1. Diagnostic biologique du paludisme
par
Marie-Ange Rason, MD
7ème édition du cours international “Atelier Paludisme”
25 Mars 2009 – Institut Pasteur de Madagascar

2. Paludisme:diagnostiqueravantdetraiter
Cycle biologique de Plasmodium sp

3. Paludisme:diagnostiqueravantdetraiter
Cycle biologique de Plasmodium sp

4. Paludisme:diagnostiqueravantdetraiter
• Diagnostic microscopique (frottis mince et goutte épaisse)
• Bandelette réactive
• Biologie moléculaire (en milieu de recherche principalement)
• Quantitative Buffy Coat malaria-test ou QBC test
Principaux moyens de diagnostic
biologique du paludisme

5. Paludisme:diagnostiqueravantdetraiter
Diagnostic Biologique du
Paludisme par Microscopie

6. Paludisme:diagnostiqueravantdetraiter
Diagnostic microscopique : technique de
référence
• frottis mince et goutte épaisse
• diagnostic d’urgence
• objectivant un parasite (forme asexuée / forme sexuée)
– identifier l’espèce plasmodiale
– évaluer la parasitémie

7. Paludisme:diagnostiqueravantdetraiter
Diagnostic Biologique du paludisme
Les étapes
1- Prélèvement du malade
2- Préparation et coloration des frottis sanguins
3- Examen microscopique des frottis sanguins à la recherche
des plasmodies
– négatif : confirmation
– Positif : suivre l’étapes suivantes
4- Identification d’espèces de Plasmodium
5- Estimation de la densité parasitaire

8. Paludisme:diagnostiqueravantdetraiter
Confection de la goutte épaisse
Piqûre au bout du doigt (avec une lancette stérile, à usage unique)
Confection d’une goutte épaisse

9. Paludisme:diagnostiqueravantdetraiter Confection de l’étalement sanguin :
frottis mince
Piqûre au bout du doigt (avec une lancette stérile, à usage unique)
Confection d’un frottis mince
OUI
NON
1
2
3

10. Paludisme:diagnostiqueravantdetraiter
Méthodes de coloration
 Coloration de May Grunwald-Giemsa
 Coloration de Giemsa
 Coloration rapide ou panoptique
(kit commercial type Kit Ral® ou Dade®)

11. Paludisme:diagnostiqueravantdetraiter
Plasmodium sp infectant l’homme
P. falciparum
P. malariae P. ovale
P. vivax

12. Paludisme:diagnostiqueravantdetraiter
Plasmodium knowlesi
(www.cdc.gov/eid) False-colour electron micrograph of a rhesus red blood
cell infected with a mature segmented schizont-stage P.
knowlesi malaria parasite, which is about to release its
invasive merozoite stages.
A thin blood smear stained with Giesma from a
fatal human case of P. knowlesi malaria

13. Paludisme:diagnostiqueravantdetraiter
Identification des espèces plasmodiales
sur un frottis mince
 Aspect de l’hématie parasitée
(taille de l’hématie parasitée)
 Aspect du parasite
(noyau et cytoplasme)
 Aspect du cytoplasme de l’hématie parasitée
(tâches, granulations)

14. Paludisme:diagnostiqueravantdetraiter
Identification des espèces plasmodiales
sur un frottis mince

15. Paludisme:diagnostiqueravantdetraiter
Examen de
frottis mince
Examen de
goutte épaisse
Plasmodium falciparum

16. Paludisme:diagnostiqueravantdetraiter
Plasmodium vivax
Examen de
frottis mince
Examen de
goutte épaisse

17. Paludisme:diagnostiqueravantdetraiter
Plasmodium ovale
Examen de
frottis mince
Examen de
goutte épaisse

18. Paludisme:diagnostiqueravantdetraiter
Plasmodium malariae
Examen de
frottis mince
Examen de
goutte épaisse

19. Paludisme:diagnostiqueravantdetraiter
Calcul de la densité parasitaire
Sur la goutte épaisse
 8000 globules blancs (leucocytes) par µl de sang
 Compter les parasites (forme asexuée) pour 500 leucocytes
Nb parasites relevés X 8000
Nb de leucocytes comptés
Nb parasites/µl de sang =

20. Paludisme:diagnostiqueravantdetraiter
Calcul de la densité parasitaire
Sur le frottis mince:
 Compter le nombre d’hématies parasitées dans 100 champs
de bonne qualité sans chevauchement des hématies, sans
espace libre entre les hématies, au niveau de la queue du
frottis
 Estimer le % d’hématies parasitées
 Ramener la densité par µl de sang si nécessaire (Supposer
avoir 5 000 000 d’hématies par µl de sang)

21. Paludisme:diagnostiqueravantdetraiter
Autres méthodes de diagnostic
Biologique du Paludisme

22. Paludisme:diagnostiqueravantdetraiter
Détection des antigènes de plasmodies par immuno-
chromatographique
 migration d’un prélèvement de sang sur une membrane
 Antigènes capturés par des anticorps monoclonaux fixés
sur la membrane
 révélation par de nouveaux anticorps monoclonaux
couplés à un particule colorée révélatrice.
Bandelette réactive

23. Paludisme:diagnostiqueravantdetraiter
Test de Diagnostic Rapide: illustration
(http://www.diamedchina.com)

24. Paludisme:diagnostiqueravantdetraiter
Polymerase Chain Reaction (PCR)
• Amplification d’un segment de l’ADN par la réaction
enzymatique répétée (PCR endpoint ou PCR en temps réel)
Avec besoin en :
• Équipement (thermocycleur …)
• Personnel formé
• …

25. Paludisme:diagnostiqueravantdetraiter
Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR Classique
- Préparation du mix
- Amplification du mix
- Migration sur gel agarose
- Prise en photos du gel
- Interprétation des résultats
suivant la taille des bandes
attendues
PCR en temps réel
(RT-PCR)
- Sonde fluorescente
- Quantification et caractérisation
de l’amplicon formé à chaque
cycle
- Préparation du mix
- Amplification
- Interprétation des résultats
suivant la température de fusion
(http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/principe.htm)
Mangold K. et all,2005. Real time PCR for Detection and Identification of
Plasmodium spp. J. Clin. Microbiol, 5: 2435-2440.

26. Paludisme:diagnostiqueravantdetraiter
Illustration : résultat de diagnostic
d’espèce par PCR classique
M 1 2 3 4 5
100pb
200pb
Légendes: M: marqueur moléculaire, 1: témoin négatif ; 2 et 4: P. falciparum
(176 pb); 3 et 5: P. vivax (120 pb); 5: P. malariae (145 pb); pour P.ovale(780
pb) non figuré.

27. Paludisme:diagnostiqueravantdetraiter Illustration d’un diagnostic d’espèce par
RT-PCR
Courbed’amplification Températuredefusion(°C) Contrôlespositifs
Présente 74,8+/-0,1 P.falciparum
Présente 73,2+/-0,2 Pmalariae
Présente 76,5+/-0,1 P.ovale
Présente 77,7+/-0,2 P.vivax

28. Diagnostic biologique du paludisme
par
Marie-Ange Rason, MD
7ème édition du cours international “Atelier Paludisme”
25 Mars 2009 – Institut Pasteur de Madagascar