O documento descreve uma pesquisa que investigou a proteção cruzada obtida em camundongos humanizados CEACAM1 contra Neisseria meningitidis. Os camundongos foram capazes de ser colonizados por diferentes sorotipos de N. meningitidis e produziram anticorpos específicos que forneceram proteção cruzada limitada contra cepas heterólogas.
Proteção cruzada obtida em camundongos humanizados ceacam1
1. PROTEÇÃO CRUZADA OBTIDA EM
CAMUNDONGOS HUMANIZADOS
CEACAM1 CONTRA Neisseria
meningitidis
ANA CLARA BARBOSA ANTONELLI
ANGÉLICA DE LIMA DAS CHAGAS
BRUNA AMANDA DA CRUZ RATTIS
BRUNA LIMA PEROBELLI
CASSIO NAZARENO SILVA DA SILVA
CRIS HANNY PIRES ARAUJO
GISELLA MATTOS DA SILVA WHITE
GUSTAVO DO CARMO LEMES
IGOR DANIEL ALVES RIBEIRO
JOÃO LUCAS LIMA CALANDRINI DE AZEVEDO
JOÃO VICTOR BATALHA DE CARVALHO
2. Introdução
• Uso de modelos animais em pesquisas para o
tratamento de doenças humanas
• ↓utilização de pessoas para testes
• Dificuldade de tratamento -estágio avançado
da doença
3. Camundongos transgênicos
• Organismos artificialmente manipulados
• Introdução, modificação ou deleção de um gene
• Transmitida aos seus descendentes
• Podem ser classificados em diferentes tipos de
animais:
• Transgênicos por adição
• Modelos knockout (gene inativado)
• Modelos knockin (gene previamente modificado ou
substituído)
Introdução
4. Obtenção dos camundongos transgênicos
Ovos fertilizados
Microinjeção em
pronúcleos do DNA
modificado
Transferência de
embriões em fêmeas
pseudográvidas (fêmeas
recipientes)
Análise da atividade da
manipulação do gen nos
embriões
F0
F1
Camundongo selvagem
Teste da atividade de
transmissão e transgênese
T
Através da biopsia se
analisa o DNA para
identificação do animal
transgênico fundador
Fêmea doadora
superovulada
Introdução
BENAVIDES,FernandoJ;GUÉNET,Jean-Louis.ManualdeGenéticadeRoedoresdeLaboratorio,PrincipiosBásicosy
Aplicaciones.(2003).Cap.Latransgénesisylaclonaciónenlosroedoresdelaboratorio,p:227-262.
5. Camundongos humanizados
• Genes humanos
• Resposta imune igual ou muito semelhante a
dos seres humanos
Introdução
Promotor Transgene
Seqüência de secreção
Seqüência do vetor
Marcador
Origem de replicação
8. • Evolui em três etapas: nasofaríngea, septicêmica ou
meningococcêmica e meningítica
• Fase nasofaríngea : pouco sintomática .Os sinais gerais são:
febre, mal-estar, falta de apetite, náuseas e vômitos
• Fase septicêmica ou miningococcêmica: caracteriza-se pelo
aparecimento de febre, calafrios, dores musculares e
toxemia. Geralmente, aparecem lesões cutâneas
purpúricas.
• Fase meningítica: ocorre inflamação das meninges, com
fortes dores de cabeça, dores no pescoço e nas costas,
rigidez na nuca, confusão mental, etc.
Introdução
9. Neisseria meningitidis
• Bactéria
• Diplococo gram-negativo
• Classificada em sorogrupos de acordo com a
reatividade imunológica dos polissacarídeos
presentes na cápsula (A, B, C, Y e W-135)
• Sorogrupos B e C os principais no Brasil
• Compõe a microbiota das vias respiratórias
superiores
• 10% da população em geral carrega essa bactéria
em suas gargantas
Introdução
10. Introdução
• Vacinação – método mais viável
• Dificuldade no tratamento dos pacientes em
estágio avançado
• Portadores do Nme: montam uma boa
resposta imune humoral mas continuam
sendo colonizados
O QUE ESTÁ ACONTECENDO?
11. O QUE ESTÁ ACONTECENDO?
• Objetivos: Investigar as respostas
imunológicas e saídas para esse problema
COMO?
• Uso de camundongo humanizado por
transgenia visando a colonização da
nasofaringe desses animais por Nme cuja
especificidade é dirigida para os humanos
Introdução
12. • Camundongos expressando a molécula de
adesão celular humana -CEACAM1
• Permitiu diferenciar a resposta envolvendo
anticorpos contra as distintas cepas de Nme e
as suas relações com a infecção pela mucosa
nasofaríngea
Introdução
13. Bactérias utilizadas
• 57 isolados de bactérias
• Sendo 43 da espécie Neisseria meningitidis
• 2 Neisseria gonorrhoeae
• 2 Neisseria lactamica
• 1 Neisseria cinerea
• 1 Neisseria flavenscens
• 1 Moraxella catatthalis
• 2 non-typeable Haemophilus influenzae
• 5 Escherichia coli
Materiais e métodos
14. Inóculos obtidos por
ressuspensão das
colônias em 1 ml de
PBS +1 mM MgCl
(PBS/Mg), ajustado
para 107 CFU/mL
Adicionou-se 32
mg/ml da
glicoproteína
"human holo-
transferrin"
Foi inoculado 10 µL (105
CFU) em camundongos
CEACAM1 humanizados de
seis semanas de idade por
via intranasal
*anestésico isoflurano
Materiais e métodos
Infecção intranasal
15. Infecção intranasal
• Monitoramento da resposta imune reinfecção
• Os camundongos receberam uma dose da cepa
de N.meningitidis (6 e 9 semanas de idade)
• Com doze semanas, cada camundongo foi
desafiado com um isolado diferente
• Eutanasiados em câmaras de CO2
Materiais e métodos
16. Coleta dos tecidos da mucosa e
submucosa- procura por N. meningitidis
associado a eles
Lavagem da traqueia com 500 µL de
PBS/Mg - obter o lavado nasal
Esfregaço da mucosa-ressuspendido em
500 µL de PBS/Mg
Materiais e métodos
Infecção intranasal
17. Materiais e métodos
• ELISA com células totais para a detecção de
imunoglobulinas específicas;
• Ensaio de anticorpos bactericidas séricos
(SBA);
• Werstern blotting para detecção da Opa e
PorA e PorB;
18. • Camundongos CEACAM1 humanizados
podem ser colonizados por cepas de
diferentes sorotipos de N. menigitidis ???
Resultados e discussões
19. • Recuperação N. menigitidis viáveis da cavidade nasal de
camundongos humanizados CEACAM1 após 3 dias da
inoculação com cepas de diferentes sorogrupos
Sorogrupo A
Fonte: JOHSWICH et al., 2014
Resultados e discussões
20. Sorogrupo C
Colonização de camundongos humanizados com
cepas de N. menigitidis do sorogrupo C
Fonte: JOHSWICH et al., 2014
Resultados e discussões
22. Western Blot para detecção de proteína OPA em cepas de N.menigitidis.
Fonte: JOHSWICH et al., 2014
Proteína Opa não expressa em B16B6 – Uma cepa que apresentou
baixas taxas de colonização em camundongos CEACAM1 humanizados
23. • Anticorpos produzidos em uma infecção por
determinada cepa de N. menigitidis possui
reação cruzada para demais estirpes ???
Resultados e discussões
24. • determinar a reatividade cruzada de
anticorpos induzidos pelas cepas H44/76 ou
90/18311 para diferentes cepas
• as duas cepas inoculadas para indução de
anticorpos são bastante heterólogas.
Resultados e discussões
25.
26. Demonstra-se que a colonização nasal por N. meningitidis em
camundongos CEACAM1 humanizados induz a produção de
anticorpos ( IgG ) específicos para a cepa inoculada.
Resultados e discussões
27. • Considerando relatos de seu potêncial imunogênico , como é a
expressão de Porinas A e Porinas B nas diferentes cepas de N.
meningitidis ?
Porina B ( Por B) é amplamente expressa em diferentes cepas
A expressão de Porina A ( Por A ) está concentrada entre as
cepas que apresentam maior homologia a H44/76
Fonte: JOHSWICH et al., 2014
Resultados e discussões
28. A proteína Opa é um antígeno importante
para ligação de anticorpos gerados contra
N. meningitidis ?
Fonte: JOHSWICH et al., 2014
Efeito da expressão da proteína Opa e cápsula em reação cruzada
H44/76∆opa :
Cepa modificada para
não expressar a
proteína Opa
MC58∆siaD:
Variedade mutante
para a capsúla
29. • A infecção intranasal de camundongos
humanizados CEACAM1 influencia na
colonização nasal posterior por outras cepas ?
6
Sem.
9
Sem.
Fonte: JOHSWICH et al., 2014
30. Não recuperação de Bactérias após de 3
dias de inoculação em animais
préviamente infectados
Resultados e
discussões
Fonte: JOHSWICH et al., 2014
31. Níveis de anticorpos específicos para cepa
90/18311 durante o curso da infecção
Fonte: JOHSWICH et al., 2014
32. Títulos de anticorpos específicos para diferentes cepas
Resultados e discussões
Fonte: JOHSWICH et al., 2014
33. • Como é a atividade de Anticorpos Bactericidas
Séricos (SBA ) em camundongos infectados
com diferentes cepas ?
• Qual a influência do crescimento bacteriano
em um meio com níveis limitantes de Ferro ?
Resultados e discussões
36. • BENAVIDES, Fernando J; GUÉNET, Jean-Louis. Manual de Genética de Roedores de Laboratorio,
Principios Básicos y Aplicaciones. (2003). Cap. La transgénesis y la clonación en los roedores de
laboratorio, p: 227-262.
• JOHSWICH et al. Sterilizing elicited by Neisseria meningitidis carriage shows broader protection
than predicted by serum antibody cross-reactivity in CEACAM1-humanized mice. Infection and
Immunity. American Society for Microbiology, 2014.
• MCENERY, Regina. Boletim sobre a pesquisa de vacinas contra a aids. VAX, v.10,n. 5, 2012.
• MINISTÉRIO DA SAÚDE. Disponível em: http://portalsaude.saude.gov.br/index. php/o-
ministerio/principal/leia-mais-o-ministerio/659-secretaria-svs/vigilancia-de-a-a-
z/meningites/11336-descricao-da-doenca. Acessado: 16. Nov 2014.
• MORALES, Marcelo M.. Métodos alternativos à utilização de animais em pesquisa científica: mito
ou realidade?. Cienc. Cult., São Paulo, v. 60, n. 2, 2008 . Disponível em:
<http://cienciaecultura.bvs.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0009-
67252008000200015&lng=en&nrm=iso>. Acessado: 16 Nov. 2014.
• NEVES, Silvânia M.P. Manual de Cuidados e Procedimentos com Animais de Laboratório do
Biotério de Produção e Experimentação da FCF-IQ/USP. São Paulo FCF-IQ/USP, 2013.
Referências