Este documento presenta una investigación sobre el diseño de inhibidores multidiana para la enfermedad de Alzheimer. Se centra en dos dianas enzimáticas clave: la enzima β-secretasa (BACE-1), que participa en la formación de péptidos amiloides, y la acetilcolinesterasa (AChE), involucrada en la agregación de estos péptidos. El estudio utiliza como punto de partida diferentes análogos de un conocido inhibidor de BACE-1 a nivel micromolar cuya estructura ha sido determinada.
Carmen Gloria Déniz Ojeda - Accidente cerebrovascular (ictus)
TFG. Cristina Lia Fernández Regueiro
1. Diseño de
fármacos
multidiana para
la Enfermedad
de Alzheimer
Cristina Lía Fernández Regueiro
Santiago de Compostela
Septiembre 2014
Grado en Química
Curso 2013-2014
Departamento de Química Orgánica
Facultad de Química
2. i
María del Carmen Villaverde Cameron‐Walker, Catedrática del Departamento de
Química Orgánica de la Universidad de Santiago de Compostela; Fredy Sussman,
Investigador del Departamento de Química Orgánica de la Universidad de Santiago de
Compostela.
CERTIFICAN
Que la presente memoria, titulada: "Búsqueda de inhibidores multidiana para la
Enfermedad de Alzheimer.", realizada por la alumna Cristina Lía Fernández Regueiro
reúne todos los requisitos y condiciones necesarias como trabajo de Fin de Grado. Y
para que conste, dan el visto bueno para su presentación en la Facultad de Química de la
Universidad de Santiago de Compostela.
En Santiago de Compostela, a 8 de Septiembre de 2014
M. Carmen Villaverde Fredy Sussman
4. iii
ÍNDICE
RESUMEN ............................................................................................................ v
ABSTRACT ......................................................................................................... vi
1. INTRODUCCIÓN............................................................................................ 1
1.1 La enfermedad de Alzheimer.................................................................. 2
1.2 Causas de la enfermedad de Alzheimer.................................................. 3
1.2.1 La hipótesis β-amiloide....................................................................... 3
1.3 Tratamiento y prevención. ..................................................................... 4
1.3.1 Terapia paliativa. La terapia colinérgica........................................... 4
1.3.2 Terapias preventivas........................................................................... 5
1.4 Dianas farmacológicas............................................................................ 5
1.4.1 Enzima β-secretasa ............................................................................. 5
1.4.2 Enzima acetilcolinestarasa ................................................................. 7
1.5 Inhibidores multidiana ............................................................................ 9
2. OBJETIVOS ................................................................................................... 11
3. METODOLOGÍA........................................................................................... 13
3.1 Descripción del Software...................................................................... 14
5. iv
3.1.1 Gold Suite 5.2.................................................................................... 14
3.1.2 Discovery Studio. .............................................................................. 14
3.1.3 Swiss PDB Viewer............................................................................. 14
3.1.4 ChemBioOffice.................................................................................. 15
3.2 Selección de candidatos........................................................................ 15
3.3 Simulación de acoplamiento proteína ligando. Docking...................... 18
3.3.1 Acoplamiento en BACE-1. ................................................................ 18
3.3.2 Acoplamiento en AChE..................................................................... 21
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.................................................................... 22
5.1 Estudios de acoplamiento en BACE-1.................................................. 23
5.1.1 Estudio de la apertura de flap para el complejo 3MSL.................... 23
5.1.2 Selfdocking del ligando 3MSL .......................................................... 25
5.1.3 Acoplamiento a pH de cristalización (7.4). ...................................... 25
5.1.4 Acoplamiento a pH de actividad enzimática (4.5)............................ 29
5.2 Acoplamiento en AChE........................................................................ 31
5.3 Inhibidores multidiana .......................................................................... 36
6. CONCLUSIONES .......................................................................................... 37
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................ 40
6. v
RESUMEN
La enfermedad de Alzheimer (EA), es un desorden neurodegenerativo progresivo
cuyos principales efectos se manifiestan con la pérdida de memoria a corto plazo,
seguido por un empeoramiento general y conduciendo finalmente a la muerte. Hoy en
día, todavía no se ha encontrado ningún tratamiento que prevenga esta enfermedad, que
afecta a millones de personas en el mundo.
En este trabajo nos hemos centrado en el diseño de inhibidores multidiana para la
enfermedad de Alzheimer, especificamente para dos dianas enzimáticas que participan
en la formación de péptidos amiloides (BACE-1) y en su agregación (AChE).
Para nuestro estudio hemos utilizado como punto de partida diferentes análogos
de un conocido inhibidor a nivel micromolar, cuya complejo con BACE-1 ha sido
determinado estructuralmente (PDB id 3MSL).
Los estudios de docking a ambas dianas indican que un gran número de los
candidatos se unen a ambas dianas, con las interacciones especificadas para nuestro
inhibidor.
7. vi
ABSTRACT
Alzheimer's disease (AD) is a gradually worsening neurodegenerative disorder
whose principal signs are manifested with loss of short term memory, followed by a
worsening of dementia and ultimately, leading to the patient’s dismissal. Treatment to
prevent this disease, which affects millions of people in the worldwide, has yet to be
found.
The main aim of this research is the design of multi-target inhibitors to
Alzheimer’s disease. Specifically, we have centred our efforts on ttwo enzymatic targets
that participate in the amyloid peptide genesis (BACE.-1) and its aggregation as neuro-
toxic species (AChE).
As a starting point of our research, we have used a series of analogues of a known
micromolar, whose structure bound to BACE-1 inhibitor has been determined
structurally (PDB entry 3MSL).
The results of the docking studies indicate that many of the candidates should
bind to both targets, complying with the required interactions.
9. 2
1.1 La enfermedad de Alzheimer
La enfermedad de Alzheimer (EA), es un desorden neurodegenerativo progresivo
cuyos principales efectos se manifiestan con la pérdida de memoria a corto plazo,
seguido por un empeoramiento generalizado y conduciendo finalmente a la muerte.
Las primeras etapas de la EA, años antes de la manifestación de sus síntomas,
consisten en una destrucción de las conexiones sinápticas en el cerebro de forma
progresiva. Los primeros síntomas visibles son la pérdida de memoria a corto plazo. A
medida que la enfermedad avanza y el deterioro cerebral empeora, la capacidad
cognitiva del individuo se ve progresivamente más dañada, produciéndose mayores
lapsos de memoria y acabando con la pérdida del control motor. Finalmente, el daño
sináptico acumulado en la masa cerebral causa el colapso del sistema y la muerte del
paciente.1
Se estima que la demencia senil afecta a más de 35 millones de personas en el
mundo, siendo la EA la causa más común, llegando a suponer un 65% de los casos. Esta
demencia afecta principalmente a las personas mayores, aunque cada vez existen más
casos que se inician antes de los 65 años. Después de esta edad, la probabilidad de
desarrollar la enfermedad de Alzheimer se duplica cada 5 años aproximadamente.
Como podemos ver en la Figura 1, conforme la media de edad de la población
aumenta, se espera que el porcentaje de personas afectadas por la enfermedad aumente,
especialmente en países en desarrollo. Aproximadamente, 35.6 millones de personas se
veían afectadas por la EA y otras demencias en el mundo en el año 2010, número que se
estima que ascenderá a 65.7 millones en 2030 y a 115.4 millones en 2050.2
Figura 1. Gráfico del incremento de casos de demencia senil en países desarrollados (azul) y en
vías de desarrollo (rojo).2
10. 3
El implacable aumento de la población que sufre la EA, unido a los elevados
costes que supone el cuidado de sus pacientes (se calcula que los costes anuales
familiares y sociales derivados de la atención a pacientes con EA supusieron un 1.1%
del producto interior bruto de las naciones en Europa) 2,3
y la carencia de tratamientos
reales de la misma (solo existen tratamientos de carácter paliativo), han fomentado
múltiples estudios en instituciones académicas y por parte de la industria farmacéutica.
1.2 Causas de la enfermedad de Alzheimer.
Los cerebros de los pacientes con EA muestran dos lesiones características: las
placas seniles o amiloides (que son extracelulares) y ovillos neurofibrilares, formados
por la proteína Tau hiperfosforilada (intracelulares). Existen dos hipótesis principales
para explicar el origen y desarrollo de esta enfermedad en referencia este tipo de
lesiones: la hipótesis β-amiloide, que es la causa primaria de la enfermedad y la
hipótesis de Tau, que parece ser un evento más tardío.4
Nosotros nos centraremos en una explicación más detallada de la hipótesis β-
amiloide, pues es en la que se basan nuestros estudios.
1.2.1 La hipótesis β-amiloide.
La hipótesis de la cascada amiloide, explica el proceso degenerativo como una
serie de eventos moleculares que tienen su origen en la hidrólisis de la proteína
precursora del amiloide (PPA), y que concluye en el depósito patológico de péptidos
amiloides en placas.
La PPA es una proteína integral de membrana con una región extracelular de gran
tamaño. Su función se desconoce, pero se piensa que podría actuar como un factor del
crecimiento.4
Se trata de una proteína que ha despertado gran atención en el campo de
estudio de la enfermedad de Alzheimer, dado su papel en la generación de los péptidos
β-amiloide.
Como se ve en la Figura 2 la PPA se ve sometida a un proceso de hidrólisis
secuencial por parte de dos aspartilproteasas, la β-secretasa y la -secretasa, cuyo
resultado es a formación de los péptidos amiloides, de una longitud de 40 o 42 residuos,
denominados Aβ-40 y Aβ-42, respectivamente. El péptido Aβ-42 es el que presenta
11. 4
mayor toxicidad, pues se trata de una especie nociva para las conexiones sinápticas
entre las neuronas, y es el que produce los agregados tóxicos que desencadenan la
EA.5,6
Los enfermos de Alzheimer presentan mayores niveles del péptido Aβ-42 que de
Aβ-40 (que no es tóxico). Esto es debido a unas mutaciones en el gen PS1, una proteína
de transmembrana, que se asocia con otras tres proteínas del mismo tipo para formar el
complejo -secretasa.5
Figura 2. Esquema de la ruta patológica de la EA.6
Esta teoría ha sido probada para el caso de la EA temprana (también llamada
familiar, por su componente genético), pero todavía no está completamente demostrado
que esto sea cierto para los casos de la EA esporádica o tardía (más habitual que los
casos familiares), aunque toda la información disponible parece apoyar el caso.7
1.3 Tratamiento y prevención.
1.3.1 Terapia paliativa. La terapia colinérgica.
La neuropatología de la EA se caracteriza por la pérdida temprana de las neuronas
colinérgicas del cerebro anterior basal, llevando al decrecimiento de la transmisión
colinérgica, pues provoca una reducción de los niveles de acetilcolina (ACh), un
neurotrasmisor que comunica estas neuronas con otras y con algunos músculos, en las
regiones encargadas del aprendizaje, memoria, comportamiento y respuesta
emocional.7,8
12. 5
La acetilcolinesterasa (AChE) es la enzima encargada de degradar la acetilcolina
una vez la señal ha pasado. Un inhibidor que bloquee parcialmente la
acetilcolinestarasa, permitirá que los niveles de neurotrasmisores aumenten,
fortaleciendo la señal nerviosa, que permanece, y paliando los efectos nocivos para las
funciones cognitivas que derivan de la enfermedad.8
1.3.2 Terapias preventivas
Todavía no existen fármacos que prevengan la enfermedad de Alzheimer, pero si
se han empezado a estudiar algunos que puedan hacerlo.
Las terapias principales para la prevención de esta enfermedad son la terapia
amiloide, en la que nos centraremos nosotros, y la terapia Tau que se centra en la
inhibición de la hiperfosforilación de Tau o la prevención de la formación de ovillos
neurofibirlares.7
La terapia amiloide busca inhibidores de la formación de los péptidos Aβ y que
prevengan la generación de las placas amiloides. Esto se puede hacer utilizando
inhibidores de la -secretasa o la β-secretasa, que bloqueen la formación de Aβ-40 y
Aβ-42. Estudios con ratones han concluido en que los inhibidores de β-secretasa pueden
ser más seguros para la salud del paciente.9
1.4 Dianas farmacológicas
Aunque existen múltiples dianas farmacológicas para la enfermedad de
Alzheimer, aquí nos referiremos a la enzima β-secretasa y la enzima acetilcolinesterasa,
que son las dos dianas con las que hemos trabajado en este proyecto.
1.4.1 Enzima β-secretasa
La β-secretasa, también llamada BACE-1, menmapsin-2 o ASP-2, es un tipo de
proteína de transmembrana.6
Esta enzima, que a partir de ahora denominaremos BACE-
1, pertenece a la familia de las aspartil proteasas e hidroliza a la proteína precursora
amiloide (PPA) generando los péptidos beta amiloides (Aβ), cuya agregación como
oligómeros en la región de sinapsis es una causa de la EA (ver apartado 1.2.1) por lo
13. 6
que se ha convertido en un objetivo terapéutico prioritario para el tratamiento de la
EA.5,6
Aunque actualmente existen múltiples estructuras experimentales de BACE-1, la
primera estructura que fue depositada en el Protein Data Bank (PDB) corresponde a la
de su complejo con un inhibidor peptídico.10
Los estudios de rayos-X indican que el
sitio activo de esta proteína es como una hendidura alargada y abierta al disolvente
(Figura 3). La diada catalítica, formada por el Asp32 y el Asp228 está localizada en el
fondo de esta hendidura. La parte central del sitio activo está cubierta, como en otras
aspartil proteasas de mamíferos, por una estructura de horquilla beta, que comprende
desde el residuo 69 al 75 y que es conocida como flap.6
Esta estructura protege al sitio
activo del disolvente facilitando una catálisis más eficiente. Se trata de la parte más
flexible del sitio activo, de forma que, asume distintos estados conformacionales a
temperatura ambiente. El residuo clave es la Tyr71, que adopta una conformación
complementaria a la forma y naturaleza del ligando que se esté uniendo al sitio activo.
El cambio de posición del flap proporciona al sustrato y los ligandos un medio para
entrar y salir del sitio activo.11
Figura 3. Estructura de BACE-1 donde se observa el flap y la diada catalítica (Asp32 y Asp228),
marcada con un círcuclo.
14. 7
Se ha investigado mucho sobre posibles inhibidores de esta enzima que puedan
llegar a ser un tratamiento para la enfermedad de Alzheimer. En el pasado, se estudiaron
estructuras peptídicas que pudieran inhibir la ruptura de la PPA a los péptidos Aβ, como
por ejemplo el OM99-2 (Figura 4), cuyo complejo con BACE-1 (1FKN en PDB) fue la
primera estructura obtenida experimentalmente con rayos X.10
Estos inhibidores no
fueron viables debido a su elevado peso molecular y al gran número de grupos polares
que contenían, pues esto dificulta su paso a través de la barrera hematoencefálica.
Los inhibidores peptídicos, como OM99-2, se unen a BACE-1 con el flap
cerrado, de forma similar a lo que sucede con el sustrato para que se lleve a cabo el
proceso catalítico.
Figura 4. Estructura del inhibidor peptídico OM99-2.
Posteriormente, se empezaron a buscar compuestos no peptídicos que tuvieran
menor peso molecular para permitir el paso a través de esa barrera. Estos inhibidores no
peptídicos en muchos casos se unen a BACE-1 con el flap abierto.
1.4.2 Enzima acetilcolinestarasa
La acetilcolinesterasa, también llamada AChE, es una enzima de 543 residuos.
Pertenece a la familia de las hidrolasas de serina y es la encargada de hidrolizar la
acetilcolina (ACh), y terminar así la transmisión sináptica.
La determinación de la primera estructura cristalográfica de AChE fue la de
especie Torpedo californica en 1993 y permitió la identificación de su sitio activo, que
se encontraba localizado al fondo de una “profunda garganta”, un canal de
aproximadamente 15 Å, formada por lo menos por 14 residuos aromáticos. La
estructura de AChE para el ser humano es muy parecida a la de Torpedo califórnica,
15. 8
por lo que esta estructura ha servido para las investigaciones en seres humanos, y será
esta estructura la que utilizaremos en este trabajo.12,13
El sitio activo de AChE contiene dos subsitios, el esteárico, donde se lleva a cabo
la mayor parte de la actividad catalítica y la hidrólisis de ACh, y el aniónico catalítico
(CAS, Catalytic Anionic Subsite), compuesto, entre otros, por los residuos Trp84 y Phe
330, donde se une la colina que forma parte de ACh.12
Además de estos dos subsitios del centro catalítico de AChE, se ha observado otro
sitio de unión aniónico localizado a la entrada de la “garganta”. Se trata del sitio
aniónico periférico (PAS, Peripherical Anionic Subsite) que presenta los residuos
aromáticos Tyr70 y Trp279 entre otros (Figura 5).12
La gran densidad de grupos aromáticos en entorno del sitio activo se ha
aprovechado con éxito para el diseño de inhibidores de AChE. Tanto en CAS como en
PAS, podemos encontrar residuos aromáticos que se coloquen de forma paralela entre
sí, permitiendo el establecimiento de interacciones de apilamiento-π con los inhibidores
que posean grupos aromáticos. En el caso de CAS, estos grupos son Trp84 y Phe330,
mientras que en PAS son Tyr70 y Trp279.7,12,14
Figura 5. A) Imagen esquemática del sitio activo de AChE y acceso desde el sitio aniónico
periférico. B) Imagen del sitio activo con el ligando bistacrina.
A B
16. 9
El bloqueo de PAS o de CAS, conducirá a la imposibilidad de unión de ACh al
enzima, impidiendo por tanto su hidrólisis.12
Esta enzima, por lo tanto, juega un papel muy importante en la neurotrasmisión
colinérgica pero también se ve involucrada en otras labores. Se ha visto que está
involucrada en la formación de fibras Aβ de la hipótesis amiloide, explicada antes. Se
ha demostrado que AChE puede acelerar el ensamblaje de los péptidos Aβ como
fibrillas amiloides, que están asociadas con el depósito de placas en los pacientes de
EA, y que el sitio en donde se produce esta función es el sitio aniónico periférico
(PAS).15
Encontramos así una nueva ruta para el tratamiento de la EA, en la cual se reduce
la actividad promotora de la agregación que ejerce la región periférica de AChE.
La conexión mediante el canal de la región aniónica periférica y la aniónica
catalítica del sitio activo de esta enzima, permite una nueva aproximación a la
inhibición de esta enzima, por ligandos formados por dos fragmentos que sean capaces
de unirse al CAS y al PAS, y que estén separados por un espaciador de la longitud
adecuada para permitir un enlace dual. Ya se han diseñado fármacos de este tipo, como
por ejemplo la bis-tacrina y algunos de sus derivados, que se unen a AChE como el que
se muestra en la Figura 6.7
Figura 6. Representación de un inhibidor derivado de la bis-tacrina
1.5 Inhibidores multidiana
Los inhibidores multidiana (“multi-target”) son aquellos que son capaces de
atacar a varios objetivos simultáneamente. Es decir, un fármaco capaz de interaccionar
de manera efectiva con varias de las posibles dianas farmacológicas de la enfermedad.
17. 10
El diseño de un fármaco de este tipo podría ser especialmente indicado para el caso de
la EA, un síndrome multifactorial complejo, y además permitiría evitar la toxicidad
producida por la ingestión de múltiples fármacos simultáneos.7
El desarrollo de un fármaco multidiana presenta grandes desafíos, pues debe
interaccionar de la manera adecuada con todas las dianas elegidas, y por otra parte, es
necesario evitar que resulte en interferencias no deseadas con objetivos no
terapéuticos.7
19. 12
A lo largo de la introducción del trabajo, hemos visto que existen múltiples dianas
farmacológicas para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
En la hipótesis amiloide están involucradas varias enzimas, entre ellas, BACE-1 y
AChE. Se pueden buscar inhibidores de la BACE-1 que a su vez lo sean también de
AChE, de forma que atacaríamos simultáneamente dos dianas, y además, estaríamos
también actuando paliativamente contra los efectos nocivos para las funciones
cognitivas que produce AChE.
El objetivo final del presente trabajo es el diseño de fármacos multidiana para la
EA.
Para llevar a cabo este objetivo utilizaremos como punto de partida inhibidores
conocidos de BACE-1 sobre los que se llevarán a cabo diferentes modificaciones
estructurales con objeto de que puedan actuar como inhibidores duales de CAS y PAS
en AChE sin perder su afinicad por BACE-1.
21. 14
3.1 Descripción del Software
3.1.1 Gold Suite 5.2.16,17
GOLD (Genetic Optimisation for Ligand Docking) es un algoritmo genético
para el acoplamiento de ligandos flexibles en los sitios de unión de las proteínas.
Ofrece una selección de funciones de clasificación (scoring), GoldScore, ChemScore
ChemPLP.
- GoldScore (Gold): Produce una clasificación empírica de las poses exactas
que puede tener el ligando teniendo en cuenta la energía de los enlaces de
hidrógeno proteína-ligando, las energías de las interacciones Van der Waals
(externas e internas) proteína-ligando y la energía de deformación torsional
del ligando.
- ChemScore: produce una clasificación empírica relacionada básicamente con
las afinidades de unión ligando-proteína.
- ChemPLP: Produce una clasificación empírica eficiente
computacionalmente de las poses exactas, teniendo en cuenta, entre otras
cosas, la complementariedad estérica proteína-ligando.
3.1.2 Discovery Studio.18
Discovery Studio es una conocida suite de programas para la simulación de
sistemas pequeños de moléculas y macromoléculas. Cubre la química computacional, la
biología computacional, quimioinformática, simulaciones moleculares y la mecánica
cuántica.
- Ludi es un módulo de Discovery Studio de diseño de novo que identifica
nuevos ligandos, mediante el cribado de una biblioteca de moléculas
pequeñas, para encontrar los que son complementarios al sitio activo de un
receptor diana.
3.1.3 Swiss PDB Viewer. 19
Swiss-PDB Viewer es una aplicación que proporciona una interfaz gráfica que
permite analizar varias proteínas al mismo tiempo. Las proteínas se pueden superponer
22. 15
con el fin de deducir las alineaciones estructurales y comparar sus sitios activos o
cualquier otra parte pertinente.
3.1.4 ChemBioOffice.20
ChemBioOffice es una suite científicamente inteligente e integrada de
herramientas de productividad personal que permite a los científicos e investigadores
capturar, almacenar, recuperar y compartir datos e información sobre los compuestos,
reacciones, materiales y sus propiedades.
- ChemBioDraw es utilizado para dibujar con rapidez y eficacia las moléculas,
reacciones y entidades biológicas para su uso en documentos y cuadernos de
laboratorio electrónicos; también se usa para buscar bases de datos, para
generar nombres exactos de las estructuras y predecir las propiedades y
espectros.
- ChemBio3D genera modelos 3D de manera que se pueden ver los
compuestos en tres dimensiones para evaluar la forma y las propiedades,
además de para maximizar la actividad o especificidad.
3.2 Selección de candidatos
Los candidatos para la inhibición de las dos dianas escogidas deben de cumplir
las premisas para acoplarse al sitio activo de BACE-1 y AChE, es decir, deben de ser
moléculas que interaccione con la diada aspártica de BACE-1, y que, a su vez, sean
capaces de colocarse a lo largo de la garganta del sitio activo de AChE, formándose un
apilamiento π en el sitio aniónico catalítico (CAS) y en el sitio aniónico periférico
(PAS).12,21
En nuestro grupo de investigación se llevó a cabo la búsqueda de estos candidatos
entre moléculas estudiadas con anterioridad para la inhibición de BACE-1. Se encontró
el 3MSL, cuya estructura cristalográfica del complejo con el enzima está almacenada en
el PDB.22
Este candidato posee en uno de los extremos un grupo 2-
aminobenzoimidazol, que contiene dos nitrógenos que interaccionan con la diada
catalítica (Figura 7), y por otra banda, este grupo es también aromático por lo que puede
ser capaz de hacer contactos de apilamiento π entre las cadenas laterales aromáticas de
23. 16
AChE. Concretamente, se observó que este grupo 2-aminobenzoimidazol
interaccionaba también con el CAS o PAS de AChE. Sin embargo, esta molécula no es
capaz de interactuar simultáneamente con CAS y PAS, ya que que no tiene la logitud
necesaria. Además, no contiene un grupo aromático en su otro extremo que pueda hacer
un apilamiento π.
Figura 7. Interacciones entre el 3MSL y la diada aspártica catalítica.
Se pensó que unas moléculas que mantuvieran ese grupo 2-aminobenzoimidazol
pero de mayor longitud y con otro extremo aromático, podrían adecuarse para ser
inhibidores multidiana en BACE-1 y AChE.
Para poder diseñar estas moléculas, el grupo de investigación procedió al cribado
computacional del sitio activo de BACE-1, con una base de datos de pequeños
fragmentos orgánicos usando Ludi, una herramienta de Discovery Studio, que sugirió
varios fragmentos para modificar el ligando 3MSL dejando invariable el segmento que
contiene el grupo derivado 2-aminobenzoimidazol e introduciendo anillos aromáticos en
el otro externo.
Se llegó así a los compuestos que se listan en la Tabla 1. Se trata de ligandos
derivados del 3MSL con grupos aromáticos en sus dos extremos y de mayor longitud,
de forma que puedan ser capaces no solo de interaccionar con BACE-1, sino también de
situarse a lo largo de la garganta que contiene el sitio activo de AChE.
24. 17
Tabla 1. Estructuras del compuesto inicial 3MSL y los candidatos seleccionados.
3MSL LDms01
LDms02 LDms03
LDms04 LDms05
LDms06 LDms07
LDms08 LDms09
Las estructuras de estos ligandos fueron generadas utilizando ChemBioDraw y
después se optimizaron con ChemBio3D.
25. 18
3.3 Simulación de acoplamiento proteína ligando.
Docking
Para llevar a cabo la investigación y conocer cuál es el ligando que produce una
interacción más eficaz con el enzima llevamos a cabo el docking (o acoplamiento), una
simulación computacional que proporciona, en base a los términos de la función de
scoring empleada, una serie de posiciones que el ligando puede tomar dentro del sitio
activo.
Los cálculos de acomplamiento han sido llevados a cabo con la suite de módulos
residentes el GOLD (Genetic Optimisation for Ligand Docking). Configuramos para
obtener 25 resultados de salida, con un número de interacciones del algoritmo genético
de un mínimo de 1.000.000 y un máximo de 1.250.000 interacciones. Para asegurarnos
de una mayor variabilidad en las poses finales, empleamos la opción de configuración
de soluciones diversas de GOLD, que impide que se formen grupos de posiciones muy
similares en los resultados. Para generar las poses de los complejos, se emplearon las
siguientes funciones residentes en GOLD (score): ChemScore, GoldScore y ChemPLP.
Una vez el hecho el docking, debemos crear los complejos proteína-ligando, para
lo que utilizamos de nuevo, la suite GOLD 5.2. Después se procedió al análisis de los
resultados en Discovery Studio.
Existen algunas diferencias a la hora de efectuar el docking en BACE-1 y AChE
que veremos en los siguientes apartados.
3.3.1 Acoplamiento en BACE-1.
3.3.1.1 Estudio del grado de apertura del flap
Como ya se ha mencionado antes en la introducción, cuando trabajamos con
BACE-1 hay que tener en cuenta de existencia del flap, una horquilla β formada por los
residuos 69 al 75. Este flap cubre el sitio activo de la proteína y puede tener múltiples
conformaciones dependiendo del ligando que se une a ella, debido a su flexibilidad.6
El complejo del ligando de partida con BACE-1 ha sido ya cristalizado y lo
encontramos en el PDB con el código 3MSL.22
El acoplamiento se llevará a cabo con la
26. 19
proteína procedente de este complejo, de todas maneras analizaremos cual es el grado
de apertura de flap en este caso.
Utilizaremos tres estructuras modelo para las distintas aperturas del flap,11
con las
cuales podemos comparar la apertura existente en el complejo del 3MSL. La primera
estructura, con código en el PDB 1FKN,10
es un complejo enzima ligando peptídico que
presenta un flap cerrado; la segunda estructura con código PDB 3MKY,23
es una
estructura con un ligando no peptídico y tiene un flap medio abierto; por último, con el
código de PDB 1W50,24
la proteína sin ligando, con un flap abierto.
Para realizar la comparación entre la apertura de la horquilla en los distintos
complejos, utilizamos el programa Swiss PDB Viewer. Con el pudimos medir la
distancia entre el carbono alfa de los residuos homólogos del flap en los distintos
complejos, tomando como referencia el del cerrado (1FKN en PDB).
3.3.1.2 Estudio de los estados de protonación.
Según estudios previos, los ligandos cargados muestran un mayor grado de éxito
en comparación con los ligandos neutros, para todas las funciones de reevaluación y
valores de pH empleado.25
Por ello, para llevar a cabo el acoplamiento, primero
protonamos todos los ligandos en uno de los nitrógenos del 2-aminobenzoimidazol, (el
nitrógeno marcado en rojo en la Tabla 1, al que nos referiremos por N1). Para protonar
las estructuras utilizamos Discovery Studio.
Para nuestros cálculos utilizaremos el enzima a dos valores distintos de pH (4.5 y
7.4). Esto es debido a que la proteína está anclada a la superficie de la membrana, donde
el pH es neutro y donde se une al sustrato, mientras que para ejercer su actividad
enzimática debe internalizarse en las vesículas endosomales, donde el pH óptimo para la
actividad catalítica es ácido (de 4.5 a 5.5).7
En el caso de los inhibidores se ha
demostrado que los que son activos a nivel celular son los que presentan afinidad a pH
ácido y neutro, posiblemente debido a que solamente los inhibidores que se unen a la
proteína a pH neutro, luego serán cotransportados a los compartimentos de actividad
catalítica.7
La diferencia en la proteína recae, básicamente, en la carga de la diada
aspártica. En el caso de pH ácido el Asp32 se encuentra monoprotonado, y por lo tanto,
la diada está monocargada, mientras que a pH neutro está dicargada.25
La protonación
de este residuo se realiza en la proteína utilizando el Discovery Studio.
27. 20
3.3.1.3 Acoplamiento ligando-proteína.
Antes de proceder a los estudios de acoplamiento ligando proteína, procedemos a
limpiar la estructura de la proteína de conformaciones alternativas, añadimos los átomos
de hidrógeno y retiramos las moléculas de agua con el mismo programa.
Definimos el sitio de unión como todos los átomos de la proteína accesibles por el
disolvente en un radio de 6Å alrededor del inhibidor peptídico OM99-2, superpuesto en
la estructura de la proteína del complejo 3MSL.
Para cada combinación de inhibidor y función de evaluación, calculamos un total
de 25 poses con distinta conformación de los ligandos y con distinta orientación en el
sitio activo del enzima.
Definimos como un “hit” de acoplamiento para BACE-1 una pose de salida en la
que hay un contacto doble entre la diada catalítica y el grupo amino primario y con el
terciario (protonado) de la unidad 2-aminobenzoimidazol. Exactamente, se busca una
conformación en la que uno de los carboxilos de la diada aspártica establece un enlace
de hidrógeno con el N terciario del 2-aminobenzoimidazol, previamente protonado, y al
que nos referiremos como N1, y el otro, al menos, un enlace de hidrógeno con el grupo
amino NH2. Puede haber dos posibilidades de hit, a las que denominaremos normal e
inversa. Hablaremos de hit normal cuando el Asp32 interacciona con el N1 y el Asp228
con el NH2. Hablamos de hit inverso en el caso contrario. Se puede ver un ejemplo de
los dos tipos de hit en la Figura 8.
Buscamos los hits entre las 5 primeras poses de resultado más alto de evaluación
para los compuestos.
Figura 8. Definición de Hit normal e inverso para la interacción de la diada aspártica con el 2-
aminobenzoimidazol.
28. 21
3.3.2 Acoplamiento en AChE
Para las simulaciones de docking en la Acetilcolinesterasa, tomamos como
estructura de partida el complejo de la proteína de Torpedo californica (TcAChE) con
un ligando derivado de la tacrina, disponible en PDB con el código 1ODC.21
Con el Discovery Studio se limpian las estructuras de la proteína de
conformaciones alternativas, retiramos las moléculas de agua y se añaden los átomos de
hidrógeno. Definimos el sitio de unión del ligando como la región de AChE que
contiene los residuos accesibles al agua que se encuentran a 6 Å alrededor del ligando
derivado de la bis‐tacrina presente en la estructura 1ODC.
Volvemos a utilizar las tres funciones de evaluación para generar las poses.
Tomamos las cinco mejores poses de cada una para determinar el hit.
En el caso de la Acetilcolinesterasa, definimos el hit como aquellas poses en las
que se produce un apilamiento π de tipo “cara a cara” de los grupos aromáticos del
ligando con las cadenas laterales de los residuos Trp84 y Phe330 del sitio catalítico
(CAS) y los residuos Tyr70 y Trp279 en el periférico (PAS) , dándose el apilamiento a
una distancia menos de 4.5 A, tal como sucede en el complejo 1ODC (Figura 9), donde
la disposición paralela entre las dos unidades aromáticas de los residuos en cada sitio
dan lugar a una disposición especial con el ligando, formando una especie de sándwich
con la unidad aromática del ligando.
Figura 9. Representación de la unión de un derivado de la bis-tacrina con el PAS y CAS de AChE.
Depositado como 1ODC en el PDB.
30. 23
5.1 Estudios de acoplamiento en BACE-1.
Hemos realizado distintos estudios para BACE-1. En primer lugar se comparó la
abertura del flap para la estructura cristalizada de la proteína con el ligando 3MSL con
respecto a otros complejos de referencia. En segundo lugar se llevó a cabo un
selfdocking con el enzima al pH de cristalización y al de actividad enzimática con
objeto de comprobar si nuestro protocolo de docking reproduce la pose experimental del
ligando en el complejo 3MSL. Finalmente hemos aplicado el protocolo de docking a
todos los ligandos derivados del 3MSL.
5.1.1 Estudio de la apertura de flap para el complejo 3MSL.
Como ha sido explicado en los capítulos anteriores, BACE-1 tiene una horquilla β
muy flexible, que cambia su conformación dependiendo del ligando que se haya unido a
su sitio activo.
Hemos llevado a cabo un estudio para comparar las tres aperturas del flap
(abierto, cerrado y medio abierto), con la apertura de la horquilla en el complejo de
BACE-1 3MSL.
Tabla 2. Distancias en Å entre los residuos de los distintos flap con respecto al cerrado (1FKN).
3MSL 3KMY 1W50
VAL67 0,61 0,41 0,94
TYR68 1,61 0,98 1,8
VAL69 1,94 1,21 2,2
PRO70 2,98 2,27 3,21
TYR71 4,08 3,19 4,83
THR72 4,79 3,29 6,05
GLN73 5,31 2,19 6,33
GLY74 3,44 1,31 3,58
LYS75 1,45 0,51 1,1
TRP76 0,4 0,2 0,5
GLU77 0,32 0,31 0,31
31. 24
Como se pudo ver en el apartado de metodología, se tomó como referencia el flap
cerrado, usando para ello el complejo 1FKN del Protein Data Bank (PDB) y se midieron
las distancias entre los carbonos alfa de los residuos homólogos de los complejos
3KMY (flap medio abierto), 1W50 (flap abierto) y de nuestro complejo 3MSL. En la
Tabla 2 se listan los resultados obtenidos para estas distancias.
En la Figura 10 podemos ver una imagen con las distintas estructuras de flap
tomadas como referencia y la del complejo 3MSL. En la gráfica se representan las
distancias, listadas en la tabla 2. Se observa que la apertura del flap de la proteína con
la que vamos a trabajar es muy cercana a la del 1W50 (abierto) aunque el grado de
apertura es un poco menor.
Figura 10. Comparación entre las distintas aberturas flap.
0
1
2
3
4
5
6
7
Distancia(Å)
3MSL
3KMY
1W50
1FKN
32. 25
5.1.2 Selfdocking del ligando 3MSL
Para comprobar que los estudios de docking y las distintas funciones de scoring
reproducen la pose del complejo cristalizado, hemos llevado a cabo un selfdocking de la
proteína con el ligando 3MSL.
Hemos superpuesto la primera pose obtenida en el ranking para cada función de
scoring y pH con el complejo cristalizado obtenido experimentalmente. Se ha observado
que tanto a pH 7.4 como a pH 4.5, las poses del ligando reproducen la del complejo
experimental, siendo la de pH 7.4 la que más se acerca a la experimental.
En la Figura 11 podemos ver, para GoldScore, la superposición del ligando a pH
7.4 y 4.5 con el experimental.
Figura 11. Superposición del ligando 3MSL de la estructura experimental (morado) con el
ligando 3MSL a pH4.5 (amarillo) y el ligando 3MSL a pH 7.4 (gris) utilizando GoldScore.
5.1.3 Acoplamiento a pH de cristalización (7.4).
En la Tabla 3 se listan los resultados del acoplamiento a BACE-1 del compuesto
3MSL y sus derivados. Los resultados se resumen de manera gráfica en la Figura 12.
Hemos buscado los hit’s entre los 5 primeros resultados mejor clasificados para cada
función de evaluación.
34. 27
LDms8
36.44
(1/3)
77.24
(1/5)
79.26
(1/3)
73.3%
LDms9 -
86.09
(1/5)
91.20
(1/5)
66.7%
a
Se indican los valores de salida de las distintas funciones de evaluación para aquellas estructuras
que cumplen los requisitos de hit. Los números entre paréntesis indican la posición en el ranking de
la pose para la que se obtuvo el hit más alto y el número total de poses que resultan en hit entre las
5 primeras
Se observa, que con el ligando 3MSL las probabilidades de obtener el hit son muy
altas, un 93.3 % de las poses dan lugar a hit, encontrándose los peores resultados para la
función de evaluación ChemScore.
Figura 12. Resultados de hit totales en BACE-1 a pH 7.4
En los ligando derivados del 3MSL, encontramos los mejores resultados para LDms2
(ejemplo Figura 13) y LDms7, con un 86.7% de probabilidades de hit, seguidos muy de
cerca por LDms8, con un 73.3% de probabilidades.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
LDms1 LDms2 LDms3 LDms4 LDms5 LDms6 LDms7 LDms8 LDms9 3MSL
NºdeHits
Ligandos
Hit
Hit Inverso
35. 28
En los compuestos LDms3, LDms4, LDms5 y LDms6 se puede observar que la
sustitución en meta del anillo aromático por un grupo etilo o vinilo produce un descenso
del número de hits, debido que tiene mayor impedimento estérico para conseguir las
poses adecuadas, produciéndose un cambio conformacional. (Figura 14)
Podemos observar que, en el caso de pH de cristalización no se ha dado ninguna
pose con un hit inverso (el NH2 interaccionando con Asp32 y el N protonado con Asp
228). Además, superponiendo todas las estructuras de los ligandos en sus mejores poses,
hemos observado que el 2-aminobenzoimidazol se sitúa en todos los casos de la misma
forma.
Figura 14. Superposición de las mejores poses de LDms3 y LDms7 (amarillo) a pH 7.4 en
GoldScore.
Figura 13. Representación mejor pose LDms2 en Gold a pH 7.4
36. 29
5.1.4 Acoplamiento a pH de actividad enzimática (4.5).
En la Tabla 4 se listan los resultados del acoplamiento a BACE-1 con la diada
aspártica monoprotonada en el Asp32 del compuesto 3MSL y sus derivados. Los
resultados se resumen de manera gráfica en la Figura 15. Como en el caso anterior (pH
7.4) buscamos los hit’s entre los 5 primeros resultados mejor clasificados para cada
función de evaluación.
Tabla 4. Resultados de acoplamiento en BACE-1 de 3MSL y derivados a pH 4.5a
Candidatos Estructura Chem Gold PLP %
3MSL
29.81
(1/5)
58.60
(1/5)
57.74
(5/1)
66.6%
LDms1 -
73.06
(1/4)
- 26.7%
LDms2 -
72.72
(2/2)
70.55
(4/1)
20%
LDms3
34.25
(1/2)
71.68
(1/4)
76.87
(1/1)
46.7%
LDms4
34.80
(3/1)
73.73
(1/4)
75.02
(5/1)
40%
LDms5 -
72.04
(1/3)
72.21
(4/1)
26.7%
37. 30
LDms6
35.97
(1/2)
73.63
(1/5)
75.9
(1/3)
66.7%
LDms7
34.31
(1/1)
67.05
(1/4)
72.51
(3/1)
40%
LDms8
35.85
(1/1)
70.82
(2/4)
73.07
(5/1)
40%
LDms9 -
75.19
(3/1)
- 20%
a
Se indican los valores de salida de las distintas funciones de evaluación para aquellas
estructuras que cumplen los requisitos de hit. Los números entre paréntesis indican la posición en el
ranking de la pose para la que se obtuvo el hit más alto y el número total de poses que resultan en
hit entre las 5 primeras.
La probabilidad de hit disminuye con el cambio de pH. Esto es debido a que la
estructura cristalográfica con la que estamos trabajando fue obtenida a pH neutro, y no
ácido, lo que explica estas diferencias.
Figura 15. Resultados de hit totales en BACE-1 a pH 4.5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
NºdeHits
Ligandos
Hit
Hit Inverso
38. 31
Además, observamos que a este pH si encontramos algunas poses que se colocan
en una disposición de hit inverso, aunque es un porcentaje muy bajo. Es lógico que
exista algún hit de este tipo, porque las interacciones electrostáticas en este caso
favorecen la interacción con el Asp228, que es el que está cargado.
5.2 Acoplamiento en AChE
La Tabla 5 lista los hits de las simulaciones de acoplamiento con AChE para el
3MSL y sus derivados. En la Figura 16 vemos los resultados globales de hit
representados gráficamente.
Tabla 5. Resultados de acoplamiento en AChE de 3MSL y derivadosa
.
Candidatos Estructura Chem Gold PLP %
3MSL - - - 0%
LDms1
56.79
(1/5)
88.98
(1/2)
115.11
(1/5)
80%
LDms2
45.81
(4/2)
76.88
(5/1)
112.68
(1/4)
46.7%
LDms3
49.15
(1/4)
88.45
(1/4)
118.21
(1/5)
86.7%
LDms4
53.56
(1/4)
91.21
(1/2)
115.92
(1/5)
73.3%
LDms5
52.59
(2/2)
96.11
(1/5)
115.57
(1/4)
73.3%
40. 33
Como era de esperar, el 3MSL no produce ninguna pose de hit, pues no tiene
grupos aromáticos en sus dos extremos y por lo tanto, solo es capaz de hacer
apilamiento π en CAS o en PAS. (Figura 17).
Figura 17. Representación de las interacciones entre la primera pose del 3MSL en GoldScore y el
sitio activo de AChE.
Encontramos los mejores resultados en el ligando LDms3 (Figura 18), con un
86.7% de posibilidades de hit. También se obtienen muy buenos resultados para LDms1
(80%), LDms4, LDms5, LDms7 y LDms8 con un 73.3%.
Figura 18. Primera pose del ranking de GoldScore para LDms3 con AChE.
CAS
PAS
41. 34
En general los porcentajes de hit son altos, excepto para el LDms2 (Figura 19),
que es de cadena más corta que los demás, de forma que no siempre llega a alcanzar los
dos sitios de la garganta.
Figura 19. Primera pose del ranking de GoldScore para LDms2.
En la gráfica de la Figura 20 se hace una diferenciación entre el hit normal y el hit
inverso en AChE. Generalmente, en el ligando 3MSL (el ligando de referencia) el grupo
2-aminobenzoimidazol se encuentra en el CAS, por lo tanto, hemos llamado hit normal
a la disposición en la que el grupo 2-aminobenzoimidazol se encuentra en CAS y el otro
grupo aromático en PAS. En algunas ocasiones, esta estructura se invierte, de forma que
el grupo 2-aminobenzoimidazol se encuentra situado en el PAS.
Ésto es debido a los distintos sustituyentes de los ligandos. Los ligandos que
tienen un grupo vinilo en meta se colocan mayormente de forma inversa, esto es debido
a que forman un enlace del tipo π-vinilo con la His440, que está cerca del CAS.
Otro sustituyente que influye en la colocación del ligando es el NH2 del grupo
aromático del extremo derecho, que se sitúa en para y que forma enlaces de hidrógeno
con la Ser81, también situada cercana al CAS.
42. 35
Figura 20. Comparación entre hits normales e inversos para el acoplamiento con AChE.
En la Figura 21 podemos ver ejemplos de esta influencia. Es caso de LDms4,
contiene el grupo amino y un grupo vinilo.
Figura 21. Ejemplo de la influencia de los enlaces de los sustituyentes con residuos de la proteína
en LDms8.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
NºHits
Ligandos
Hit
Hit Inverso
43. 36
5.3 Inhibidores multidiana
Podemos concluir diciendo que el ligando LDms7 es el que mejores resultados
da, si analizamos los resultados de BACE-1 a pH=7.4 y AChE en conjunto. Para ambos
casos encontramos altos porcentajes de probabilidad de hit.
Por otra parte, si añadimos los resultados de BACE-1 a pH 4.5, podríamos
argumentar que para el LDms6, pese a dar peores porcentajes en los otros estudios,
seguimos teniendo resultados positivos, con porcentajes superiores al 60%, y además,
en él no se ve una disminución en el número de hits a pH 4.5.
45. 38
1. Tomando como punto de partida una serie de análogos del inhibidor de BACE-1
presente en el complejo de código PDB 3MSL, se han llevado a cabo diferentes
estudios de docking a BACE-1 y AChE con objeto de ver la capacidad de estos
ligandos para unirse a ambas dianas y por lo tanto de actuar como inhibidores
multidiana para la EA.
2. Los estudios de docking en BACE-1 se hacen a pH 7.4 y 4.5, ya que los inhibidores,
para ser efectivos a nivel celular, deben de ser capaces de interaccionar con las
enzimas a ambos valores de pH. Los resultados indican mayor inhibición cuando se
trata de pH 7.4, lo que es debido a que la enzima ha sido cristalizada a pH neutro.
3. Los estudios de docking en AChE se hacen buscando inhibidores duales que sean
capaces de inhibir simultáneamente el CAS, responsable de la actividad catalítica de
la enzima, y el PAS que facilita la agregación de los péptidos amiloides. De esta
forma los candidatos serían capaces de inhibir el efecto colinérgico y también la
agregación de los péptidos amiloides.
4. El análisis de los resultados de docking de los ligandos con las dianas definidas
concluyen en un elevado grado de éxito para todos los inhibidores, pero podemos
identificar el LDms6 como el mejor inhibidor multidiana, pues muestra un
porcentaje de hit alto en todos los estudios llevados a cabo.
46. 39
CONCLUSIONS
1. We have carried out the docking simulations to BACE-1 and to AchE or a group of
analogues of a known BACE-1 inhibitor, in order to asses the binding capabilities
of these ligands for both amyloid targets, a result that could guide us to multi-target
inhibitors leads for Alzheimer’s disease.
2. Docking studies in BACE-1 were performed at pH 7.4 and 4.5, since the inhibitors
that are active at cellular level , should bind the enzyme at both neutral and acid pH.
There is a large number of analogues that bind BACE-1, fulfilling theBACE-1
interaction requirements, although the number of hits is greater at neutral pH. This
latter result stands to reason, since we used as template for docking, the original
PDB structure, which was obtained at a neutral pH.
3. Docking studies in AchE look for dual inhibitors that are able to simultaneously
inhibit the catalytic anionic subsite (CAS), responsible of the catalytic activity of
the enzyme, and the peripherical anionic subsite (PAS), a result that indicates that
our candidates have both a collinergic effect and could preclude partially amyloid
aggregation. .
4. Most of the initial leads satisfy the multitarget requirements and hence could be
selected for synthesis and biological assays. The docking results indicate that
LDms6 seem to be the best multi-target lead since it displays a higher percentage
of hits in all docking calculations.
47. 40
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