Este documento describe un estudio que utilizó la prueba de Ames para detectar agentes mutagénicos en el agua del río Cauca en Cali, Colombia. La investigación encontró altos niveles de mutagénesis en muestras tomadas cerca de un puente, niveles medios cerca de una planta de tratamiento de agua, y ninguna mutagénesis en muestras tomadas fuera de la ciudad. Esto indica que los vertidos de aguas residuales domésticas son responsables de la mutagénesis detectada

1. DETECCIÓN DE AGENTES MUTAGÉNICOS
MEDIANTE EL TEST DE AMES EN AGUAS DEL
RÍO CAUCA EN EL MUNICIPIO DE CALI
Godfrey Idrobo Libreros
Universidad del Valle

2. Introducción
Daño genético
Santella, R. 2006. Curso teórico práctico Genoma y daño. UDEA Hoyos L. E. 2006. Curso teórico práctico Genoma y daño. UDEA

3. Introducción
Sistemas para el análisis y detección de mutagénesis
Escherichia coli, Salmonella typhimurium y sus fagos:
Fuentes de importantes paradigmas para investigación: como los
genomas reparados, replicados, para elucidar la forma en la que los
agentes mutagénicos dañan el DNA y comprender la respuesta celular
frente al daño.

4. Introducción
Contaminación de aguas superficiales
RIOS

5. Métodos
Puntos de muestreo

6. Métodos
Puntos de muestreo

7. Métodos
Toma , extracción, elusión y concentración de
muestras por rotoevaporación

8. Métodos
Toma , extracción, elusión y concentración de
muestras por rotoevaporación

9. Métodos
Test de ames mediante cepas TA98 sin activación
metabólica

10. Métodos
Test de ames mediante cepas TA98 sin activación
metabólica

11. Métodos
Test de ames mediante cepas TA98 sin activación
metabólica

12. Métodos
Confirmación genotípica de cepas bacterianas TA98 y
TA100 derivadas de Salmonella typhimurium LT12
La ruta de biosíntesis de la histidina a sido recientemente encontrada en bacteria,
archaebacteria, fungi y plantas esta convierte el:
5-fosforibosil 1-pirofosfato L-histidina
La ruta a provisto: 1. El paradigma del operon 2. regulación transcripcional de la
expresión génica y inhibición de la ruta metabólica por feedback.

13. Confirmación del requerimiento de His por las
cepas TA98 y TA100
La mutación hisD3052 de la cepa TA98 es
del tipo frameshift (-1) lo cual afecta el
marco de lectura de la secuencia repetitiva
cercana –C–G–C–G–C–G–C–G–
L-histidinol + 2 NAD(+) <=> L-histidina + 2 NADH
La mutación hisG46 en TA100 resulta de la
sustitución de una leucina (GAG/CTC) por
prolina (GGG/CCC). Esta mutación es
revertida a estado silvestre por mutágenos
que causan sustitución de pares de bases,
mutaciones principalmente a uno de los
pares GC.
Método:
Siembra en agar mínimo con trazas de histidina
L-histidinol + 2 NAD(+) L-histidina + 2 NADH

14. Presencia del plásmido pKM101
R46 pKM101 34.5 Kb
Conjugativo
Gen bla codifica para una β-
lactamasa (resistencia derivados de
penicilina como ampicilina )
Método: siembra y selección con
ampicilina en caja.
Walker et al. 1982. Nature 300, 278 - 281

15. Presencia de la mutación uvrB-Bio
Sensibilidad a luz UV
La deleción uvrB elimina el
mecanismo de reparación por
escisión, por esto muchas
lesiones del DNA son reparadas
por error-prone DNA repair
mechanism. Las cepas se
tornan dependientes de biotina.
Método: irradiación con luz UV
(15 W x 8 seg a 33 cm)
Walker et al. 2006. FEBS Letters 580 6423–6427

16. Presencia de la mutación rfa-
Perdida parcial de
lipopolisacárido (LPS).
Método: siembra y tratamiento
con discos de papel filtro
estériles impregnados con
cristal violeta (1 mg/mL).
Interpretación: sensibilidad a CV
manifiesta por un halo de
inhibición.

17. Determinación de la reversión espontánea
His- His+
Concentración ensayada
Revertantesporplaca

18. Criterio de inclusión
 Test de Ames debe dar positivo en dos ensayos
 El valor de mutagénesis debe ser mayor a dos (2) y/o el análisis
estadístico debe confirmarlo
 Debe haber respuesta a dosis
 Todas las marcas génicas deben estar presentes en las cepas
 Las muestras deben ser estériles
 Los controles positivos deben pasar las bacterias de la condición
auxotrotrofa a prototrofa

19. Resultados
Godfrey Idrobo et al. 2007. VII Congreso latinoamericano de mutagénesis,
carcinogénesis y teratogénesis ambiental. Cartagena-Colombia
Determinación de la Dosis
0
50
100
150
200
250
300
350
0 10 20 30 40 50 60
Concentración por placa (µl)
Frecuenciaderevertantes

20. Resultados
Respuesta a Dosis Punto 3
R2
= 0,986
0
50
100
150
200
250
300
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0
Concentración por placa (µl)Frecuenciaderevertantes
Godfrey Idrobo et al. 2007. VII Congreso latinoamericano de mutagénesis,
carcinogénesis y teratogénesis ambiental. Cartagena-Colombia

21. Resultados
Godfrey Idrobo et al. 2007. VII Congreso latinoamericano de mutagénesis,
carcinogénesis y teratogénesis ambiental. Cartagena-Colombia
IM= 1.8 IM= 1.4-4.1 IM= 3.2-8.0

22. Discusión
 El agua del río Cauca a la altura del puente de Juanchito (P3 - N 3° 27´
14,58´´, W 76° 28´ 45,45´´) para las muestras colectadas presentó respuesta
mutagénica alta, en tres de tres dosis evaluadas (IM 3.2-8.0). El agua de la
muestra evaluada a la altura de la PTAP de Puerto Mallarino (P2 - N 3° 26´
54,44´´, W 76° 28´ 42,9´´.) presentó mutagénicidad media respecto a P3.
 Entretanto a las afueras de Cali en el Hormiguero (P1 N 3° 18´ 09,2´´, W 76°
28´ 50,8´´) no se evidencia la presencia de compuestos con capacidad
mutagénica o citotóxica (ver figura 2). Los resultados preeliminares indican que
en las mezclas complejas obtenidas en los puntos P2 y P3 (figura 3) existen
compuestos con capacidad de generar mutaciones que cambian el marco de
lectura del gen afectado, constituyendo un riesgo potencial para las especies
presentes en el río y que consumen el agua del mismo.

23. Conclusiones
 En el río Cauca a altura de la PTAP de Puerto Mallarino existen
compuestos contaminantes con actividad mutagénica (producen
sustitución de un (1) par de nucleótidos).
 La alta mutagénicidad a la altura de Juanchito (P3) e inferior en la PTAP
de Puerto Mallarino (P2) indica que el vertimiento de aguas residuales
domesticas es el responsable.
 En el agua del río Cauca a la altura de el puente Hormiguero en las
afueras de Cali no se evidencia mutagénicidad en las muestras tomadas.

24. Perspectivas
Se requiere:
 ¿Con S9 persiste mutagenicidad? Realizar el test con activador enzimático para
determinar si se pierde, persiste u ocurre activación metabólica que magnifique la mutagénicidad.
 ¿Hay compuestos capaces de generar sustitución de pares de base?
Realizar el test con la cepa TA100 para detectar compuestos con capacidad de producir mutaciones
tipo frameshifts.
 ¿El agua de la PTAP tratada y sin tratar contiene mutágenos? Estudiar el
agua que entra a la PTAP-PM para confirmar si tiene actividad mutagénica y si una vez tratada los
compuestos mutagénicos persisten.
 ¿Qué genera la mutagenicidad del Río? Estudiar cual es el aporte individual de cada
uno de los vertimientos a la carga mutagénica total del río Cauca.
 ¿Los mutágenos están afectando la biota? Estudios tendientes a determinar si existe
efectos mutagénicos sobre la biota del Río.
 ¿Cuáles son los compuestos responsables de la mutagénesis? Determinar
que compuestos orgánicos son los principales responsables de la mutagenicidad observada

25. A los compañeros del laboratorio de
Electroquímica y de
de los grupos BIOMIC y GETEG.
a la CVC y especialmente a la Patrulla Fluvial
del río Cauca y a Colciencias por la financiación
de este proyecto.
Agradecimientos

26. Godfrey Idrobo Libreros1, Alejandro Soto2, Enrique Bravo1, Fernando Larmat1, Neyla Benítez1
1. Universidad del Valle, Grupo de Microbiología y Biotecnología Ambiental y
Grupo de Electroquímica
2. Universidad Autónoma de Occidente, Grupo de Estudios Ambientales para el Desarrollo Sostenible