2. INTRODUCCIÓN
Las células de Leydig son la principal fuente de andrógenos en el
hombre.
La característica ultraestructural más prominente exhibida por estas
células corresponde a su abundante retículo endoplasmático liso
(REL) y sus numerosas mitocondrias.
La biosíntesis de la testosterona es catalizada por enzimas
localizadas predominantemente en el REL y en el citoplasma
adyacente a éste.
Sin embargo, algunos pasos de la biosíntesis ocurren en la
membrana mitocondrial interna, de ahí su abundancia.
3. El total de células de Leydig en 1g de testículo de rata produce
6,7ng de testosterona/min in vivo.
Si pudiéramos determinar el número de células de Leydig en 1
gramo de testículo de rata, podríamos calcular el promedio de
producción de testosterona por célula.
“X” cantidad de células 1gr de testículo 6,7ng de testosterona/min
“X” células de Leydig 6,7ng de testosterona/min
1 célula de Leydig
“Y” ng de testosterona/min
4. Si se pudiese medir el área de la superficie de las membranas
intracelulares donde ocurre la esteroidogénesis, podría conocerse la
razón promedio de la síntesis de testosterona por unidad de área.
Área total de las superficies esteroidogénicas 1gr de testículo 6,7ng de testosterona/min
Área total de las superficies esteroidogénicas 6,7ng de testosterona/min
1µm2 “X”ng de testosterona/min
Estos valores podrían dar a conocer la eficiencia bioquímica a nivel de membranas
5. PROBLEMA
Varios trabajos se habían publicado hasta ese entonces, los que
trataban la morfometría testicular en variados aspectos.
Sin embargo, hacía falta un estudio morfométrico más amplio respecto
a las células de Leydig en el testículo normal.
Anteriormente, ya se habían realizado estudios en testículos extraídos
de ratas con tratamiento hormonal haciendo estimaciones por
morfometría.
Sin embargo, las estimaciones se realizaron con un método de
preservación de tejidos de inferior calidad al que se propone a través de
este trabajo.
6. OBJETIVO
Obtener información cuantitativa respecto a las
células de Leydig y sus organelos que pueda ser
correlacionada con la información bioquímica y
fisiológica disponible.
Mejorar los protocolos de preservación de los tejidos
para obtener un análisis morfométrico más preciso.
8. 4 ratas adultas Sprague-Dowley de
pesos 255g, 265g, 345g y 365g
Inyección intraperitoneal de Trypan
Blue 3% dos días antes de
sacrificarlos
Sacrifican ratas
Fijación por perfusión de los testículos de la rata
Glutaraldehido al 3% tamponado con 0,1M Scolidina.
9. Se seccionan los testículos
perpendicularmente al eje mayor
10 trozos de un testículo. 5 trozos
para cada tipo de estudio.
Microscopía
de Luz
Deshidratación con etanoles ascendentes
Inclusión Glicol-Metacrilato
Cortes de 2µm
Tinción Fucsina básica-Azul de toluidina
Contratinción con H. Weigert
Microscopía
electrónica
Post-fijación con OsO4 2% sin tamponar
Inmersión solución de Ferrocianuro 1,5%
Deshidratación con etanoles ascendentes
Impregnación e inclusión en Epon 812
Cortes 500-900A
Contraste con acetato de Uranilo 2% y
Citrato de plomo
10. Corte de testículo de rata. ST: túbulo seminínero; BV: vasos sanguíneos. Barra: 100 μm. 84x
15. MORFOMETRÍA
El uso de métodos cuantitativos a microscopía de luz y
electrónica (llamados morfométricos o estereológicos) permiten
la evaluación de estructuras en tres dimensiones a partir de
imágenes bidimensionales
17. MICROSCOPÍA DE LUZ
Para la estimación de la densidad volumétrica de los túbulos seminíferos y
del tejido intersticial, se estudiaron cinco cortes por animal con una
cuadrícula de 441 puntos.
La densidad volumétrica de una estructura X se estima como
(La suma de los puntos que están sobre la estructura X)
(Totalidad de los puntos sobre una entidad a elección que contenga a la
estructura X)
18. El Volumen de la cápsula testicular se calculó como
(Ancho medio de la cápsula del testículo) x (Área de superficie del testículo)
19. El conteo para determinar la densidad volumétrica de
las células de Leydig, fue hecho con una lente objetiva
de 40x y una cuadrícula de 441 puntos.
23. El calculo de la densidad numérica por la ecuación de
Floderus es preciso solo si los núcleos son esféricos.
En este estudio se observaron núcleos elipsoidales. Sin embargo,
el error que puede causar esta característica no es lo
suficientemente significativo y puede obviarse.
25. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
Debido a que las células de Leydig se encuentran dispersas en el
tejido y solo representan el 2,7% del área del corte, no fue
práctico realizar evaluaciones al azar.
Debido a lo anterior, se hizo cortes consecutivos y se montaron
en una misma grilla.
Los autores se aseguraron de que la misma célula de Leydig no
estuviese en más de una sola microfotografía.
26. 4 ratas adultos Sprague-Dowley
10
bloques
x3
3 ratas
1 rata
20
bloques
x1
Microfotografías
10.800X
72.000X
Densidad volumétrica de organelos
Densidad superficial de organelos
Densidad superficial de membrana
plasmática de células de Leydig
Proveer información adicional de
densidad volumétrica de organelos para
su comparación
30. Cálculo de la densidad de superficie (Sv)
Número de intersecciones para el organelo
PT Número de puntos al final de las líneas que caen en la célula de
Leydig
l
31.
32. Anteriormente habíamos calculado la densidad volumétrica de la célula
de Leydig en el tejido testicular.
Ahora podemos relacionarla con la Sv multiplicándolas para obtener la
densidad de superficie de la mitocondria por volumen de tejido
testicular.
34. Microfotografías en cortes de 0,5 μm de grosor indicaron que las
mitocondrias de las células de Leydig son en su mayoría cilíndricas
y con sus dos extremos hemisféricos.
Para encontrar el número promedio de mitocondrias por
célula, el volumen total de mitocondrias por célula es dividido por el
volumen promedio de una sola mitocondria
La multiplicación del promedio de mitocondrias por célula y la
densidad numérica de células de Leydig es igual a la densidad
numérica de mitocondrias.
36. FACTORES DETERMINANTES
Fijación
Deshidratación e inclusión
Corte
Distorsión óptica
Papel de impresión
Efectos del espesor de corte
Tamaño y localización de la muestra
38. DESHIDRATACIÓN E INCLUSIÓN
Volumen incrementado en un
20,1% después de la fijación
por perfusión.
Área incrementada en un 9,6%
después del corte
§ Factores de corrección fueron
aplicados solo a la densidad
superficial y diámetro de
estructuras
MO
Reducción
MET
22,2%
11,4%
40. DISTORSIÓN ÓPTICA Y PAPEL
Distorsión óptica despreciable.
Papel produce un aumento del área en un 2,2%
41. ESPESOR DEL CORTE
Las ecuaciones de morfometría utilizadas en este estudio son estrictamente precisas
sólo para cortes infinitamente finos
Debido a que los cortes para MET tienen un espesor finito, los volúmenes y áreas
superficiales tienden a ser sobreestimados
Weibel y Paumgartner proporcionaron métodos para obtener factores de corrección
apropiados dependiendo del tamaño y la forma de las estructuras y el espesor
de corte
Estos métodos fueron aplicados para obtener factores de corrección para las
densidades volumétricas y superficiales de organelos de las preparaciones
de MET y para la densidad volumétrica de los núcleos vistos a MO
44. Célula de Leydig
Volumen
Área superficial
1209 μm3
1517 μm2
Núcleo (elipsoidal) de célula de Leydig
Razón axial
Diámetro
promedio
Área superficial
1,37
6,34 μ
149 μm2
45. REL es el organelo más abundante de la célula de Leydig
REL tiene 6,9 veces más área superficial que la membrana plasmática
y constituye aproximadamente el 60% del área de superficie total de
la célula de Leydig
El complejo de Golgi fue incluido en el conteo del REL por no ser un
organelo abundante y ser a veces, muy difícil diferenciarlo del REL
REL es muy poco abundante y casi indistinguible
46. En una célula de Leydig promedio, hubo aproximadamente
622 mitocondrias
Representa el 0,3% del volumen testicular, lo cual significa que en
1 g de testículo podría haber 3 mg de mitocondrias de células de
Leydig
La membrana interna (sitios donde residen las principales
enzimas de la biosíntesis de esteroides) tiene una superficie
1,8 veces más grande que la membrana externa, pero esta
superficie es menor que la del SER en un factor de 3,6.
47. En una célula de Leydig promedio hay aproximadamente 312
peroxisomas ocupando un volumen celular de 1,2%
El citoplasma constituye del 61,9-70,6% del volumen
citoplasmático. Contiene ribosomas libres y polisomas,
microfilamentos, microtúbulos, y otros componentes
citoplasmáticos
