A continuación, te proporciono información detallada sobre los tipos de ELISA, inmunoensayo y Western Blot, incluyendo los pasos a seguir, la técnica, el fundamento, los materiales, la historia y las aplicaciones. Espero que esta explicación te ayude a comprender mejor cómo se llevan a cabo estas técnicas y para qué se utilizan. Si tienes alguna duda, no dudes en preguntar, estaré encantado de ayudarte. El ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) es una técnica de ensayo inmunológico ampliamente utilizada para detectar y cuantificar la presencia de una sustancia específica, como un antígeno o un anticuerpo, en una muestra biológica. Existen diferentes tipos de ELISA, incluyendo el competitivo, directo, indirecto y sándwich. En el ELISA competitivo, el antígeno de interés compite con un antígeno marcado previamente conocido por su unión a un anticuerpo. La cantidad de antígeno presente en la muestra se determina midiendo la cantidad de antígeno marcado que se une al anticuerpo. En el ELISA directo, el antígeno de interés se une directamente a una superficie sólida (como un pozo de una placa de microtitulación) y se detecta utilizando un anticuerpo marcado que se une específicamente al antígeno. En el ELISA indirecto, se utilizan dos anticuerpos: uno primario, que se une específicamente al antígeno, y otro secundario, marcado con una enzima, que se une al anticuerpo primario. La enzima proporciona una señal detectable para cuantificar la presencia del antígeno. En el ELISA sándwich, se utilizan dos anticuerpos: uno de captura, que se une al antígeno, y otro de detección, que se une a otra región del antígeno. El antígeno se "sándwicha" entre los dos anticuerpos, lo que permite una alta sensibilidad en la detección. El inmunoensayo es una técnica general que utiliza anticuerpos para detectar y cuantificar antígenos o anticuerpos específicos. El ELISA es un ejemplo de inmunoensayo, pero también existen otras técnicas, como el radioinmunoensayo (RIA), que utiliza isotopos radiactivos, y los inmunoensayos enzimáticos basados en enzimas para la detección. El Western Blot, también conocido como inmunotransferencia, es una técnica utilizada para detectar proteínas específicas en una muestra. Consiste en separar las proteínas de la muestra mediante electroforesis en gel, transferirlas a una membrana y luego incubar la membrana con anticuerpos específicos para las proteínas de interés. Los anticuerpos marcados permiten la detección de las proteínas mediante reacciones enzimáticas o quimioluminiscencia. Twitter.com/@bryanpriegop

1. Radioinmunoensayo,
ELISA y Western Blot
M.D Bryan Adrian Priego Parra
Biología Celular
Dra. Rossana Citlali Zepeda Hernández
Centro de Investigaciones Biomédicas
Universidad Veracruzana

2. • Antígeno: molécula externa que produce una respuesta inmune
• Anticuerpo: Proteína elaborada en respuesta a un antígeno

3. Inmunoensayos
• Métodos bioanalíticos para el análisis cuantitativo/cualitativo
• Basados en la reacción específica antígeno -anticuerpo

4. Radioinmunoensayo (RIA)
• 1960: Solomon Berson y Rosalyn Yalow  Concentración de insulina
plasmática
YALOW RS, BERSON SA. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. J Clin Invest. 1960;39(7):1157-1175. doi:10.1172/JCI104130

5. Fundamento:
Radioinmunoensayo
• Competencia de unión entre la sustancia desconocida a cuantificar y cantidades
conocidas de la misma sustancia marcada con un radioisótopo (131I, 14C)
• Formar complejos Ag-Ac o Ag*Ac
Directo: Cuantifica radiación emitida por el antígeno que no reacciona.
Indirecto: Radiación emitida desde el anticuerpo que reacciona.

6. RIA: Pasos generales
Nota al léctor: Si tengo una muestra que no conozco, en
caso de que esta contenga antígenos, van a competir
contras los radioisótopos marcados para unirse contra los
anticuerpos. (A mayor cantidad de antígeno que tenga la
muestra, menos cantidad antígeno marcado va a tener,
por lo tanto, menor radioactividad (gráfica)

7. Radioinmunoensayo
• Ventajas:
• Puede detectar pequeñas cantidades (picogramos) de ag o ac en el suero.
• Muy alta sensibilidad
• Limitaciones:
• Radioactivo
• Equipo especial para manipular muestra
• ¿Desechos radioactivos?
• Vida media de radioisótopos es corta

8. USOS

9. ELISA: Ensayo de
inmunoadsorción
ligado a enzimas

10. • ElISA: Descrito en 1971 en Suecia por Eva Engvall y Peter Perlmann

11. ELISA fundamento
• Uso de Ag o Ac marcados con una
enzima e insolubilizado sobre un
pocillo inmunoadsorbente
• Detecta reacción Ag-Ac al añadir un
substrato que produce que la
enzima produzca un color
• Se cuantifica la longitud de la onda
mediante un espectrofotómetro

12. Tipos de enzimas y sustratos
Enzima Sustrato
Peróxidasa de rabano Peróxido de hidrógeno
B-Galactosidasa O-nitrofenil-Beta-D-Galactopiranósido
Fosfatasa alcalina P-nitrofenilfosfato

13. Materiales ELISA
• Placas de micropocillos (8x12=96)
• Recipientes para los reactivos
• Pipetas de distintos volúmenes
• Puntas de pipeta
• Muestra
• Antígenos
• Anticuerpos
• Enzimas
• Lector de microplacas (400 nm-700 nm)
• Buffer de lavado
• Solución Stop
• Espectrofotómetro

14. Pasos generales: ELISA
Revestimiento: Antígeno se
adsorbe en el pocillo de la
placa ELISA con el buffer de
recubrimiento
Remover el buffer y lavar
Bloqueo: Tampón con proteína
no relacionada bloquea los sitios
libres en los pocillos
Remover el buffer y lavar
Detección : Ac de detección
conjugado con una enzima se
una al Ag
Remover el buffer y lavar
Lectura: El sustrato es
catalizado por una enzima
cromógena = lectura en color

15. Tipos de ELISA

16. Elisa directo
Antígeno
inmovilizado en el
pocillo
Ag detectado por
un Ac
directamente
conjugado a una
enzima
Cambio de
coloración

17. Elisa directo
• Ventajas:
• Rápido.
• Al tener menos pasos hay menor probabilidad de error.
• Elimina la reactividad cruzada entre anticuerpos
• Desventajas:
• Inmovilización del antígeno no específica
• La señal se amplifica menos
• Menor sensibilidad que otros tipos de ELISA
• Usos: Detección de antígenos.

18. ELISA INDIRECTO
Antígeno adsorbido
en el pocillo
Detección: 2 pasos
1.- El anticuerpo
primario no
marcado se une al
antígeno específico
2.-Un anticuerpo
secundario
conjugado con
enzimas se dirige
contra el
anticuerpo primario
Cambio de
coloración al añadir
substrato

19. Elisa indirecto
• Ventajas:
• Alta sensibilidad: más de un ac
secundario puede unirse al Ac primario
• Flexible: Diferentes ac primarios pueden
usarse con un solo Ac secundario
• Desventajas:
• Puede haber reactividad cruzada con el
Ac secundario
• Fases de incubación adicionales = más
tiempo
• Usos: Detección de anticuerpos

20. Elisa tipo Sándwich
• Requiere de pares de anticuerpos
para captura y detección.
• Cada anticuerpo es específico
para un epítopo diferente.
Placa cubierta
con un
anticuerpo de
captura
Se agrega el
analito o la
muestra
seguido de un
Ac de
detección
Sándwich directo:
Ac de detección
conjugado con
enzima
Sándwich Indirecto:
Ac de detección no
marcado y requiere
de un Ac
secundario
conjugado con una
enzima
Cambio de
coloración al añadir
substrato

21. Elisa
Sándwich
• Ventajas:
• Alta sensibilidad: 2-5 veces más sensible que Elisa directo/indirecto
• Alta especificidad: dos Ac están involucrados en la captura y detección
• Flexibilidad: Se puede usar detección directa o indirecta
• Desventajas:
• La optimización de los Ac puede ser difícil
• Puede ocurrir reactividad cruzada entre los anticuerpos de captura y detección
• Usos: Análisis de muestras complejas (pej: endotelina o
proteínas de supervivencia de neuronas motoras)

22. Elisa
competitivo
• Mide la concentración de un Ag o Ac mediante la
detección de interferencia en la señal de salida
esperada

23. Elisa competitivo
Revestimiento: El Ag
de control se
absorbe en el pocillo
en un tampón de
recubrimiento
Remover líquido y
lavar
Bloqueo: Tampón
con proteína no
relacionada bloquea
los sitios libres en
los pocillos
Preparar la mezcla de la
muestra anticuerpos de
detección
Muestra: Agregar la
mezcla de la
muestra en los
pocillos
Anticuerpo de
detección: Añadir
un Ac de detección
secundario
conjugado con una
enzima
Lectura: El sustrato
es catalizado por
una enzima que
genera color
Remover líquido y
lavar
Remover líquido y
lavar
• El Ag de la muestra y el ag
purificado compiten por la
unión del Ac
• A mayor concentración de
Ag, más débil será la señal de
salida

24. Elisa
competitivo
• Ventajas:
• No se requiere procesamiento de muestras
• Las muestras se pueden usar sin purificar
• Menos probable que se diluya la muestra
• Menor variabilidad entre muestras duplicadas
• Desventajas:
• Las de cada técnica Elisa debido a que cada una
puede adaptarse a competitivo
• Usos: Cuando solo hay un Ac disponible para el
antígeno pej: Oxitocina o Corticoesterona.

25. Aplicaciones de Elisa
• Parásitos
• Hormonas (HCG, progesterona,
testosterona)
• Cuantificación de
inmunoglobulinas (IgG, IgE, IgA)
• Enfermedades autoinmunes: AC
anti DNA, ANCA, Factor
reumatoide, inmunocomplejos,
etc

26. Western
Blot

27. Blotting = Transferencia
• Western Blot: Proteinas
• Southern Blot: DNA
• Northern Blot: RNA

28. Western blot
• Técnica usada para la detección de proteínas específicas en una
muestra
• Pej:
• Encefalopatía espongiforme
• Enfermedad de Lyme
• Gold standard: VIH

29. Western blot: Fundamento
• Se basa en el principio de
inmunocromatografía donde las
proteínas se separan en un gel de
poliacrilamida de acuerdo con su peso
molecular.
• Los antígenos transferidos a la
membrana son reconocidos por Ac
mono o policlonales específicos y
cuantificados.

30. Western blot: 1.- Preparación de la muestra
• Lisis por detergente  Cultivo celular
• Ultrasonificación  Suspensión celular
• Homogeneización mecánica  Tejidos animales o vegetales
• Digestión enzimática  Bacterias, levaduras y hongos.
• Proceso realizado a bajas temperaturas para evitar ruptura celular.

31. Western blot: Pasos generales
• 1.- Método apropiado de
extracción de proteínas
• 2.- Electroforesis en gel
• 3.- Transferencia de
proteínas
• 4.- Inmunodetección de
las proteínas por
anticuerpos
• 5.- Análisis de la
información

32. Detección de proteína:
• Quimioluminiscencia: Ac secundarios
conjugados con peroxidasa  Reacción
luminiscente que se captura en una
película o de forma digital con una
cámara CCD.
• Fluorescencia: Ac secundario unido a un
fluoróforo que cuando se excita emite
luz  Se mide la longitud de onda
• Colorimetría: Anticuerpo secundario
conjugado con una enzima cromógena.

33. Limitaciones: Western Blot
• Requiere de una correcta extracción y cuantificación de proteínas
• Más tiempo
• Más complejo, necesita ser realizado por personal capacitado
• Se necesita disponibilidad de los Ac primarios para las proteínas
• Los Ac pueden reaccionar con más de una proteína
• $$$
• La membrana puede no retener proteínas pequeñas
• Las proteínas grandes son difíciles de transferir a la membrana

34. Métodos de detección Western Blot
Método de detección Ventaja Desventaja
Radioactividad Alta sensibilidad Riesgos en bioseguridad
Colorimétrica Rapidez, sencillez y menor
costo
Baja sensibilidad
Quimioluminiscencia Alta sensibilidad Equipamiento especial
para lectura de resultados
Fluorescencia Más estable, permite
cuantificar la proteína en
la muestra, se pueden usar
Ac marcados con
fluoróforos con diferente
longitud de onda
Menor sensibilidad que QL
y se necesita
equipamiento
especializado

35. Conclusiones
• Inmunoensayos son métodos
bioanalíticos ampliamente utilizados
para diagnóstico de patologías,
monitoreo de niveles de drogas,
hormonas y farmacocinética clínica,
alergias, etc.
• No existe un método perfecto, es
necesario conocer usos y limitaciones
así como conocer los recursos
disponibles de cada centro.

36. Bibliografía
1.- Gorovits B, Baltrukonis DJ, Bhattacharya I, et al. Immunoassay methods used in
clinical studies for the detection of anti-drug antibodies to adalimumab and
infliximab. Clin Exp Immunol. 2018 Jun;192(3):348-365.
2.- Roggenbuck JJ, Zarske G, Schierack P, et al . Third generation radioimmunoassay
(RIA) for TSH receptor autoantibodies (TRAb) - one step less, similar results?
Nuklearmedizin. 2021 Feb;60(1):38-46.
3.- Kohl TO, Ascoli CA. Direct Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
(ELISA). Cold Spring Harb Protoc. 2017 Jul 5;2017(7):pdb.prot093740.
4.- Judith A. Owen, Jenni Punt, Sharon A. Stranford, Patricia p. Jones.– Kuby
Inmunología. Séptima edición.--México, D. F. : McGraw-Hill, 2014. 692 páginas
5.- Pillai-Kastoori L, Schutz-Geschwender AR, Harford JA. A systematic approach to
quantitative Western blot analysis. Anal Biochem. 2020 Mar 15;593:113608.

37. Gracias
Twitter:
Bryanpriegop
Espero te ayude 