Evolution de la résistance de Plasmodium falciparum aux médicaments antipaludiques. Conférence de la 8ème édition du Cours international « Atelier Paludisme » - CLAIN Jérôme

1. évolution de la résistance de Plasmodium falciparum
aux médicaments antipaludiques
jerome.clain@parisdescartes.fr
UMR216 ‘Santé de la mère et de l’enfant face aux infections tropicales’
Institut Pasteur de Madagascar, 29 mars 2011

2. histoire de la résistance aux antipaludiques
ART-T
SE Asia
Ato/Pg-R
travellers
adapted from Ekland & Fidock, 2008

3. principaux gènes de résistance aux médicaments antipaludiques
ART-T
SE Asia
Ato/Pg-R
travellers
• pfcrt (3 SNPs) • pdhfr (3-4 SNPs)
• pfmdr1 (SNPs) • pfmdr1 (CNVs) • pfcytb (1 SNP)
• dhps (1-3 SNPs)
• vacuole digestive • cytoplasme • mitochondrie
• fonction inconnue • synthèse d’ADN • transfert d’e-

4. • comment évoluent les allèles (gènes) de chimiorésistance ?
• combien d’origines de chimiorésistance ?

5. 1- brefs rappels de génétique des populations
2- gène pfdhfr et origine de la résistance à la pyriméthamine
3- gène pfcytb et résistance à la Malarone (atovaquone-proguanil)

6. les 2 échelles de l’évolution
• au sein d’1 espèce • entre plusieurs espèces
• au sein/entre populations • échelle : temps géologiques
• échelle : générations mutation
migration
dérive génétique
sélection naturelle

7. évolution des populations
changement des fréquences alléliques au sein d’une population
N individus diploïdes
2 allèles
0.75 génération 1
0.25
♀ ♂ Évolution si :
• mutation
urne des gamètes
effectifs infinis • migration
2N tirages
• dérive génétique
• sélection naturelle
N individus diploïdes
0.75
0.25
génération 2

8. marqueurs du polymorphisme génétique (1)
SNP : single nucleotide polymorphism
allèle sauvage : 5’-ATAACATGA-3’
allèles mutants :
ATAAAATGA 5’-ATAATATGA-3’ ATAAGATGA
« bénéfique » « délétère »
« neutre »
« avantageux » « désavantageux »
• ~ 1 SNP / 300 pdb
• ~ 100 000 SNPs (objectif : 350 000)
Mu et al. 2006

9. marqueurs moléculaires du polymorphisme (2)
• polymorphismes de séquences répétées en tandem : microsatellites
5’-ATCTAGCACACACACACACACATCCTG-3’ (CA)8
5’-ATCTAGCACACACACACACACACACATCCTG-3’ (CA)10
- très polymorphes : nombreux allèles différents dans une population
- neutres le plus souvent

10. diversité génétique et origine des mutations
: microsatellite
: séquence codante
kb -5.3 -4.4 -0.1
dhfr
(TA)n (TAA)n (CG)n phénotype
13 12 10 sensible
12 7 8 S
10 8 9 S
9 9 9 S
7 7 6 S
8 10 12 S
11 11 11 S

11. apparition d’un allèle de résistance par mutation
: séquences répétées en tandem (microsatellite)
: séquence codante
kb -5.3 -4.4 -0.1
dhfr
(TA)n (TAA)n (CG)n 51 59 108 phénotype
13 12 10 résistant
12 7 8 sensible
10 8 9 S
9 9 9 S
7 7 6 S
8 10 12 S
11 11 11 S

12. sélection de l’allèle de résistance
1. fréquence de l’allèle de résistance  : sélection directionnelle positive
2. effet « auto-stop » ou hitchhiking
3. déséquilibre de liaison 13 12 10
13 12 10
13 12 10
13 12 10
13 12 10 13 12 10
12 7 8 12 7 8
10 8 9 10 8 9
9 9 9 traitement 9 9 9
7 7 6 = 7 7 6
8 10 12 sélection 8 10 12
11 11 11 11 11 11

13. diversité réduite à proximité de l’allèle sélectionné
12 7 8
10 8 9
9 9 9
7 7 6
8 10 12
11 11 11
13 12 10
13 12 10
13 12 10
13 12 10
13 12 10

14. application 1 :
recherche de locus sélectionnés par approche genome-scan
identification du gène pfcrt, déterminant de la résistance à la chloroquine
Réduction de la diversité allélique
chromosomes
parasites résistants à la chloroquine
parasites sensibles à la chloroquine
Wooton 2001, Nature

15. application 2 :
origine de la résistance à la pyrimethamine en Afrique
> base génétique : 3 SNPs dans le gène dihydrofolate reductase
dhfr ts
51 59 108
wild type N C S
triple mutant I R N
> probabilité élevée d’échec thérapeutique
> origine unique en Asie du Sud Est 1978
> triple mutant asiatique importé dans le sud
et l’est de l’Afrique
? généralisation à l’ensemble du continent africain ? 15

16. stratégie
allèles dhfr
• sauvage (WT) n = 75
• triple mutant n = 204
: microsatellite
: séquence codante
dhfr ts
-3.9 -0.1 51 59 108 +0.5 +1.5 kb
WT - - N C S - -
triple mutant - - I R N - -

17. FCM29 -3.9 -0.1 dhfr +0,5 +1,5
-3,9 -0,1 dhfr +0.5 +1.5 -3.9 -0.1 dhfr +0,5 +1,5
-3,9 -0,1 dhfr +0.5 +1.5 -3.9 -0.1 dhfr +0,5 +1,5
-3,9 -0,1 dhfr +0.5 +1.5 -3.9 -0.1 dhfr +0,5 +1,5
-3,9 -0,1 dhfr +0.5 +1.5
FCM29 194 147 IRN 105 202 196 - IRN - - - - IRN - - 185 140 NCS 99 -
ThaïTHAI -
-
-
139
IRN
IRN
-
-
-
-
-
-
150
-
IRN
IRN
-
107
-
-
-
-
-
-
IRN
IRN
-
-
-
-
192
187
166
145
NCS
NCS
99
109
-
-
- - IRN 107 - - - IRN 111 - - - IRN - - 190 127 NCS 93
- - IRN 107 - - - IRN 111 - - - IRN - - 191 127 NCS 109 -
- - IRN 107 - - - IRN - - - - IRN - - 191 136 NCS 107 204
- - IRN 109 - - - IRN - - - - IRN - - 192 127 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 136 NCS 107 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 196 127 NCS 99 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 198 139 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 198 151 NCS 99 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 214 158 NCS 95 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 188 127 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 137 NCS 103 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 206 140 NCS 103 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 206 154 NCS 103 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 224 142 NCS 95
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 187 141 NCS 93 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 191 127 NCS 97 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 191 163 NCS 95 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 197 - NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 200 150 NCS 85 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 202 160 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 204 137 NCS 99 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 206 127 NCS 109 204
- - IRN - - 189 - IRN - - - IRN - - 207 137 NCS 103 -
- - IRN - - - - IRN 103 - - - IRN - - 210 150 NCS 99 204
- - IRN - - - - IRN 103 - - - IRN - - 191 153 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN 95 - 201 127 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 212 146 NCS 97 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 140 NCS 99 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 200 156 NCS 103 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 202 147 NCS 85 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 188 140 NCS 97 204
- - IRN - - - - IRN - - 192 152 IRN 103 204 189 153 NCS 95 -
- - IRN - - - - IRN - - 196 - IRN - - 189 154 NCS 95 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN 107 204 192 135 NCS 97 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 135 NCS 103 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 135 NCS 107 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 135 NCS - 204
- - IRN - - 200 - IRN - - - - IRN - - 192 140 NCS 99 -
- - IRN - - 202 - IRN - - - - IRN - - 192 144 NCS 102 -
- 154 IRN - - - 150 IRN - - - - IRN - - 192 154 NCS 103 204
- 154 IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 - NCS 101
- - IRN 103 - - - IRN - - - - IRN - - 202 139 NCS - 204
- - IRN - 204 - - IRN - - - - IRN - - 202 143 NCS 85 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 204 141 NCS 97 195
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 204 143 NCS - -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 206 139 NCS 103 204
- - IRN - - - - IRN - - 192 - IRN - - 206 146 NCS 99 -
- - IRN 103 - - - IRN - - 202 - IRN - - 206 151 NCS 97 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN 107 - 208 135 NCS 103 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 210 137 NCS 95 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 212 127 NCS 111 205
- - IRN - - 151 IRN - - - - IRN - - - 139 NCS 99 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 187 143 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 188 162 NCS 103 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 144 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 198 140 NCS 99 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 198 149 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 200 144 NCS 85 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 212 149 NCS - -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 214 127 NCS 99 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - - 150 NCS 95 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 190 142 NCS 99 204
- - IRN - - - - IRN - - 191 127 NCS 111 204
resistant wild-type
Maïga, 2007, J Infect Dis

18. application 3 :
origine de la résistance à l’atovaquone + proguanil
(Ato-PG ou Malarone®)
• traitement et prévention des infections à P. falciparum
• Ato : inhibe le complexe mitochondriale : cytochrome bc1
• proguanil (PG) : augmente l’activité de l’atovaquone (Ato)

19. résistance à Ato-PG
• résistance à Ato
- base génétique simple
- 1 SNP mitochondrial : pfcytbY268S/C/N
0 2000 4000 6000 (pb)
cox I cytb
coding
cox III
4294a>c → Tyr268Ser
4294a>g → Tyr268Cys
- sensibilité in vitro à Ato :  x102-103
- perte de la synergie entre Ato et PG synergy
Musset 2007, Microb Inf

20. paradoxe de la résistance à Ato-PG
• traitement cher (35-60 €)
- pas/peu utilisé dans les zones d’endémies
• allèle de résistance pfcytb268 extrêmement rare dans populations naturelles
- donc probablement non transmis par le moustique
• échecs thérapeutiques chez les voyageurs : 0,1 - 1 % !!
- résistance du parasite
- allèle mutant non détecté au début du traitement
? ces échecs sont-ils dus à un seul ou différents allèles de
résistance pfcytb268 ?

21. stratégie expérimentale
échantillon : CNR Paludisme (Paris, France)
• 7 isolats provenant d’échecs thérapeutiques (portant l’allèle mutée pfcytb268)
- Ato-PG (6)
- atovaquone seule (1)
• 28 isolats appariés provenant de succès thérapeutiques par Ato-PG (portant
l’allèle mutée pfcytbY268)
analyses :
• séquençage du génome mitochondrial : analyse de la diversité
moléculaire autour du locus pfcytb268
• génotypage de polymorphes nucléaires (microsatellites)
0 2000 4000 6000 (pb)
cox I cytb
cox III

22. Mitochondrial genome nucleotide position
cox3 cox1 cytb
1 1 1 1 1 2 3 3 4 4 4 4 4 4 5
6 7 7 8 8 1 5 6 7 9 6 1 6 2 3 5 6 7 9 4
8 1 1 6 9 6 0 9 7 1 4 6 1 9 8 5 2 8 5 5
4 0 1 9 1 5 9 4 8 3 9 7 9 6 9 2 4 0 4 4
r r r n n s r i i i s s n n n s s i i r
Haplotype Origin n A - - G T G A G T C C C A A G C A G C -
R1 IVC 1 . - - . . . . . . . . . . G . . . . . -
R2 IVC 1 . - - T . . T . . . . . . C . . . . T T
R3 UPV 1 . - - . . . . . . . . T . C . . . . . -
R4 UPV 1 . - - . . . . . . . . . . G A . . . . -
R5 UPV 1 . - - . . . . . . . . . . C . . . . . -
R6 GUI 1 . - - . . A . T . . . . . C . . G . . -
R7 THA 1 . - - . . . . . C . . . . C . . . . . -
S1 IVC/UPV/GUI 13 . - - . . . . . . . . . . . . . . . . -
S2 IVC/UPV/GUI 9 . - - . . . . A . . . . . . . . . . . -
S3 IVC 1 . - - . . . . C . . . . T . . . . . . -
S4 UPV 1 . - - . C . . A . . . . . . . . . . . -
S5 UPV 1 . - - . . . . A . . T . . . . T . . . -
S6 GUI 1 . - - . . . . A . . . . . . . . . T . -
S7 GUI 1 . A T . . . . A . . . . . . . . . . . -
S8 GUI 1 G - - . . . . . . T . . . . . . . . . -
Musset , Mol Biol Evol 2007

23. relations entre les haplotypes mitochondriaux
minimum-spanning network
R2 R4
R3
R7
R : pfcytbY268C
S1
R : pfcytbY268S R1 R5 S8
S3
S2
• diversité génétique des sauvages et R6
des résistants comparables S4 S6
• pas compatible avec une origine
unique et récente de la résistance
S5 S7

24. variations de séquence avant et après traitement
Ato-PG
D0 Déchéc
(length, bp)
Mitochondrial genome nucleotide position Microsatellite
1 1 1 1 1 2 3 3 4 4 4 4 4 4 5
T T A P T
6 7 7 8 8 1 5 6 7 9 6 1 6 2 3 5 6 7 9 4 A A f A
R
8 1 1 6 9 6 0 9 7 1 4 6 1 9 8 5 2 8 5 5 A A A P A
4 0 1 9 1 5 9 4 8 3 9 7 9 6 9 2 4 0 4 4 8 6 K 8
2
7 0 2 1
Time Hap A - - G T G A G T C C C A A G C A G C -
D22 R4 . - - . . . . . . . . . . G A . . . . - 80 71 98 165 175
D0 . - - . . . . . . . . . . . A . . . . - 80 71 98 165 175
• 5 patients : identité moléculaire parfaite entre D0 et Déchec
• 1 patient : séquence D0 incomplète, identité nucléaire
• 1 patient : D0 non collecté

25. interprétation des données
mutation
~ 105
*
reproduction
*
asexuée
*
traitement ~ 108-1012
*
*
*
*
*
*
*
• mutation se produit et est sélectionnée
chez les patients indépendamment

26. conclusions sur la résistance à Ato-PG
• multiples origines de l’allèle de résistance à Ato-PG
• cas unique : observer en situation naturelle la phase initiale de
l’évolution la résistance, avant la transmission de l’allèle mutant
par le moustique
• Ato-PG non recommandé pour un usage massif en zone
d’endémie

27. évolution de la résistance aux antipaludiques
• origines rares pour SP et CQ (≥ 3 SNPs)
• sélection intense sur les populations
• migrations intra et intercontinentales
• échecs thérapeutiques liés à la transmission de parasites
chimiorésistants
• origines multiples pour Ato-PG
• échecs thérapeutiques liés à la sélection de mutations de
novo (SP, CQ)
• signatures de sélection naturelle peuvent être recherchées
dans les génomes de populations
- diminution de la diversité génétique
- différenciation génétique entre populations

28. UMR216
Collaborateurs
• Pr Jacques Le Bras
• Dr Abdoulaye Djimdé (MRTC, Bamako)
• Dr Oumou Maïga
• Dr Milijaona Randrianarivelojosia (IPM)
• Dr Lise Musset
• Dr JF Lepère (Bandraboua, Mayotte)
• Emmanuelle Renard
• Dr Agnès Aubouy (Gabon)
• Dr Jérôme Clain
• Dr Sabah Omar (Kenya)
CNR Paludisme
• Pr Jacques Le Bras
• Véronique Hubert
• Dr Sandrine Houzé