no crescimento do tecido ou mesmo a sua morte (9).
Citoquininas/citocininas – as citoquininas são as hormonas vegetais
responsáveis pela divisão celular. Estas são produzidas em qualquer tecido vegetal,
mas é nas raízes que a sua produção se destaca. As citoquininas só actuam em
conjunto com as auxinas. São responsáveis pela diferenciação celular, e por isso, tem
um papel fundamental na organogénese. Esta hormona inibe a senescência
(envelhecimento) (10 e 11).
6

7. Giberelinas – são produzidas nas folhas, nos embriões, nos frutos e nas
sementes. Promovem a germinação de sementes, uma vez que, interrompem o seu
período de latência. Estas promovem o crescimento vegetativo das plantas, aceleram a
distensão celular, e ainda, actuam no alongamento entre os nós. As giberelinas não
são produzidas por plantas anãs (12).
A micropropagação da videira esta numa fase experimental e desempenha um
papel importante na multiplicação rápida deste material, permitindo assim, uma
grande disponibilidade de material vegetativo com qualidade. A micropropagação é
muito importante na reestruturação vinhas velhas (7).
Objectivos do trabalho prático
- Estudar o efeito da composição dos diferentes meios de cultura na cultura in
vitro da videira. Para tal, utilizam-se cinco meios de cultura: o meio de Murashige e
Skoog junto com 1 e 2 mg/l de BAP e com 1 e 2 mg/i de IBA (7).
Material utilizado


Microestacas a um gomo de Vitis sp. já desinfectadas;
Folhas com pecíolo de Saintpaulia ionantha já desinfectadas;

Frascos de meio de cultura:
 M.S.
 M.S. + 1 mg/l de BAP
 M.S. + 2 mg/l de BAP
 M.S. + 1 mg/l de IBA
 M.S. + 2 mg/l de IBA

Pinças e bisturis;

Material de vidro diverso;

Papel esterilizado;

Folha de registos.
7

8. Procedimentos
O trabalho prático foi realizado na câmara de fluxo laminar, em condições de
assepsia. Antes de iniciar o trabalho, embebemos algodão em álcool a 70% e limpamos
a bancada, fazendo movimentos paralelos, sem passar com algodão duas vezes no
mesmo local. Arregaçamos as mangas e retiramos qualquer objecto que tínhamos nas
mãos ou pulsos, tais como, pulseiras e anéis, e de seguida desinfectamos as mãos com
álcool.
Antes de utilizarmos o material, este foi passado por álcool a 95% e flamejado.
Todo o material vegetal foi manuseado junto à lamparina, e após colocar os explants no
meio de cultura e antes de fechar os frascos, abertura do frasco foi passada pela chama.
Cultura da videira
1)
Retiramos uma folha de papel esterilizado;
2)
Retiramos do goblet um rebento, o qual foi previamente sujeito a um
tratamento de desinfecção:
3)
Retiramos os tecidos queimados a seccionar e seccionamos o rebento em
microestacas de um gomo com o auxílio de pinça e bisturi;
4)
Inoculamos duas microestacas no frasco, enterrando-as cerca de 0,5 cm.
Tapamos o frasco com papel de alumínio e selar com parafilm;
5)
Rotulamos os frascos com o meio de cultura e material vegetal utilizado,
grupo, curso e data da cultura;
6)
Repetimos estas operações para inocular as microestacas no segundo frasco;
7)
Colocamos todos os frascos na câmara de crescimento à temperatura de 25ºC
com um fotoperíodo de 16 horas.
Nas seis semanas seguintes após a colocação dos explants em cultura, observamos
semanalmente o material, tendo em conta alguns parâmetros que caracterizaram o seu
desenvolvimento e crescimento, tais como, número de raízes por explant, comprimento
de raízes, número de rebentos e comprimento dos rebentos.
Resultados
Em anexo encontram-se as tabelas com os resultados a partir dos quais foram
feitos os seguintes gráficos .
8

9. 4
3,5
3
2,5
2
!
1,5
1
0,5
0
MS
MS+1BAP
MS+1BAP+0,2NAA
1ª semana
2ª semana
MS+2BAP
MS+2BAP+0,2NAA
3ª semana
Figura 1 – Número médio de rebentos
80
70
60
50
40
!
30
20
10
0
MS
MS+1BAP
MS+1BAP+0,2NAA
1ª semana
2ª semana
MS+2BAP
MS+2BAP+0,2NAA
3ª semana
Figura 2 - Comprimento total médio dos rebentos (mm).
9

10. 4
3,5
3
2,5
2
!
1,5
1
0,5
0
MS
MS+1BAP
MS+1BAP+0,2NAA
1ª semana
2ª semana
MS+2BAP
MS+2BAP+0,2NAA
3ª semana
Figura 3 - Número médio de entrenós no rebento principal.
10
9
8
7
6
5
!
4
3
2
1
0
MS
MS+1BAP
1ª semana
MS+1BAP+0,2NAA
2ª semana
MS+2BAP
MS+2BAP+0,2NAA
3ª semana
Figura 4 - Total médio de entrenós.
10

11. 9
8
7
6
5
4
!
3
2
1
0
MS
MS+1BAP
MS+1BAP+0,2NAA
1ª semana
2ª semana
MS+2BAP
MS+2BAP+0,2NAA
3ª semana
Figura 5 - Número médio de raízes.
120
100
80
60
!
40
20
0
MS
MS+1BAP
MS+1BAP+0,2NAA
1ª semana
2ª semana
MS+2BAP
MS+2BAP+0,2NAA
3ª semana
Figura 6 - Comprimento médio das raízes
11

12. 14
12
10
8
6
!
4
2
0
MS
MS+1BAP
1ª semana
MS+1BAP+0,2NAA
2ª semana
MS+2BAP
MS+2BAP+0,2NAA
3ª semana
Figura 7 - Diâmetro total médio de calli (mm).
Discussão
Podemos observar que os meios que possuem BAP (citoquinina) mas não NAA
(auxina) desenvolvem mais rebentos, seguindo-se os meios que têm BAP e NAA. Podese também verificar que os que tem 2 miligramas de BAP desenvolvem menos
rebentos que os que tem apenas 1 miligrama de BAP.
Podemos observar que é nos meios com BAP e sem NAA que os rebentos
atingem comprimentos mais longos e é nos meios com NAA que atingem
comprimentos menores. Pode-se também verificar que nos meios com dois miligramas
de BAP os rebentos atingem comprimentos inferiores do que nos meios com um
miligrama de BAP.
Podemos observar, mas com pouca diferença, que os meios que possuem dois
miligramas de BAP e NAA são os que proporcionaram um maior desenvolvimento no
número de entrenós no rebento principal. Nos outros meios o desenvolvimento é
pouco diferenciado.
Podemos observar que os meios com BAP e sem NAA são os que permitem um
desenvolvimento superior de entrenós em termos de número e os que tem NAA são os
seguintes.
12

13. Podemos observar que os meios com um miligrama de BAP e NAA são aqueles
que permitem um maior desenvolvimento do número de raízes e que os com um
miligrama de BAP e sem NAA não apresentaram desenvolvimento. Podemos também
verificar que os meios que tinham dois miligramas de BAP apresentaram algum
desenvolvimento, mas muito inferior ao de um miligrama de BAP e NAA e ainda assim
inferior ao meio com apenas MS.
Podemos observar que os meios com um miligrama de BAP e NAA são aqueles
que permitem um maior desenvolvimento das raizes em termos de comprimento,
muito semelhante, mas ainda assim superior ao observado no meio com apenas MS.
Podemos verificar que os meios com dois miligramas de BAP apresentaram um
desenvolvimento muito reduzido e semelhante e que os meios com apenas um
miligrama de BAP não apresentaram desenvolvimento.
Podemos observar que os meios apenas com BAP não apresentaram
desenvolvimento de calli e que os meios com BAP e NAA apresentaram um grande
desenvolvimento deste. Podemos também observar que os meios apenas com MS
apresentaram algum desenvolvimento de calli.
Conclusão
A partir dos resultados observados sobre o desenvolvimento de rebentos
podemos concluir que o BAP o promove em número e comprimento, mas que quando
em miligramas demasiado elevadas começa a inibir o crescimento. Podemos também
concluir que o NAA tem efeitos de inibidor do desenvolvimento dos rebentos quando
adicionado a um meio com BAP, podendo levar a um desenvolvimento inferior do que
quando há uma total ausência de hormonas.
A partir dos resultados observados sobre o desenvolvimento de entrenós
podemos concluir que a presença de BAP favorece o seu desenvolvimento, não
havendo uma distinção acentuada se se adicionou apenas um miligrama ou duas.
Podemos também concluir que o NAA tem efeitos de inibidor no desenvolvimento de
rebentos quando presente nos meios com BAP. Quanto ao desenvolvimento de
entrenós apenas no rebento principal não podemos tirar conclusões seguras porque os
resultados são muito semelhantes em todos os meios.
13

14. A partir dos dados observados sobre o desenvolvimento das raízes podemos
concluir que o BAP é um inibidor do desenvolvimento de raizes, não permitindo o seu
desenvolvimento quando apenas em um miligrama. Apresenta no entanto algum
desenvolvimento, muito reduzido, quando presentes dois miligramas desta hormona,
provavelmente porque esta se inibe a si mesma quando em quantidades exageradas.
Dado o vigoroso desenvolvimento das raizes quando presente NAA,
especificamente no meio com apenas um miligrama de BAP, podemos concluir que
esta hormona promove fortemente a rizogénese, excepto quando presentes dois
miligramas de BAP.
A partir dos dados observados sobre o desenvolvimento do calli podemos
concluir que o BAP é um inibidor deste, pois não apresenta desenvolvimento quando
este está presente, excepto quando está presente NAA, sendo portanto este um
indutor.
Podemos assim concluir que meios de cultura com diferentes hormonas têm
diferentes efeitos no desenvolvimento dos explants.
Bibliografia
12345678910111213-
Foto da capa: http://portugues.torange.biz/download/5269.html?hard=1&photo=1;
http://pt.wikipedia.org/wiki/Micropropaga%C3%A7%C3%A3o
http://pt.scribd.com/doc/53049823/21/Micropropagacao
http://osverdocas.wordpress.com/micropropagacao-vegetativa-2/
http://pt.scribd.com/doc/28390758/MICROPROPAGACAO-Propagacao-Vegetativa-inVitro;
Apontamentos das aulas
Protocolo
http://www.cultivando.com.br/termos_tecnicas_multiplicando_micropropagacao.htm
l
http://pt.wikipedia.org/wiki/Auxina
http://pt.wikipedia.org/wiki/Citocinina
http://www.mundoeducacao.com.br/biologia/citocininas.htm
http://www.mundoeducacao.com.br/biologia/giberelinas.htm
http://br.monografias.com/trabalhos/estabelecimento-in-vitro-portaenxertos/estabelecimento-in-vitro-porta-enxertos.shtml
14

15. ANEXO
15